彭成彬，陳美霞，魏日鳳，孫 云，張承康，劉 偉

( 1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100)

【研究意義】茶樹[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]原產(chǎn)于中國，為多年生常綠木本植物，多分布于亞熱帶和熱帶地區(qū)[1]。福建茶葉面積和產(chǎn)量都位居全國前茅，茶產(chǎn)業(yè)是福建省的支柱型產(chǎn)業(yè)，也是增加農(nóng)民收入和促進經(jīng)濟發(fā)展重要手段[2]。近年來福建茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)?？焖伲竺娣e的種植導(dǎo)致炭疽病日益嚴重，由于管理不當(dāng)導(dǎo)致病害頻發(fā)，使茶葉產(chǎn)量下降，影響茶葉品質(zhì)，制約茶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展?！厩叭搜芯窟M展】炭疽菌屬(Colletotrichumspp.)是世界上被認為十大重要病原菌之一，能在全球范圍內(nèi)危害眾多單雙子葉植物[3]，由于炭疽菌屬的寄主非常廣泛，茶樹膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides) 是造成茶樹炭疽病害的主要病原菌之一，該致病菌侵染茶樹嫩葉、新梢、茶樹花和茶樹果實等部位，發(fā)病前期葉片表面出現(xiàn)褐色小斑點，后期葉片表面形成枯死斑，使茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴重導(dǎo)致茶樹致死，隨著各茶園栽培面積的增加，不恰當(dāng)?shù)墓芾?，農(nóng)藥的濫用勢必導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化，加之夏季空氣潮濕，溫度高，促使茶樹炭疽病害大面積爆發(fā)。造成經(jīng)濟損失[4-7]。炭疽菌屬種與亞種之間的差異越來越小，僅靠形態(tài)學(xué)鑒定菌株是不準(zhǔn)確的，同時分析菌株基因型和表現(xiàn)型，鑒定快速、結(jié)果準(zhǔn)確。核糖體DNA是一段重復(fù)的序列，由非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和3種RNA(18S RNA、28S RNA、5.8S RNA)基因編碼組成。因其具有良好的同質(zhì)性，在細胞中以一種協(xié)同方式進化，可以揭示菌株DNA遺傳本質(zhì)，適合于所有菌株基于了ITS(Internal Transcribed Spacer，ITS)標(biāo)記，被國內(nèi)外研究者作為真菌通用DNA條形碼[4,6]。綠色熒光蛋白基因(Green fluorescent protein)GFP標(biāo)記能在具有生命特征的寄主里表達形成生物發(fā)光蛋白，不傷害活細胞，熒光信號在激光共聚焦顯微鏡下，檢測到光源單一和穩(wěn)定[8]。諸多研究者將不同絲狀真菌進行GFP標(biāo)記后，探究其侵染機制，諸如：香蕉枯萎病(Fusariumoxysporum)[9]、芒果畸形病(F.proliferatum)[10]、小麥根腐病(Bipolarissorokiniana)[11]、棗黑斑病(Alternariaalternata)[12]、水稻稻瘟病(Magnaportheoryzae)[13]等。GFP標(biāo)記基因作為一種報告基因被廣泛應(yīng)用。【本研究切入點】現(xiàn)有研究表明不同地區(qū)茶樹炭疽病主要病原菌不同，炭疽菌對不同宿主的侵染方式亦存在較大差別，而對于茶樹炭疽病菌侵染方式的研究鮮見報道，只有明確了病原菌后，并建立穩(wěn)定的茶樹炭疽病菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，可為后續(xù)研究茶樹炭疽菌的關(guān)鍵致病功能基因奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】目前對于該致病菌的防治也較為困難，由于茶樹遺傳背景的復(fù)雜性，選育和種植抗病品種周期長。主要通過農(nóng)藝措施防治和化學(xué)農(nóng)藥防治[13]。為明確引起茶樹炭疽病的致病菌種類及其構(gòu)建一套高效、穩(wěn)定的茶樹炭疽病菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，有助于進一步深入研究茶樹炭疽菌的致病相關(guān)功能基因分子機理以及挖掘潛在的可防控藥劑分子靶標(biāo)，以期為分子機制的研究提供新的線索，為茶樹炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究所用致病菌來源分離自福州福建倉山區(qū)農(nóng)林大學(xué)南山茶園、寧德蕉城區(qū)(洋中)萬恒茶園、福安茶科所社口鎮(zhèn)茶圃基地和政和縣(楊源鎮(zhèn))的茶園采集病葉。pCZ007質(zhì)粒是由福建農(nóng)林大學(xué)功能基因組學(xué)研究中心惠贈。

