彭成彬，陳美霞，魏日鳳，孫 云，張承康，劉 偉

( 1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100)

【研究意義】茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]原產(chǎn)于中國(guó)，為多年生常綠木本植物，多分布于亞熱帶和熱帶地區(qū)[1]。福建茶葉面積和產(chǎn)量都位居全國(guó)前茅，茶產(chǎn)業(yè)是福建省的支柱型產(chǎn)業(yè)，也是增加農(nóng)民收入和促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展重要手段[2]。近年來(lái)福建茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)?？焖?，大面積的種植導(dǎo)致炭疽病日益嚴(yán)重，由于管理不當(dāng)導(dǎo)致病害頻發(fā)，使茶葉產(chǎn)量下降，影響茶葉品質(zhì)，制約茶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】炭疽菌屬(Colletotrichumspp.)是世界上被認(rèn)為十大重要病原菌之一，能在全球范圍內(nèi)危害眾多單雙子葉植物[3]，由于炭疽菌屬的寄主非常廣泛，茶樹(shù)膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides) 是造成茶樹(shù)炭疽病害的主要病原菌之一，該致病菌侵染茶樹(shù)嫩葉、新梢、茶樹(shù)花和茶樹(shù)果實(shí)等部位，發(fā)病前期葉片表面出現(xiàn)褐色小斑點(diǎn)，后期葉片表面形成枯死斑，使茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴(yán)重導(dǎo)致茶樹(shù)致死，隨著各茶園栽培面積的增加，不恰當(dāng)?shù)墓芾?，農(nóng)藥的濫用勢(shì)必導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化，加之夏季空氣潮濕，溫度高，促使茶樹(shù)炭疽病害大面積爆發(fā)。造成經(jīng)濟(jì)損失[4-7]。炭疽菌屬種與亞種之間的差異越來(lái)越小，僅靠形態(tài)學(xué)鑒定菌株是不準(zhǔn)確的，同時(shí)分析菌株基因型和表現(xiàn)型，鑒定快速、結(jié)果準(zhǔn)確。核糖體DNA是一段重復(fù)的序列，由非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和3種RNA(18S RNA、28S RNA、5.8S RNA)基因編碼組成。因其具有良好的同質(zhì)性，在細(xì)胞中以一種協(xié)同方式進(jìn)化，可以揭示菌株DNA遺傳本質(zhì)，適合于所有菌株基于了ITS(Internal Transcribed Spacer，ITS)標(biāo)記，被國(guó)內(nèi)外研究者作為真菌通用DNA條形碼[4,6]。綠色熒光蛋白基因(Green fluorescent protein)GFP標(biāo)記能在具有生命特征的寄主里表達(dá)形成生物發(fā)光蛋白，不傷害活細(xì)胞，熒光信號(hào)在激光共聚焦顯微鏡下，檢測(cè)到光源單一和穩(wěn)定[8]。諸多研究者將不同絲狀真菌進(jìn)行GFP標(biāo)記后，探究其侵染機(jī)制，諸如：香蕉枯萎病(Fusariumoxysporum)[9]、芒果畸形病(F.proliferatum)[10]、小麥根腐病(Bipolarissorokiniana)[11]、棗黑斑病(Alternariaalternata)[12]、水稻稻瘟病(Magnaportheoryzae)[13]等。GFP標(biāo)記基因作為一種報(bào)告基因被廣泛應(yīng)用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】現(xiàn)有研究表明不同地區(qū)茶樹(shù)炭疽病主要病原菌不同，炭疽菌對(duì)不同宿主的侵染方式亦存在較大差別，而對(duì)于茶樹(shù)炭疽病菌侵染方式的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，只有明確了病原菌后，并建立穩(wěn)定的茶樹(shù)炭疽病菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，可為后續(xù)研究茶樹(shù)炭疽菌的關(guān)鍵致病功能基因奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】目前對(duì)于該致病菌的防治也較為困難，由于茶樹(shù)遺傳背景的復(fù)雜性，選育和種植抗病品種周期長(zhǎng)。主要通過(guò)農(nóng)藝措施防治和化學(xué)農(nóng)藥防治[13]。為明確引起茶樹(shù)炭疽病的致病菌種類(lèi)及其構(gòu)建一套高效、穩(wěn)定的茶樹(shù)炭疽病菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，有助于進(jìn)一步深入研究茶樹(shù)炭疽菌的致病相關(guān)功能基因分子機(jī)理以及挖掘潛在的可防控藥劑分子靶標(biāo)，以期為分子機(jī)制的研究提供新的線(xiàn)索，為茶樹(shù)炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

