汪 茜，宋 娟，李冬萍，陳廷速，覃曉娟，車江旅*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學院，廣西 南寧 530007)

【研究意義】姜瘟病是生姜(ZingiberofficinaleRosc.)細菌性青枯病(Bacterial wilt of ginger)的俗稱[1-2]，其致病菌曾為青枯假單胞菌(PseudomonassolanacearumSmith)，現(xiàn)已根據(jù)分類地位命名為青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)[3]。據(jù)調(diào)查，由姜瘟病所造成的生姜產(chǎn)量損失一般為20%～30%，有的高達50%～70%甚至絕產(chǎn)[4-5]，嚴重制約我國生姜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。國內(nèi)對于姜瘟病的防治主要依賴于化學藥物[6]，通常使用高錳酸鉀或甲醛對種姜進行消毒及施用氯化苦原液對土壤進行熏蒸，以減少種姜和土壤中的病原菌，但化學防治會產(chǎn)生一系列農(nóng)藥殘留等問題[7]。目前用于姜瘟病生物防治的微生物主要為木霉(Trichoderma)、芽孢桿菌(Bacillus)和鏈霉菌(Streptomyces)等真菌、細菌和放線菌[8-10]，但這些生防微生物多數(shù)只定殖于生姜根際土壤，受土壤環(huán)境因子影響較明顯，導致田間生防效果不穩(wěn)定，很難大面積推廣應(yīng)用，亟待發(fā)掘生防效果穩(wěn)定的新型生防微生物。叢枝菌根(AM)是自然界中最普遍的一種菌根類型，是由球囊菌門(Glomeromycota)真菌與植物根系形成的互惠共生體，80%以上的陸地植物(約20萬種)都能形成AM[11-13]。AM真菌是一類在改善土壤生態(tài)、抑制土傳病害和提高植物抗病性等方面極具應(yīng)用潛力的微生物資源，相對于木霉、芽孢桿菌和鏈霉菌等完全暴露在根際土壤中的生防微生物，其受到環(huán)境的影響較小，更容易獲得穩(wěn)定的防治效果。因此，分析健康和患病生姜樣地根際土壤AM真菌的群落組成，對篩選具有抗病效果的AM真菌優(yōu)勢菌株及利用微生態(tài)調(diào)控手段進行姜瘟病綜合防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】自Safir[14]首次發(fā)現(xiàn)接種摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)能降低由土棘殼孢(Pyrenochaetaterrestris)引起的洋蔥根腐病發(fā)病率以來，眾多研究已證實AM真菌能幫助宿主抵御病原物侵染[15]，如對番茄青枯病、玉米紋枯病、黃瓜立枯病和甘薯菌核病等[16-18]均有明顯的防治效果。已有研究表明，土傳病害的發(fā)生與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤養(yǎng)分指標密切相關(guān)[19-20]。陳海念[21]開展煙草青枯病病區(qū)與健康區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙草發(fā)生青枯病后期根際土壤微生物的物種數(shù)量略有減少；土壤有機質(zhì)含量偏高會導致煙草青枯病病情加劇，青枯病發(fā)生后患病煙株根際土壤的全鉀和速效鉀含量顯著高于健康煙株。Wang等[22]研究表明，與青枯病發(fā)病煙田相比，健康煙田煙株根際土壤具有較高的微生物群落多樣性和豐富度。鄧曉等[23]研究顯示，中度和重度香蕉枯萎病危害土壤的真菌種類與輕度和無香蕉枯萎病危害土壤無明顯改變，但真菌數(shù)量明顯增加。汪茜等[24]研究發(fā)現(xiàn)，健康生姜根際土壤的AM真菌孢子數(shù)量明顯高于患姜瘟病生姜根際土壤。目前，傳統(tǒng)的平板計數(shù)法仍是生姜土壤微生物生態(tài)研究的主要方法，但由于可培養(yǎng)的微生物僅為自然界微生物總數(shù)的1%～10%，再加上一些人為限定的培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間)限制，該方法無法全面反映微生物生長的自然條件。因此，采用平板計數(shù)法對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)開展的研究通常僅局限于可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌數(shù)量的變化方面[25]。隨著分子生物學方法的發(fā)展，數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)漸趨完善，宏基因組測序方法中的Illumina MiSeq測序技術(shù)為微生物群落結(jié)構(gòu)的深層次分析提供了更經(jīng)濟、高效、快捷的途徑。【本研究切入點】目前，利用Illumina MiSeq測序技術(shù)分析患病生姜與健康生姜根際土壤AM真菌多樣性的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以患病生姜根際土壤和健康生姜根際土壤為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析其AM真菌的群落多樣性及理化性質(zhì)差異，探究土壤中制約姜瘟病發(fā)生的關(guān)鍵因素，揭示姜瘟病發(fā)生與土壤微生物種群間的相關(guān)性，為利用微生態(tài)調(diào)控手段進行姜瘟病綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病生姜和健康生姜根際土壤10個樣品分別采自桂林市全州縣重病姜田(KJB2_S)、桂林市全州縣健康姜田(KJJ2_S)、柳州市三都鎮(zhèn)重病姜田(BMB1_S)、柳州市三都鎮(zhèn)健康姜田(BMJ1_S)、柳州市柳城縣重病姜田(LCB1_S)、柳州市柳城縣健康姜田(LCJ1_S)、百色市德?？h重病姜田(FGB_S)、百色市德?？h健康姜田(FGJ_S)、百色市田林縣重病姜田(NGB_S)和百色市田林縣健康姜田(NGJ_S)。5個樣地的土壤樣品均采用五點取樣法采集(各樣地采集的樣品最后分別混合為1個樣品)。各土壤樣品的理化性質(zhì)見表1。

