劉 魁，楊亞麗，楊繼周，王正旭，田陽陽，楊博凱， 嚴(yán) 杰，吳 昊，趙文軍*

(1.紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100；2.玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100；3.云南省煙草公司玉溪市公司，云南 玉溪 653100)

【研究意義】土壤是烤煙賴以生長的環(huán)境基礎(chǔ)，而土壤微生物是土壤中的重要組成成分，參與土壤生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換，是衡量土壤健康狀況及生產(chǎn)力的重要指標(biāo)之一[1]。但目前由于烤煙生產(chǎn)上化肥的長期大量施用，造成植煙土壤板結(jié)，微生物群落結(jié)構(gòu)改變，養(yǎng)分利用率不高，限制了煙葉質(zhì)量的提升[2]，特別是長期種植蔬菜作為烤煙前茬作物的田煙區(qū)域，土壤處于亞健康狀態(tài)，養(yǎng)分含量偏高，酶活性和微生物數(shù)量下降，病害加重[3]。因此，蔬菜接茬煙田土壤的修復(fù)是十分必要的。施用有機(jī)肥是目前常用的土壤改良措施之一，有利于增加土壤微生物數(shù)量及其代謝活性，改善土壤健康水平[4]。因此，研究有機(jī)肥與化肥配施對田煙土壤微生物區(qū)系的影響，對煙區(qū)土壤改良及可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，關(guān)于有機(jī)無機(jī)肥配施對田煙土壤微生物的影響，前人已做了大量研究。張曉海等[5]研究表明，施用菜籽餅有利于增加田煙土壤細(xì)菌數(shù)量，提高了烤煙生長中后期根際解磷細(xì)菌和解鉀細(xì)菌的數(shù)量；彭智良等[6]施用餅肥和腐殖酸有利于提高煙田土壤細(xì)菌數(shù)量及生育中后期放線菌數(shù)量；王彥錕等[7]連續(xù)3年施用有機(jī)肥明顯提高了黃壤煙田土壤微生物碳氮、微生物熵及微生物呼吸強(qiáng)度?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前田煙生產(chǎn)上有機(jī)無機(jī)肥配施效果的研究多側(cè)重于土壤養(yǎng)分、土壤微生物數(shù)量及煙葉質(zhì)量的影響，而對田煙根際土壤微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)組成研究報(bào)道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以烤煙前茬長期種植蔬菜的田煙土壤為對象，利用高通量測序平臺研究等氮條件下化肥減量配施有機(jī)肥對根際土壤細(xì)菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)組成的影響，以期為改良煙區(qū)土壤環(huán)境提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地土壤狀況及試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年在云南省玉溪市江川縣前衛(wèi)鎮(zhèn)周官村進(jìn)行，試驗(yàn)土壤pH 6.6，有機(jī)質(zhì)含量為27.3 g/kg，全氮含量為2.1 g/kg，水解性氮含量為182.2 mg/kg，速效鉀含量為421 mg/kg，有效磷含量為105.2 mg/kg，土地類型為田煙，烤煙前茬作物為蔬菜。供試化肥為煙草專用復(fù)合肥，N∶P∶K=12∶6∶24；供試有機(jī)肥理化性質(zhì)為pH 5.9，有機(jī)質(zhì)90.8%，全氮0.90%，碳氮比58.5。供試烤煙品種為K326。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照有機(jī)肥與化肥氮含量在總施氮量中的占比折算各肥料施用量，確保各處理總氮用量相等，均為54 kg/hm2。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理：CK(100%化肥N)；T1(20%有機(jī)肥N+80%化肥N)；T2(40%有機(jī)肥N+60%化肥N)；T3(60%有機(jī)肥N+40%化肥N)。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，12個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為50 m2，設(shè)置保護(hù)行，行株距為1.20 m×0.50 m。每個(gè)處理有機(jī)肥均做基肥拌塘施用，其他田間栽培技術(shù)按2019年玉溪市煙葉標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)方案執(zhí)行。