本研究所用致病菌來(lái)源分離自福州福建倉(cāng)山區(qū)農(nóng)林大學(xué)南山茶園、寧德蕉城區(qū)(洋中)萬(wàn)恒茶園、福安茶科所社口鎮(zhèn)茶圃基地和政和縣(楊源鎮(zhèn))的茶園采集病葉。pCZ007質(zhì)粒是由福建農(nóng)林大學(xué)功能基因組學(xué)研究中心惠贈(zèng)。

1.2 試劑

本研究所用培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1，PEG3350(聚乙二醇)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Sigma公司，氨芐青霉素(Ampicilline)、潮霉素B(Hygromycin B)和裂解酶(Lyase)由福州泰京生物有限公司代為購(gòu)買(mǎi)，其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

表1 本試驗(yàn)所用試劑

1.3 方法

1.3.1 茶樹(shù)致病菌分離 采用單孢分離法進(jìn)行分離接種至PDA平板(含有50 μg/mL 氨芐青霉素)26 ℃培養(yǎng)，分離純化后，采用科赫式法則將茶樹(shù)致病菌用5 mm打孔器打菌餅和空白瓊脂平板分別接入進(jìn)行離體茶葉回接侵染。

1.3.2 致病菌DNA提取和PCR克隆及測(cè)序分析 參考植物基因組提取試劑盒(TIANGEN公司)方法進(jìn)行DNA提取，本研究所用序列委托福州擎科生物公司合成，引物ITS序列見(jiàn)表2，反應(yīng)擴(kuò)增程序見(jiàn)表3，使用快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(BioTeke公司)分別標(biāo)記回收目的條帶，送福州鉑尚生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果經(jīng)NCBI的GenBank進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，在用MEGA7.0軟件進(jìn)行ITS序列分析。

1.3.3 質(zhì)粒的提取 按照大腸桿菌DH5α(TIANGEN公司)的方法轉(zhuǎn)入pCZ007質(zhì)粒至DH5α感受態(tài)細(xì)胞(該質(zhì)粒編碼融合有GFP的Histone1 蛋白將定位于細(xì)胞核)，接入LB平板(含100 μg/mL 氨芐青霉素)過(guò)夜培養(yǎng)12～16 h，挑取抗性大腸桿菌接入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2～4 h擴(kuò)繁用，用質(zhì)粒提取試劑盒(TIANGEN公司)的方法提取質(zhì)粒備用。

1.3.4 茶樹(shù)膠胞炭疽菌原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化 炭疽菌菌絲在PD培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d后，將菌絲各稱(chēng)取1 g，分裝成4份，無(wú)菌操作過(guò)濾沖洗，研磨成勻漿后分別加入裂解酶(0.1、0.2、0.3和0.4 g)于10 mL 1.2 mol/L無(wú)菌 KCl溶液于30 ℃ 90 r/min搖床裂解，2 h計(jì)數(shù)裂解原生質(zhì)體，用Mrcloth膜過(guò)濾菌絲，原生質(zhì)體(200 μL/管)中加入濃度為3000 μg/μL待轉(zhuǎn)化的DNA片段或者質(zhì)粒，輕彈充分混合，冰上靜置20 min。分2次加入1.25 mL PTC，輕彈充分混合，冰上靜置20 min。加入5 mL TB3液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL 氨芐青霉素)，28 ℃ 85 r/min輕搖復(fù)蘇14～18 h。加入40 mL 熔化并冷卻至50 ℃左右的TB3固體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素，200 μg/mL HYG(B)[潮霉素B縮寫(xiě)HYG(B)，購(gòu)買(mǎi)自福州泰京生物]，上下顛倒混勻，均勻倒入15 cm平板中，吹干30 min。從培養(yǎng)4 d的TB3固體培養(yǎng)基上層板[含100 μg/mL 氨芐青霉素，300 μg/mL HYG(B)]挑取轉(zhuǎn)化子至新的PDA平板[含100 μg/mL HYG(B)]上培養(yǎng)2～3 d。