1.2 試驗方法

DNA提?。喊凑胀寥繢NA提取試劑盒(Fast DNA spin kit for soil，Bio 101，La Jolla，Calif.)說明進行操作。

表1 患病生姜和健康生姜樣地土壤的理化性質(zhì)

PCR擴增：參考Wu等[25]的方法，使用巢式PCR對土壤AM真菌的SSU rDNA進行擴增，PCR引物為5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′和5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′，擴增片段大小約300 bp。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2.0 μL DNA 模板(第1次PCR)或2.0 μL PCR產(chǎn)物(第2次PCR)、5.0 μL 10×Buffer、0.5 μL dNTP(10 mmol/L each)、0.5 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、1.0 μL引物(50 μmol/L，上、下游引物各0.5 μL)，最后用ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，進行25 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海美吉生物醫(yī)藥科技公司測序[26]。

1.3 統(tǒng)計分析

利用Mothur 1.30.1計算豐富度指數(shù)(Sobs和Chao 1指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener和Simpson指數(shù))，并進行多樣性分析。利用Version 1.9.1分析屬(Genus)分類水平上不同樣品的AM真菌群落組成。利用Canoco 4.5中的冗余分析(RDA)明確AM真菌群落組成與土壤環(huán)境因子間的關(guān)系?；赟pearman等級相關(guān)系數(shù)，繪制優(yōu)勢屬與環(huán)境因子相關(guān)性的Heatmap圖[27]。

圖1 不同生姜根際土壤樣品的豐富度稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of different sample richness of soil in ginger

2 結(jié)果與分析

2.1 MiSeq測序結(jié)果

MiSeq測序結(jié)束后，共獲得299680條有效序列，最終劃分為312個AM真菌操作分類單元(OTU)，隸屬于1域1界1門1綱5目6科7屬13種。采用隨機抽樣方法，以抽到的序列數(shù)與其對應(yīng)的OTUs數(shù)構(gòu)建豐富度稀釋曲線(圖1)。從圖1可看出，隨著測序量的不斷增大，各樣品的OTUs數(shù)增加趨于平緩，說明測序量能覆蓋樣本中的絕大部分物種。從圖2可看出，Shannon-Wiener曲線趨于平緩，測序數(shù)據(jù)達到飽和狀態(tài)，說明樣品的大部分多樣性已經(jīng)產(chǎn)生，測序數(shù)據(jù)量足夠大。

圖2 不同生姜根際土壤樣品的Shannon-Wiener曲線Fig.2 Shannon-Wiener curves of different samples of soil in ginger