1.2 試劑

本研究所用培養(yǎng)基配方見表1，PEG3350(聚乙二醇)購買自美國Sigma公司，氨芐青霉素(Ampicilline)、潮霉素B(Hygromycin B)和裂解酶(Lyase)由福州泰京生物有限公司代為購買，其他藥品均為國產(chǎn)分析純試劑。

表1 本試驗所用試劑

1.3 方法

1.3.1 茶樹致病菌分離 采用單孢分離法進行分離接種至PDA平板(含有50 μg/mL 氨芐青霉素)26 ℃培養(yǎng)，分離純化后，采用科赫式法則將茶樹致病菌用5 mm打孔器打菌餅和空白瓊脂平板分別接入進行離體茶葉回接侵染。

1.3.2 致病菌DNA提取和PCR克隆及測序分析 參考植物基因組提取試劑盒(TIANGEN公司)方法進行DNA提取，本研究所用序列委托福州擎科生物公司合成，引物ITS序列見表2，反應(yīng)擴增程序見表3，使用快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(BioTeke公司)分別標(biāo)記回收目的條帶，送福州鉑尚生物科技有限公司進行雙向測序，結(jié)果經(jīng)NCBI的GenBank進行BLAST搜索比對，在用MEGA7.0軟件進行ITS序列分析。

1.3.3 質(zhì)粒的提取 按照大腸桿菌DH5α(TIANGEN公司)的方法轉(zhuǎn)入pCZ007質(zhì)粒至DH5α感受態(tài)細胞(該質(zhì)粒編碼融合有GFP的Histone1 蛋白將定位于細胞核)，接入LB平板(含100 μg/mL 氨芐青霉素)過夜培養(yǎng)12～16 h，挑取抗性大腸桿菌接入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2～4 h擴繁用，用質(zhì)粒提取試劑盒(TIANGEN公司)的方法提取質(zhì)粒備用。

1.3.4 茶樹膠胞炭疽菌原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化 炭疽菌菌絲在PD培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d后，將菌絲各稱取1 g，分裝成4份，無菌操作過濾沖洗，研磨成勻漿后分別加入裂解酶(0.1、0.2、0.3和0.4 g)于10 mL 1.2 mol/L無菌 KCl溶液于30 ℃ 90 r/min搖床裂解，2 h計數(shù)裂解原生質(zhì)體，用Mrcloth膜過濾菌絲，原生質(zhì)體(200 μL/管)中加入濃度為3000 μg/μL待轉(zhuǎn)化的DNA片段或者質(zhì)粒，輕彈充分混合，冰上靜置20 min。分2次加入1.25 mL PTC，輕彈充分混合，冰上靜置20 min。加入5 mL TB3液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL 氨芐青霉素)，28 ℃ 85 r/min輕搖復(fù)蘇14～18 h。加入40 mL 熔化并冷卻至50 ℃左右的TB3固體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素，200 μg/mL HYG(B)[潮霉素B縮寫HYG(B)，購買自福州泰京生物]，上下顛倒混勻，均勻倒入15 cm平板中，吹干30 min。從培養(yǎng)4 d的TB3固體培養(yǎng)基上層板[含100 μg/mL 氨芐青霉素，300 μg/mL HYG(B)]挑取轉(zhuǎn)化子至新的PDA平板[含100 μg/mL HYG(B)]上培養(yǎng)2～3 d。

1.3.5 轉(zhuǎn)化子分子驗證 轉(zhuǎn)化子分別用PD培養(yǎng)基26 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d，過濾菌絲，用植物基因組試劑盒分別提取基因組，以其上一步提取成功的質(zhì)粒為陽性對照模板，清水組為陰性對照模板，同時進行特異性擴增。GFP引物序列參見表2，擴增程序見表3，擴增預(yù)期片段大小400 bp。

1.3.6 Cg N與轉(zhuǎn)化子CgNT6的抗性驗證定 用5 mm打孔器分別將轉(zhuǎn)化子CgNT6和野生型Cg N的菌餅接入CM液體培養(yǎng)基含100 μg/mL HYG(B) 于26 ℃培養(yǎng)4 d，記錄并觀察結(jié)果。