1.3.5 轉(zhuǎn)化子分子驗(yàn)證 轉(zhuǎn)化子分別用PD培養(yǎng)基26 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d，過(guò)濾菌絲，用植物基因組試劑盒分別提取基因組，以其上一步提取成功的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照模板，清水組為陰性對(duì)照模板，同時(shí)進(jìn)行特異性擴(kuò)增。GFP引物序列參見(jiàn)表2，擴(kuò)增程序見(jiàn)表3，擴(kuò)增預(yù)期片段大小400 bp。

1.3.6 Cg N與轉(zhuǎn)化子CgNT6的抗性驗(yàn)證定 用5 mm打孔器分別將轉(zhuǎn)化子CgNT6和野生型Cg N的菌餅接入CM液體培養(yǎng)基含100 μg/mL HYG(B) 于26 ℃培養(yǎng)4 d，記錄并觀(guān)察結(jié)果。

1.3.7 轉(zhuǎn)化子CgNT6的熒光檢測(cè) 在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察將培養(yǎng)4 d的轉(zhuǎn)化子CgNT6的菌絲進(jìn)行熒光現(xiàn)象觀(guān)察。

1.3.8 轉(zhuǎn)化子CgNT6的穩(wěn)定性檢測(cè) 將轉(zhuǎn)化子CgNT6和野生型Cg N分別接入含有100 μg/mL HYG(B)-PDA平板，在26 ℃下培養(yǎng)5代后分別檢測(cè)熒光效果。

1.3.9 轉(zhuǎn)化子 CgNT6的致病性檢測(cè) 用5 mm打孔器將轉(zhuǎn)化子CgNT6和空白瓊脂平板分別接入離體茶葉，在26 ℃培養(yǎng)4 d觀(guān)察侵染茶葉病斑。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)致病菌分離

福州福建農(nóng)林大學(xué)南山茶園、寧德(洋中)萬(wàn)恒茶園、福安茶科所社口鎮(zhèn)茶圃基地、政和縣(楊源鎮(zhèn))的茶園、周寧歸來(lái)客茶園基地采集茶樹(shù)炭疽病葉進(jìn)行了分離，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放3～4個(gè)病葉(2 mm×2 mm)，26 ℃恒溫培養(yǎng)菌株，反復(fù)單孢分離純化4～5次，得到該病原菌的純培養(yǎng)物。通過(guò)前期分離菌落形態(tài)共分離12株致病分離物，對(duì)茶葉侵染，炭疽菌引起茶葉病斑大小，發(fā)現(xiàn)炭疽菌餅離體回接茶葉致病性最強(qiáng)為菌株N(圖1-b)，其分離自寧德市萬(wàn)恒茶園，選取該菌株N進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)菌落形態(tài)和孢子形態(tài)(圖2-a和b)初步判斷N菌為炭疽菌。