1.3 樣品采集

烤煙移栽后55 d，每個(gè)處理隨機(jī)挖出10株健壯無病煙株根系，抖掉煙株根系附近較大土壤團(tuán)塊并收集附著在根系表面的土壤，混合為1個(gè)樣品，過20目篩，去除根、動物殘骸以及其他雜質(zhì)后裝入無菌離心管，置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存，待測。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤酶活性的測定 參照關(guān)松蔭[8]的方法測定烤煙根際土壤樣品中過氧化氫酶、蔗糖酶及脲酶活性。

1.4.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增 用MO-BIO PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒提取各處理土壤樣品DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定后回收進(jìn)行上機(jī)測序。PCR擴(kuò)增引物序列為細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)特異引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，測序系統(tǒng)采用Thermofisher公司的Ion S5TMXL測序平臺，測序公司為北京諾禾致源科技股份有限公司。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理與分析 使用FLASH v1.2.7[9]軟件對每個(gè)樣本截去標(biāo)簽序列和引物序列的reads進(jìn)行拼接，經(jīng)嚴(yán)格過濾[10]后去除嵌合體序列得到最終有效序列，在97%相似性水平上使用Uparse v7.0.1001軟件將全部有效序列聚類成OTUs，即操作分類單元。用Mothur方法與SILVA的數(shù)據(jù)庫[11]進(jìn)行物種注釋分析，并統(tǒng)計(jì)在各個(gè)分類水平上的土壤樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。最后以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理后分析數(shù)據(jù)。使用Qiimev1.9.1軟件計(jì)算Shannon、Chao1、ace等α多樣性指數(shù)及Unifrac距離，構(gòu)建UPGMA樣品聚類樹，使用Rv2.15.3軟件繪制稀釋性曲線、PCA圖，使用Microsoft excel 365繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對田煙根際土壤酶活性的影響

由表1可知，根際土壤過氧化氫酶活性T1處理顯著低于CK，T2、T3處理與CK無顯著差異(P>0.05)。脲酶和蔗糖酶活性T1處理與CK無顯著差異(P>0.05)，T2和T3處理顯著高于CK和T1處理(P<0.05)?？梢姡琓2、T3處理有利于提高田煙根際土壤脲酶和蔗糖酶活性。

2.2 田煙根際土壤細(xì)菌群落α多樣性分析

4個(gè)處理土壤樣本經(jīng)測序并去除嵌合體后共獲得有效序列237 913條，按97%一致性共聚類為5719個(gè)OTUs，注釋到3界42門53綱124目245科569屬405種(含未明確細(xì)菌)。由表2可知，樣品測序深度系數(shù)Goodscoverage為99.35%～99.72%，表明各土壤樣品文庫均涵蓋了99.35%以上的細(xì)菌類群，能夠反映出土壤樣本中真實(shí)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及分布特征。各處理OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ace指數(shù)均表現(xiàn)為T1>T2>CK>T3?？梢?，T1、T2處理有利于提高田煙根際土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度。

2.3 田煙根際土壤細(xì)菌群落在門水平上的結(jié)構(gòu)組成分析

對不同處理根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌門的分析表明(圖1)，排名前10的優(yōu)勢細(xì)菌門分別為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、未明確細(xì)菌(unidentified Bacteria)，總的相對豐度達(dá)到95.24%～97.91%，基本反映各樣品中細(xì)菌群落組成情況。其中，變形菌門相對豐度隨著有機(jī)肥N用量的增加呈增加趨勢，CK、T1、T2、T3處理相對豐度依次為41.94%、48.49%、49.06%、54.69%；放線菌門和厚壁菌門相對豐度以T2處理最高；酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、浮霉菌門和疣微菌門相對豐度以T1處理最高，但是各處理擬桿菌門相對豐度較CK均有所降低。