1.3.7 轉(zhuǎn)化子CgNT6的熒光檢測 在激光共聚焦顯微鏡下觀察將培養(yǎng)4 d的轉(zhuǎn)化子CgNT6的菌絲進行熒光現(xiàn)象觀察。

1.3.8 轉(zhuǎn)化子CgNT6的穩(wěn)定性檢測 將轉(zhuǎn)化子CgNT6和野生型Cg N分別接入含有100 μg/mL HYG(B)-PDA平板，在26 ℃下培養(yǎng)5代后分別檢測熒光效果。

1.3.9 轉(zhuǎn)化子 CgNT6的致病性檢測 用5 mm打孔器將轉(zhuǎn)化子CgNT6和空白瓊脂平板分別接入離體茶葉，在26 ℃培養(yǎng)4 d觀察侵染茶葉病斑。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹致病菌分離

福州福建農(nóng)林大學(xué)南山茶園、寧德(洋中)萬恒茶園、福安茶科所社口鎮(zhèn)茶圃基地、政和縣(楊源鎮(zhèn))的茶園、周寧歸來客茶園基地采集茶樹炭疽病葉進行了分離，每個培養(yǎng)皿內(nèi)放3～4個病葉(2 mm×2 mm)，26 ℃恒溫培養(yǎng)菌株，反復(fù)單孢分離純化4～5次，得到該病原菌的純培養(yǎng)物。通過前期分離菌落形態(tài)共分離12株致病分離物，對茶葉侵染，炭疽菌引起茶葉病斑大小，發(fā)現(xiàn)炭疽菌餅離體回接茶葉致病性最強為菌株N(圖1-b)，其分離自寧德市萬恒茶園，選取該菌株N進行后續(xù)試驗菌落形態(tài)和孢子形態(tài)(圖2-a和b)初步判斷N菌為炭疽菌。

表2 本試驗所用引物序列

表3 ITS PCR擴增反應(yīng)程序

2.2 PCR克隆及測序分析序列分析

提取致病菌株N的基因組DNA進行ITS特異性擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(120V電壓下15～20 min)，結(jié)果由圖2-c可知擴增的條帶單一、清晰明亮、分子量500～750 bp與預(yù)期大小一致。測序分析結(jié)果經(jīng)NCBI的GenBank進行BLAST搜索比對，結(jié)果顯示：致病菌株 N的ITS序列與登錄號HQ645081為Colletotrichumgloeosporioides在MAGA5構(gòu)建NJ進化樹聚類在一個分支上，支持率為67%(圖3)，因此結(jié)合病原菌的形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定茶樹炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。

a.炭疽病葉；b.致病菌N回接發(fā)病的茶葉；c、d、e.福安致病菌回接發(fā)病的茶葉；f、g.福州致病菌回接發(fā)病的茶葉；h.CK空白對照；i、j、k.政和致病菌回接發(fā)病的茶葉；l、m、n.寧德洋中致病菌回接發(fā)病的茶葉 a.The natural anthracnose of tea leaf;b.The tea leaf that re-infected by N isolate;c,d,e.Tea leaves infected by pathogenic Fuan’s isolates;f,g.Tea leaves leaves infected by pathogenic Fuzhou’s isolates;h.Blank control;i,j,k.Tea leaves infected by pathogenic FA’s isolates;l,m,n.Tea leaves infected by pathogenic YZ’s isolates圖1 不同來源的茶樹炭疽病病原菌的致病力測定Fig.1 Pathogenicity of tea anthoracnose pathogens from different origins

a.茶樹炭疽菌N菌株菌落形態(tài)；b.N菌株分生孢子形態(tài)，比例尺為10 μm；c.M為marker 2000,1為ITS條帶 a.C.gloeosporioides N isotate colony;b.C.gloeosporioides spores,the scale was 10 μm;c.M was marker 2000,1 is ITS single band圖2 茶樹炭疽菌N的菌落和分生孢子形態(tài)以及ITS片段的PCR檢測Fig.2 The colony and conidia morphology of C.gloeosporioides N isolate and the PCR detection of ITS fragment

圖3 基于ITS序列分析構(gòu)建NJ-系統(tǒng)樹Fig.3 The NJ-system tree based on ITS sequence analysis