表2 本試驗(yàn)所用引物序列

表3 ITS PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

2.2 PCR克隆及測(cè)序分析序列分析

提取致病菌株N的基因組DNA進(jìn)行ITS特異性擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(120V電壓下15～20 min)，結(jié)果由圖2-c可知擴(kuò)增的條帶單一、清晰明亮、分子量500～750 bp與預(yù)期大小一致。測(cè)序分析結(jié)果經(jīng)NCBI的GenBank進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，結(jié)果顯示：致病菌株 N的ITS序列與登錄號(hào)HQ645081為Colletotrichumgloeosporioides在MAGA5構(gòu)建NJ進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)在一個(gè)分支上，支持率為67%(圖3)，因此結(jié)合病原菌的形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定茶樹(shù)炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。

a.炭疽病葉；b.致病菌N回接發(fā)病的茶葉；c、d、e.福安致病菌回接發(fā)病的茶葉；f、g.福州致病菌回接發(fā)病的茶葉；h.CK空白對(duì)照；i、j、k.政和致病菌回接發(fā)病的茶葉；l、m、n.寧德洋中致病菌回接發(fā)病的茶葉 a.The natural anthracnose of tea leaf;b.The tea leaf that re-infected by N isolate;c,d,e.Tea leaves infected by pathogenic Fuan’s isolates;f,g.Tea leaves leaves infected by pathogenic Fuzhou’s isolates;h.Blank control;i,j,k.Tea leaves infected by pathogenic FA’s isolates;l,m,n.Tea leaves infected by pathogenic YZ’s isolates圖1 不同來(lái)源的茶樹(shù)炭疽病病原菌的致病力測(cè)定Fig.1 Pathogenicity of tea anthoracnose pathogens from different origins

a.茶樹(shù)炭疽菌N菌株菌落形態(tài)；b.N菌株分生孢子形態(tài)，比例尺為10 μm；c.M為marker 2000,1為ITS條帶 a.C.gloeosporioides N isotate colony;b.C.gloeosporioides spores,the scale was 10 μm;c.M was marker 2000,1 is ITS single band圖2 茶樹(shù)炭疽菌N的菌落和分生孢子形態(tài)以及ITS片段的PCR檢測(cè)Fig.2 The colony and conidia morphology of C.gloeosporioides N isolate and the PCR detection of ITS fragment

圖3 基于ITS序列分析構(gòu)建NJ-系統(tǒng)樹(shù)Fig.3 The NJ-system tree based on ITS sequence analysis

2.3 菌絲裂解

分別采用濃度為10、20、30和40 mg/L的菌絲裂解液10 mL裂解1 g菌株N的菌絲，置于30 ℃ 90 r/min搖床裂解，2 h后觀(guān)察菌株裂解情況。結(jié)果顯示菌絲酶解出的原生質(zhì)體，顆粒飽滿(mǎn)，未見(jiàn)塌陷(圖4)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，隨著裂解酶濃度增加原生質(zhì)體的濃度隨之增大，呈線(xiàn)性分布R2為0.9856(圖5)。2 h計(jì)數(shù)原生質(zhì)體數(shù)量發(fā)現(xiàn)1 g菌絲在20 mg/L濃度下原生質(zhì)體濃度達(dá)到4.49×106，從實(shí)驗(yàn)成本考慮出發(fā)0.2 g/10 mL濃度為最適濃度。

圖4 原生質(zhì)體裂解Fig.4 Protoplasts of C.gloeosporioides N isolate

圖5 原生質(zhì)體與裂解酶濃度線(xiàn)性圖Fig.5 Linear graph of the concentration of protoplasts and lyase

2.4 轉(zhuǎn)化子分子驗(yàn)證結(jié)果

將含有pCZ007質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行液體培養(yǎng)16 h，隨后進(jìn)行質(zhì)粒提取并檢測(cè)濃度達(dá)到300 ng/uL。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入茶樹(shù)炭疽菌N(下文稱(chēng)為Cg N)的原生質(zhì)體中。從26 ℃培養(yǎng)4 d后的TB3平板上挑取轉(zhuǎn)化子，從中隨機(jī)選取4株轉(zhuǎn)化子(t6、t19、t25和t44)提取基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以質(zhì)粒pCZ007為陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(120 V電壓下15～20 min)，選取1株命名為CgNT6的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，由圖6可知，擴(kuò)增的條帶單一、清晰明亮、分子量400 bp與預(yù)期大小一致，GFP標(biāo)記基因整合到轉(zhuǎn)子菌株CgNT6里，而陰性對(duì)照不含DNA模板，擴(kuò)不出相應(yīng)的條帶大小。