2.4 田煙根際土壤細(xì)菌群落在屬水平上的結(jié)構(gòu)組成分析

優(yōu)勢細(xì)菌屬排名前10的相對豐度見圖2。羅思河小桿菌屬(Rhodanobacter)、Dyella屬、unidentifiedGammaproteobacteria屬及卡斯特蘭尼氏菌屬(Castellaniella)相對豐度均表現(xiàn)為T3>T2>T1>CK；鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、鞘脂菌屬(Sphingobium)相對豐度均隨有機(jī)肥用量的增加呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，以T2處理最高；Salinimicrobium屬和Pontibacter屬相對豐度T1、T2、T3處理較CK均有所下降；類諾卡氏屬(Nocardioides)除T2處理高于CK外，其余處理均有所降低。

2.5 田煙根際土壤細(xì)菌群落相似性分析

田煙根際土壤細(xì)菌群落組成及相對豐度不同處理的主坐標(biāo)分析結(jié)果見圖3。對樣本差異的貢獻(xiàn)值第一主成分為46.79%，第二主成分為37.92%，合計(jì)貢獻(xiàn)值為84.71%。從樣品分布來看，T1和T2處理處于坐標(biāo)系第三象限，CK、T3處理分別處于坐標(biāo)系第四、第一象限，其中T2處理與CK距離最遠(yuǎn)，表明化肥減量配施有機(jī)肥能改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。UPGMA聚類結(jié)果表明(圖4)，T1與T2處理聚為一類，T3與CK分別各為一類，說明T1與T2細(xì)菌群落豐度相似性較高。顯示，化肥減量配施有機(jī)肥后，田煙根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成較單施化肥均發(fā)生了明顯變化，其中以化肥減量配施40%有機(jī)肥對田煙根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響最大。

表1 不同處理對烤煙根際土壤酶活性的影響

表2 烤煙根際土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)

圖1 門水平上烤煙根際土壤主要優(yōu)勢細(xì)菌及其相對豐度Fig.1 Main dominant bacteria and their relative abundance in tobacco rhizosphere soil at pyhlum level

圖2 屬水平上烤煙根際土壤主要優(yōu)勢細(xì)菌及其相對豐度Fig.2 Main dominant bacteria and their relative abundance in tobacco rhizosphere soil at genus level

圖3 烤煙根際土壤細(xì)菌群落的PCoA分析Fig.3 PCoA analysis of bacterial community in tobacco rhizosphere soil

3 討 論

3.1 不同處理對田煙根際土壤酶活性的影響

土壤酶活性是反映土壤肥力的重要指標(biāo)，與微生物共同推動著土壤的代謝活動，參與土壤中多種生物化學(xué)過程和物質(zhì)循環(huán)[12]。張長華等[13]研究表明，有機(jī)無機(jī)肥配施可顯著提高植煙土壤脲酶和蔗糖酶活性。通過試驗(yàn)，化肥減量配施40%～60%有機(jī)肥可顯著提高田煙根際土壤脲酶和蔗糖酶活性，這是因?yàn)橛袡C(jī)肥的施入增加了土壤中有機(jī)氮和有機(jī)碳含量，從而促進(jìn)了酶促反應(yīng)來調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分。

圖4 烤煙根際土壤細(xì)菌群落在門水平上的UPGMA聚類分析Fig.4 UPGMA cluster analysis of bacterial community in tobacco rhizosphere soil at phylum level

3.2 不同處理對田煙根際土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)的影響

在微生物多樣性研究中，Shannon指數(shù)越大，微生物群落均勻度越高；Chao1和ace指數(shù)越大，微生物群落的豐富度越高[14]。研究結(jié)果表明，Shannon、Chao1和ace等多樣性指數(shù)均隨著有機(jī)肥施用量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢，劉昌等[15]研究也有類似結(jié)果。這種趨勢符合“connell中度干擾假說”，即生態(tài)系統(tǒng)處于中等程度干擾時(shí)，物種生存機(jī)會最多，群落多樣性最高[16]。