2.3 菌絲裂解

分別采用濃度為10、20、30和40 mg/L的菌絲裂解液10 mL裂解1 g菌株N的菌絲，置于30 ℃ 90 r/min搖床裂解，2 h后觀察菌株裂解情況。結(jié)果顯示菌絲酶解出的原生質(zhì)體，顆粒飽滿，未見塌陷(圖4)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，隨著裂解酶濃度增加原生質(zhì)體的濃度隨之增大，呈線性分布R2為0.9856(圖5)。2 h計數(shù)原生質(zhì)體數(shù)量發(fā)現(xiàn)1 g菌絲在20 mg/L濃度下原生質(zhì)體濃度達到4.49×106，從實驗成本考慮出發(fā)0.2 g/10 mL濃度為最適濃度。

圖4 原生質(zhì)體裂解Fig.4 Protoplasts of C.gloeosporioides N isolate

圖5 原生質(zhì)體與裂解酶濃度線性圖Fig.5 Linear graph of the concentration of protoplasts and lyase

2.4 轉(zhuǎn)化子分子驗證結(jié)果

將含有pCZ007質(zhì)粒的大腸桿菌進行液體培養(yǎng)16 h，隨后進行質(zhì)粒提取并檢測濃度達到300 ng/uL。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入茶樹炭疽菌N(下文稱為Cg N)的原生質(zhì)體中。從26 ℃培養(yǎng)4 d后的TB3平板上挑取轉(zhuǎn)化子，從中隨機選取4株轉(zhuǎn)化子(t6、t19、t25和t44)提取基因組DNA，進行PCR驗證，以質(zhì)粒pCZ007為陽性對照。經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(120 V電壓下15～20 min)，選取1株命名為CgNT6的轉(zhuǎn)化子進行后續(xù)實驗，由圖6可知，擴增的條帶單一、清晰明亮、分子量400 bp與預(yù)期大小一致，GFP標(biāo)記基因整合到轉(zhuǎn)子菌株CgNT6里，而陰性對照不含DNA模板，擴不出相應(yīng)的條帶大小。

2.5 Cg N與轉(zhuǎn)化子CgNT6的抗性驗證定

由圖7可知，將轉(zhuǎn)化子CgNT6和野生型Cg N培養(yǎng)4 d后，由于Cg N不含有對潮霉素抗性，在含有潮霉素B的CM固體培養(yǎng)基中不能生長，而轉(zhuǎn)化子CgNT6能正常生長。

2.6 轉(zhuǎn)化子CgNT6的熒光檢測及穩(wěn)定性檢測

在激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化子CgNT6的菌絲和分生孢子以及培養(yǎng)5代后的菌絲的細胞核均能穩(wěn)定發(fā)出強烈的綠色熒光現(xiàn)象見圖8。

M為Marker2000；1～6分別是t6、t19、t25、t44、H2O和質(zhì)粒pCZ007 M is Marker2000;1-6 is t6,t19,t25,t44,H2O and pCZ007,respectively圖6 pCZ007轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.6 PCR verification of pCZ007 transformants

a.Cg N野生型在AMP-CM培養(yǎng)基； b.Cg N野生型在AMP-HYG(B)-CM培養(yǎng)基；c.CgNT6野生型在AMP-CM培養(yǎng)基；d.CgNT6野生型在AMP-HYG(B)-CM培養(yǎng)基 a.Cg N wild type in AMP-CM medium;b.Cg N wild type in AMP-HYG(B)-CM medium;c.Wild type CgNT6 in AMP-CM medium;d.CgNT6 wild type in AMP-HYG(B)-CM medium圖7 CgNT6菌株的抗性驗證Fig.7 Resistance verification of CgNT6 strain

2.7 轉(zhuǎn)化子 CgNT6的致病性檢測

回接4 d后的離體茶葉進行病斑觀察發(fā)現(xiàn)CK空白瓊脂不含菌株對照葉片無變化，接入轉(zhuǎn)化子CgNT6的茶葉產(chǎn)生明顯病斑(圖9)，茶樹膠孢炭疽菌轉(zhuǎn)化pCZ007質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子CgNT6對茶葉的致病性無影響，說明外源轉(zhuǎn)入的篩選標(biāo)記基因(HYG)以及GFP蛋白對膠孢炭疽菌的致病性沒有影響。

3 討 論

茶樹炭疽病分布廣泛，在世界各主要茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，發(fā)病較重時，激起茶樹自身防衛(wèi)，分泌激素使葉片提早脫落，進而影響樹勢的生長，最后減少茶葉產(chǎn)量[14]。要防控茶樹炭疽病，應(yīng)先明確病原菌的種類，本實驗根據(jù)王玉春等研究提出的方法[15]，采集福建各地茶園的病葉進行觀察和記錄；再單孢分離篩選致病性強的病原菌并提取優(yōu)勢病原菌基因組DNA；利用分子檢測手段PCR擴增ITS序列進行序列比對，結(jié)合形態(tài)特征鑒定得到一株致病性較強的茶樹炭疽菌——膠孢炭疽菌Cg N。