表2 生姜根際土壤中AM真菌的Alpha多樣性指數(shù)

2.2 患病生姜和健康生姜根際土壤的AM真菌多樣性

以Sobs指數(shù)和Chao 1指數(shù)評估AM真菌的物種豐富度，結(jié)果(表2)表明不同土壤樣品AM真菌的豐富度存在差異；Chao 1指數(shù)的總體變化趨勢與Sobs指數(shù)表現(xiàn)一致，Chao 1指數(shù)隨著Sobs指數(shù)的升高而升高；所有患病生姜土壤樣品的Sobs指數(shù)和Chao 1指數(shù)均高于對應(yīng)健康生姜土壤樣品的Sobs指數(shù)和Chao 1指數(shù)。以Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評估AM真菌的物種多樣性，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)所有健康生姜土壤樣品的多樣性均高于患病生姜土壤樣品。

2.3 不同采樣點生姜根際土壤的AM真菌群落組成

在屬分類水平上，312個OTUs被分類為4個屬和1個其他類別，4個屬分別為類球囊霉屬(Paraglomus)、無梗囊霉屬(Acaulospora)、球囊霉屬(Glomus)和球囊霉綱未分類的屬(unclassified_c_Glomeromycetes)。從圖3可看出，LCJ1_S、FGJ_S、LCB1_S和FGB_S樣品的優(yōu)勢AM真菌屬均為Glomus，且球囊霉屬占比超過60%；NGJ_S和NGB_S樣品的優(yōu)勢AM真菌屬為Acaulospora；KJJ2_S樣品的優(yōu)勢AM真菌屬為Glomus，KJB2_S樣品的優(yōu)勢AM真菌屬為unclassified_c_Glomeromycetes；BMJ1_S樣品的優(yōu)勢AM真菌屬為unclassified_c_Glomeromycetes，BMB1_S樣品的優(yōu)勢AM真菌屬為Glomus。說明不同樣地生姜根際土壤的AM真菌群落存在差異，但健康生姜根際土壤(KJJ2_S、BMJ1_S、LCJ1_S、FGJ_S、NGJ_S)的AM真菌群落組成總體上較患病生姜根際土壤(KJB2_S、BMB1_S、LCB1_S、FGB_S、NGB_S)稍微豐富。

圖3 不同采樣點生姜根際土壤AM真菌在屬水平上的相對豐度 Fig.3 The relative abundance of AM fungi community on genus level at different sampling point

2.4 患病生姜和健康生姜根際土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)的偏最小二乘法(PLS-DA)判別分析

患病與健康生姜土壤樣品的PLS-DA分析結(jié)果(圖4)表明，第一主成分(COMP1)可解釋變量方差的13.49%，第二主成分(COMP2)可解釋變量方差的14.03%，累計方差貢獻率為27.52%；不同土壤樣品在坐標系中的分布存在明顯差異，健康生姜土壤樣品與患病生姜土壤樣品在橫坐標軸可明顯區(qū)分并聚成兩個類群，說明健康生姜根際土壤的AM真菌群落組成與患病生姜根際土壤存在明顯差異。此外，通過PLS-DA分析中樣本點分布的離散情況(圖4)也可看出，患病生姜土壤樣品不同個體的微生物菌群組成差異較明顯。

2.5 環(huán)境因子與真菌群落組成的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

將測得的土壤理化性質(zhì)作為環(huán)境因子與土壤樣品真菌群落組成進行冗余分析，結(jié)果(圖5)表明，有效P含量對土壤AM真菌的群落組成影響顯著(P<0.05，下同)，全N、有機質(zhì)(Organic)、Mg含量和pH對AM真菌的群落組成無顯著影響(P>0.05)。其中，在土壤速效P含量較高時，生姜生長對土壤中AM真菌的依賴性較小，AM真菌群落組成較簡單，而在土壤速效P含量較低時，生姜生長對土壤中AM真菌的依賴性較大，AM真菌群落組成較豐富。通過Heatmap圖分析不同環(huán)境因子對生姜根際土壤AM真菌屬水平群落組成的影響，結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn)Paraglomus與有效P含量呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與有機質(zhì)含量呈顯著負相關(guān)。可見，土壤有效P含量是主導土壤AM真菌群落組成的主要因子，健康生姜根際土壤的有效P含量普遍偏高于患病生長根際土壤，AM真菌群落組成也相對豐富。