2.5 Cg N與轉(zhuǎn)化子CgNT6的抗性驗(yàn)證定

由圖7可知，將轉(zhuǎn)化子CgNT6和野生型Cg N培養(yǎng)4 d后，由于Cg N不含有對(duì)潮霉素抗性，在含有潮霉素B的CM固體培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)化子CgNT6能正常生長(zhǎng)。

2.6 轉(zhuǎn)化子CgNT6的熒光檢測(cè)及穩(wěn)定性檢測(cè)

在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)化子CgNT6的菌絲和分生孢子以及培養(yǎng)5代后的菌絲的細(xì)胞核均能穩(wěn)定發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光現(xiàn)象見(jiàn)圖8。

M為Marker2000；1～6分別是t6、t19、t25、t44、H2O和質(zhì)粒pCZ007 M is Marker2000;1-6 is t6,t19,t25,t44,H2O and pCZ007,respectively圖6 pCZ007轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.6 PCR verification of pCZ007 transformants

a.Cg N野生型在AMP-CM培養(yǎng)基； b.Cg N野生型在AMP-HYG(B)-CM培養(yǎng)基；c.CgNT6野生型在AMP-CM培養(yǎng)基；d.CgNT6野生型在AMP-HYG(B)-CM培養(yǎng)基 a.Cg N wild type in AMP-CM medium;b.Cg N wild type in AMP-HYG(B)-CM medium;c.Wild type CgNT6 in AMP-CM medium;d.CgNT6 wild type in AMP-HYG(B)-CM medium圖7 CgNT6菌株的抗性驗(yàn)證Fig.7 Resistance verification of CgNT6 strain

2.7 轉(zhuǎn)化子 CgNT6的致病性檢測(cè)

回接4 d后的離體茶葉進(jìn)行病斑觀(guān)察發(fā)現(xiàn)CK空白瓊脂不含菌株對(duì)照葉片無(wú)變化，接入轉(zhuǎn)化子CgNT6的茶葉產(chǎn)生明顯病斑(圖9)，茶樹(shù)膠孢炭疽菌轉(zhuǎn)化pCZ007質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子CgNT6對(duì)茶葉的致病性無(wú)影響，說(shuō)明外源轉(zhuǎn)入的篩選標(biāo)記基因(HYG)以及GFP蛋白對(duì)膠孢炭疽菌的致病性沒(méi)有影響。

3 討 論

茶樹(shù)炭疽病分布廣泛，在世界各主要茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，發(fā)病較重時(shí)，激起茶樹(shù)自身防衛(wèi)，分泌激素使葉片提早脫落，進(jìn)而影響樹(shù)勢(shì)的生長(zhǎng)，最后減少茶葉產(chǎn)量[14]。要防控茶樹(shù)炭疽病，應(yīng)先明確病原菌的種類(lèi)，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)王玉春等研究提出的方法[15]，采集福建各地茶園的病葉進(jìn)行觀(guān)察和記錄；再單孢分離篩選致病性強(qiáng)的病原菌并提取優(yōu)勢(shì)病原菌基因組DNA；利用分子檢測(cè)手段PCR擴(kuò)增ITS序列進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)合形態(tài)特征鑒定得到一株致病性較強(qiáng)的茶樹(shù)炭疽菌——膠孢炭疽菌Cg N。