針對目前，茶樹病害防控技術(shù)也多采用簡單、傳統(tǒng)的廣譜藥劑，諸如炭特靈、丙環(huán)唑、福碇胺、咪鮮胺等進行噴施防治病害[6-7,15]，容易造成農(nóng)藥殘留，降低茶葉品質(zhì)。此外，農(nóng)藥的濫用也導(dǎo)致病原菌的耐藥性增加，造成增加施藥量的惡性循環(huán)。因此，更加迫切需要合理精準(zhǔn)的綠色防控。對不同地域茶樹炭疽病病原菌的分離與鑒定，有助于對不同的病原菌進行針對性的防治。此外，建立穩(wěn)定的病原菌遺傳轉(zhuǎn)化體系將有助于深入解析茶樹炭疽菌的致病分子機制，為防治炭疽病挖掘更多藥物靶點。本研究除了順利獲得一株致病力較強的茶樹炭疽病病原菌Cg N外，還構(gòu)建了該菌穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。綠色熒光蛋白GFP已經(jīng)被諸多研究者廣泛地應(yīng)用于絲狀植物病原真菌侵染植物過程的研究[8-13]。本論文通過聚乙二醇PEG-CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將含有能表達H1-GFP(Histone 1融合GFP)蛋白的質(zhì)粒成功地轉(zhuǎn)化至茶樹炭疽菌Cg N，說明茶樹炭疽菌適合采用PEG-CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法進行基因敲除等遺傳分子操作，該結(jié)果同韓萌萌等在芒果炭疽菌中的研究一致[16]。穩(wěn)定性、熒光現(xiàn)象、潮霉素B抗性，以及形態(tài)和致病力上，相對于野生型并無明顯差異，表明GFP基因標(biāo)記對于茶樹膠胞炭疽菌的影響是中性的。除了聚乙二醇PEG-CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法外，有很多研究者在菌物研究中應(yīng)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，如李志偉等用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將含有GFP基因成功轉(zhuǎn)入至茶樹炭疽病病原菌中[17]，相比較于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，需要反復(fù)構(gòu)建載體，只能以T-DNA形式插入、農(nóng)桿菌與受體細胞的共培養(yǎng)時間、以及雙元載體等因素的影響，本方法僅需用適量溶壁酶等滲溶液就可獲取得到原生質(zhì)體、在PEG-CaCl2介導(dǎo)下即可轉(zhuǎn)入外源目的片段，就可篩選獲得突變體，具有操作簡單、對儀器要求不高等優(yōu)點。后續(xù)我們將在本研究的基礎(chǔ)之上，利用CgNT6菌株，觀察茶樹炭疽菌侵染和定殖茶葉的過程，并進一步利用建立的遺傳體系，對茶樹炭疽菌的相關(guān)基因進行功能研究。

a、d.野生型Cg N；b、e.轉(zhuǎn)化子CgNT6；c、f.轉(zhuǎn)化子CgNT6第5代 a and d.Cg N strain;b and e.Transformant CgNT6;c and f.The 5th generation of transformant CgNT6圖8 CgNT6菌株的GFP熒光觀察Fig.8 Flourescent observation of GFP-marked CgNT6 strains

a.CgNT6菌落；b.轉(zhuǎn)化子CgNT6侵染茶葉圖；c.空白對照；d.Cg N侵染茶葉圖 a.CgNT6 strain;b.Tea leaf infected by CgNT6;c.The blank control;d.Tea leaf infected by Cg N圖9 CgNT6的致病性檢測Fig.9 Pathogenicity test of CgNT6 strain

4 結(jié) 論

本研究從茶樹炭疽病分離鑒定一株主要強致病力的致病菌株Cg N，經(jīng)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子檢測，鑒定為膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)，并成功建立了能穩(wěn)定表達目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)深入研究茶樹炭疽菌的相關(guān)關(guān)鍵基因的功能，以及觀察茶樹膠胞炭疽菌對茶樹葉片的侵染過程和傳播途徑提供很好的技術(shù)支撐，為研究炭疽病病原菌與宿主互作的機制從而為科學(xué)防治茶樹炭疽病奠定了堅實的基礎(chǔ)。