圖4 患病生姜和健康生姜根際土壤AM真菌的PLS-DA分析結(jié)果Fig.4 Analysis of soil AM fungi PLS-DA in healthy and diseased groups

圖5 土壤理化性質(zhì)與AM真菌群落結(jié)構(gòu)的冗余分析結(jié)果Fig.5 Redundant analysis of soil physicochemical properties and classification level of AM fungi

3 討 論

本研究利用Illumina MiSeq測序技術(shù)首次探討患姜瘟病生姜和健康生姜根際土壤AM真菌的群落結(jié)構(gòu)，其中，使用特異性引物進行土壤AM真菌的SSU rDNA擴增，實測的AM真菌OTUs數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)的稀釋曲線均能達到平緩期，說明本研究中AM真菌的豐富度和多樣性均能較好地描述患姜瘟病生姜和健康生姜根際土壤的AM真菌群落。已有研究表明，病害發(fā)生能引起其根際土壤真菌富集，土壤真菌數(shù)量和致病真菌的種類均明顯增加[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，柳州市三都鎮(zhèn)、桂林市全州縣、柳州市柳城縣、百色市德?？h和百色市田林縣5個樣地患病生姜根際土壤AM真菌的OTUs數(shù)和豐度均高于健康生姜根際土壤，但真菌的多樣性降低，與劉海洋等[30]的研究結(jié)果相似，說明姜瘟病的發(fā)病程度不是單純由菌源數(shù)量決定，微生物數(shù)量高的姜田不能有效降低姜瘟病發(fā)病率，而土壤中的青枯菌數(shù)量才是決定姜瘟病發(fā)生的主導因素；生姜根際土壤球囊霉屬和無梗囊霉屬的相對豐度較高，其中有些樣品中球囊霉屬占比超過60%，與前人[31-32]對長期施肥農(nóng)田、內(nèi)蒙古鹽堿土及青藏高原自然生態(tài)系統(tǒng)AM真菌群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果相似，說明球囊霉屬和無梗囊霉屬AM真菌在很多生態(tài)環(huán)境中均占據(jù)重要地位，能適應(yīng)不同的環(huán)境條件。

圖6 環(huán)境因子與菌群相關(guān)性的Heatmap圖分析結(jié)果Fig.6 Correlation heatmap of environment factor and microflora

除地面植被外，土壤環(huán)境因子對AM真菌群落結(jié)構(gòu)也具有非常重要的影響。大量研究表明，土壤pH、有機質(zhì)和養(yǎng)分含量等均是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素[33-34]，但由于生姜在長期種植過程中土壤pH未發(fā)生明顯變化，因此其根際土壤pH不是影響AM真菌群落發(fā)生變化的關(guān)鍵因子。本研究冗余分析結(jié)果表明，影響AM真菌群落組成的主要因子是土壤有效P含量，與Xiang等[35]、Likar等[36]的研究結(jié)果一致，表明土壤有效P含量可影響植物對AM真菌的依賴性，當土壤速效P含量較高時，植物不需要過多依賴AM真菌就能獲得滿足自身生長需求的P，從而逐漸降低對AM真菌的依賴，影響AM真菌群落組成；土壤有機質(zhì)、全N、交換性Mg含量和pH與AM真菌群落組成的相關(guān)性不密切，與Xiang等[35]和Camenzind等[37]的研究結(jié)果存在差異，可能與開展研究地區(qū)土壤全N含量不同等有關(guān)。

4 結(jié) 論

健康生姜樣地和患病生姜樣地土壤的AM真菌群落組成存在明顯差異，患姜瘟病生姜根際土壤AM真菌的OTUs數(shù)和豐度均高于健康生姜根際土壤，但其多樣性低于健康生姜根際土壤；不同采樣點生姜根際土壤AM真菌的優(yōu)勢種屬存在差異，其多樣性、豐度及群落組成和群落結(jié)構(gòu)主要受有效P含量影響，健康生姜根際土壤的有效P含量高于患病生姜根際土壤。