針對(duì)目前，茶樹(shù)病害防控技術(shù)也多采用簡(jiǎn)單、傳統(tǒng)的廣譜藥劑，諸如炭特靈、丙環(huán)唑、福碇胺、咪鮮胺等進(jìn)行噴施防治病害[6-7,15]，容易造成農(nóng)藥殘留，降低茶葉品質(zhì)。此外，農(nóng)藥的濫用也導(dǎo)致病原菌的耐藥性增加，造成增加施藥量的惡性循環(huán)。因此，更加迫切需要合理精準(zhǔn)的綠色防控。對(duì)不同地域茶樹(shù)炭疽病病原菌的分離與鑒定，有助于對(duì)不同的病原菌進(jìn)行針對(duì)性的防治。此外，建立穩(wěn)定的病原菌遺傳轉(zhuǎn)化體系將有助于深入解析茶樹(shù)炭疽菌的致病分子機(jī)制，為防治炭疽病挖掘更多藥物靶點(diǎn)。本研究除了順利獲得一株致病力較強(qiáng)的茶樹(shù)炭疽病病原菌Cg N外，還構(gòu)建了該菌穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。綠色熒光蛋白GFP已經(jīng)被諸多研究者廣泛地應(yīng)用于絲狀植物病原真菌侵染植物過(guò)程的研究[8-13]。本論文通過(guò)聚乙二醇PEG-CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將含有能表達(dá)H1-GFP(Histone 1融合GFP)蛋白的質(zhì)粒成功地轉(zhuǎn)化至茶樹(shù)炭疽菌Cg N，說(shuō)明茶樹(shù)炭疽菌適合采用PEG-CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行基因敲除等遺傳分子操作，該結(jié)果同韓萌萌等在芒果炭疽菌中的研究一致[16]。穩(wěn)定性、熒光現(xiàn)象、潮霉素B抗性，以及形態(tài)和致病力上，相對(duì)于野生型并無(wú)明顯差異，表明GFP基因標(biāo)記對(duì)于茶樹(shù)膠胞炭疽菌的影響是中性的。除了聚乙二醇PEG-CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法外，有很多研究者在菌物研究中應(yīng)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，如李志偉等用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將含有GFP基因成功轉(zhuǎn)入至茶樹(shù)炭疽病病原菌中[17]，相比較于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，需要反復(fù)構(gòu)建載體，只能以T-DNA形式插入、農(nóng)桿菌與受體細(xì)胞的共培養(yǎng)時(shí)間、以及雙元載體等因素的影響，本方法僅需用適量溶壁酶等滲溶液就可獲取得到原生質(zhì)體、在PEG-CaCl2介導(dǎo)下即可轉(zhuǎn)入外源目的片段，就可篩選獲得突變體，具有操作簡(jiǎn)單、對(duì)儀器要求不高等優(yōu)點(diǎn)。后續(xù)我們將在本研究的基礎(chǔ)之上，利用CgNT6菌株，觀(guān)察茶樹(shù)炭疽菌侵染和定殖茶葉的過(guò)程，并進(jìn)一步利用建立的遺傳體系，對(duì)茶樹(shù)炭疽菌的相關(guān)基因進(jìn)行功能研究。

a、d.野生型Cg N；b、e.轉(zhuǎn)化子CgNT6；c、f.轉(zhuǎn)化子CgNT6第5代 a and d.Cg N strain;b and e.Transformant CgNT6;c and f.The 5th generation of transformant CgNT6圖8 CgNT6菌株的GFP熒光觀(guān)察Fig.8 Flourescent observation of GFP-marked CgNT6 strains

a.CgNT6菌落；b.轉(zhuǎn)化子CgNT6侵染茶葉圖；c.空白對(duì)照；d.Cg N侵染茶葉圖 a.CgNT6 strain;b.Tea leaf infected by CgNT6;c.The blank control;d.Tea leaf infected by Cg N圖9 CgNT6的致病性檢測(cè)Fig.9 Pathogenicity test of CgNT6 strain

4 結(jié) 論

本研究從茶樹(shù)炭疽病分離鑒定一株主要強(qiáng)致病力的致病菌株Cg N，經(jīng)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子檢測(cè)，鑒定為膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)，并成功建立了能穩(wěn)定表達(dá)目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)深入研究茶樹(shù)炭疽菌的相關(guān)關(guān)鍵基因的功能，以及觀(guān)察茶樹(shù)膠胞炭疽菌對(duì)茶樹(shù)葉片的侵染過(guò)程和傳播途徑提供很好的技術(shù)支撐，為研究炭疽病病原菌與宿主互作的機(jī)制從而為科學(xué)防治茶樹(shù)炭疽病奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。