3.3 不同處理對田煙根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌門群落多樣性的影響

通過研究，變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、酸桿菌門及芽單胞菌門為主要優(yōu)勢細(xì)菌門類，韋俊等[17]研究也有類似結(jié)果。不同處理根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌門相對豐度有所差異，這是有機(jī)肥不同用量對土壤理化性質(zhì)造成的影響差異所致，土壤理化性質(zhì)是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的重要驅(qū)動力[18]。各處理土壤中變形菌門相對豐度最高，且隨著有機(jī)肥用量的增加呈增加趨勢，馬曉英等[19]研究也有相同結(jié)果?？梢姡寥乐杏袡C(jī)物質(zhì)的增加有利于提高變形菌門的相對豐度。這是由于變形菌門許多細(xì)菌具有共生性，并與土壤中有機(jī)物質(zhì)密切相關(guān)，傾向生長于營養(yǎng)豐富的土壤中[20]，而有機(jī)物質(zhì)的輸入為變形菌門中異養(yǎng)型微生物提供了碳源，促進(jìn)了該類細(xì)菌的生長繁殖。

3.4 不同處理對田煙根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌屬群落多樣性的影響

微生物在土壤碳氮循環(huán)及土壤修復(fù)等方面具有十分重要的作用。如Rhodanobacter屬對氮代謝具有重要作用[21]，Dyella屬可用于聯(lián)苯污染土壤的生物修復(fù)[22]，Sphingomonas屬具有降解芳香化合物和固氮功能[23]?；蕼p量配施有機(jī)肥處理較單施化肥均提高了田煙根際土壤中Rhodanobacter屬、Dyella屬及Sphingomonas屬細(xì)菌相對豐度。顯示，化肥減量配施有機(jī)肥能夠提高某些特定微生物的相對豐度。Rhodanobacter屬相對豐度的變化是由于有機(jī)肥(pH=5.9)的酸性特點(diǎn)促進(jìn)了該類細(xì)菌在土壤中的富集，王曉彤等[24]研究認(rèn)為，Rhodanobacter屬細(xì)菌為耐酸菌，隨著pH降低其相對豐度逐漸增加。Sphingomonas屬細(xì)菌相對豐度的增加是由于該類細(xì)菌生長可利用芳香族化合物進(jìn)行生長繁殖，而有機(jī)物質(zhì)的輸入有利于提高根際土壤芳香族化合物的含量[25]。對dyella屬的研究目前多是分離鑒定和功能性的研究，其影響因素及機(jī)理尚待探討[22]。

研究發(fā)現(xiàn)一類與土壤鹽漬化相關(guān)的細(xì)菌屬類，如Salinimicrobium屬和Pontibacter屬，這是由于烤煙和前茬作物長期大量施用化肥以及試驗(yàn)區(qū)近幾年的干旱天氣導(dǎo)致易溶性鹽分在土壤中積累，進(jìn)而促進(jìn)耐鹽性細(xì)菌的繁殖生長。Salinimicrobium屬和Pontibacter屬為嗜鹽性細(xì)菌，土壤中相對較高的含鹽量利于該類細(xì)菌的生長繁殖[26-27]。有研究顯示施用有機(jī)肥處理Salinimicrobium屬和Pontibacter屬相對豐度均低于單施化肥處理，李玉等[28]利用有機(jī)肥替代部分化肥對濱海鹽堿地土壤改良的研究也有類似結(jié)果。有研究表明施用有機(jī)肥卡斯特蘭尼氏菌屬的相對豐度均高于單施化肥處理，而該細(xì)菌屬具有通過脫氮功能修復(fù)鹽漬化土壤的功能[29]?？梢?，化肥減量配施有機(jī)肥有利于修復(fù)鹽漬化土壤，改善土壤健康狀況。

4 結(jié) 論

在等氮條件下，化肥減量配施有機(jī)肥有利于提高田煙根際土壤酶活性及細(xì)菌群落多樣性，改善細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，其中以化肥減量配施40%有機(jī)肥表現(xiàn)更優(yōu)。