范高福，劉 寅，梁延波,，付恩桃，湯 潔

1.合肥職業(yè)技術學院 合肥市教育名師工作室(安徽 合肥 238000) 2.上海海虹實業(yè)(集團)巢湖今辰藥業(yè)有限公司(安徽 巢湖 238000)

石榴(PunicagranatumL.) 為落葉灌木或小喬木，是石榴科石榴屬植物，別名安石榴、山力葉、丹若等，在我國南北地區(qū)均有栽培，而安徽懷遠石榴是國家地理標志產品，具有極高的營養(yǎng)價值和保健功效[1-3]。當前石榴主要以品種改良、果品、果飲深加工為主[4]，但加工過程中會產生石榴皮、石榴葉、石榴花、石榴籽等廢棄物，而文獻報道這些廢棄物均含黃酮醇類、多酚類、生物堿及有機酸等多種生物活性成分[5-9]。石榴皮提取物富含多酚類生物活性物質鞣花酸(EA)、沒食子酸(GA)、安石榴苷(Pu)，具有抑制氧化、消炎、抑菌殺菌、護肝、抗癌及降血糖等多種藥理作用[10-14]。因此，對石榴皮多酚類單體成分提取工藝的優(yōu)化，進一步拓展石榴皮變廢為寶再利用的價值具有廣泛的開發(fā)應用前景。研究表明[15-16]對多酚類單體成分EA或GA的檢測方法較多，但關于安徽本地石榴不同功能部位中鞣花酸、沒食子酸等多酚類生物活性物質的含量同時檢測的方法尚未見報道，本次實驗采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，對本地不同品種石榴皮提取物中GA、EA多酚類物質含量進行同時檢測并建立方法學，旨在為安徽本地石榴皮部位的成分的檢測標準及其提取物單體的深加工及臨床應用提供借鑒的研究方法。

1 材料與儀器

1.1材料與試劑安徽懷遠石榴，購自安徽省蚌埠市懷遠王氏榴園，經安徽中醫(yī)藥大學藥學院彭華勝教授鑒定為石榴科石榴屬石榴；石榴GA、EA自制(批號：20190725，石榴皮購自安徽省蚌埠市藥材公司，石榴GA、EA提取物干粉經安徽中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室檢測，純度≥90%)EA對照品：純度≥98%(sigma)；GA對照品：純度≥98%(sigma)；Milli-Q超純水，甲醇、乙腈為色譜純；其余所需試劑均為分析純；石榴皮干粉及其石榴皮提取物，本實驗室自制。

1.2儀器與設備Waters-e2695 HPLC系統(tǒng)：配有2998-PDA檢測器(美國沃特世公司)；Mnli-Q Biocel超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)；KL-020S型小型超聲波清洗器(深圳科力超聲波洗凈設備公司)；RE52CS-1型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；ME104E電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；WSY-106數(shù)顯恒溫水浴鍋(無錫市石油儀器設備有限公司)；SHZ-95B型實驗室循環(huán)水真空泵(上海申生儀器抽濾真空泵廠)，F(xiàn)D-1C-50冷凍干燥機(上海比朗儀器有限公司)等。

2 方法與結果

2.1 GA和EA檢測的色譜條件色譜柱：Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相含甲醇(A)-0.08%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～9 min，97%B；9～15 min，97%～70%B；15～30 min，70%B)，甲醇沖柱10 min，95%B平衡30 min。流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長270 nm，進樣體積10 μL[17]。在此色譜條件下，GA、EA特征峰峰型良好，無肩峰、拖尾等現(xiàn)象，見圖1。

注：A:GA對照品，B:EA對照品，C:樣品白玉石榴皮，D:樣品紅酸石榴皮。圖1 HPLC色譜圖

2.2 GA、EA對照品溶液的制備分別快速精密稱取GA對照品和EA對照品干粉適量，加50%甲醇溶解定量，配成52.50 μg/mL，50.80 μg/mL的對照品溶液，備用。

2.3 GA、EA檢測的供試品石榴皮溶液的制備精密稱取干燥石榴皮粉末，經三號篩過篩后，精密稱取0.252 0 g，加入容量瓶中，量取50%甲醇25 mL，稱重，超聲30 min，放冷，稱重，用50%甲醇補減失的質量，均勻震搖，通過多次抽濾制得濾液，經微孔濾膜(0.45 μm)精濾制得[18-19]。

2.4檢測波長的選擇對照品溶液采用二極管陣列檢測器PDA進行紫外全波長掃描，吸收輪廓線圖譜見圖2。結果表明EA在254 nm處有最大吸收(見圖2-A)，GA在215 nm和270 nm處有最大吸收(見圖2-B)，無干擾峰出現(xiàn)，且分離度較好。同時研讀相關文獻[17-18]，最終確定270 nm作為EA和GA同時檢測波長。

注：A：EA對照品，B：GA對照品。圖2 對照品溶液輪廓線掃描圖

2.5 GA、EA檢測的方法學考察

2.5.1 線性范圍 分別精密稱定GA、EA對照品干粉適量，加50%甲醇溶解定容至50 mL，搖勻即得。依次通過等度稀釋得到不同濃度GA溶液(212.400，106.200，53.100，26.550，13.275，6.637 μg/mL)和EA溶液(213.200，106.600，53.300，26.650，13.325，6.662 μg/mL)，每個濃度均進樣10 μL。以溶液濃度為橫坐標(X軸)，峰面積為縱坐標(Y軸)制作GA、EA響應的標準曲線，GA回歸方程為Y=28 352X+8 233.8(r=0.999 9)，EA回歸方程為Y=24 580X+8 857.7(r=0.999 9)。實驗結果表明GA在6.637 5～212.400 0呈線性關系，而EA在6.662 5～213.200 0 μg/mL呈線性關系。

2.5.2 精密度試驗 稱取樣品干粉0.25 g，依據2.3項下制備方法配制供試品溶液，設置進樣量為10 μL，連續(xù)進樣6次，測得GA和EA的峰面積RSD分別為0.3%和0.4%，表明該方法精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 量取GA和EA供試品溶液適量，分別在0，1，3，5，7，12，24 h進樣，進樣量為10 μL，測得GA和EA的峰面積RSD分別為1.0%和1.2%，表明該樣品在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復性試驗 稱取等份樣品干粉6份，取樣0.25 g，精密稱定，依據2.3項下方法配制供試品溶液，測定并計算GA和EA的RSD分別為1.7%和1.9%，表明該樣品制備方法具有較好的重復性。

2.5.5 加樣回收率試驗 稱取等份樣品干粉6份，精密稱定，分別準確加入GA適量，按2.3項下操作，測定含量并計算回收率；另取等份樣品干粉6份，精密稱定，分別準確加入EA適量，同法操作，見表1。

表1 石榴皮中GA和EA回收率試驗

2.5.6 樣品含量測定 取安徽蚌埠市懷遠產地石榴經典品種2種，分別為白玉石榴(A品種)和紅酸石榴(B品種)，依據2.3項下條件各自制備供試品石榴皮待測溶液，采用外標法同時測定石榴皮功能部位中EA與GA的含量，見表2。

表2 安徽懷遠石榴皮部位中EA、GA的含量(n=3)

3 討論

本實驗通過反相高效液相色譜法同時檢測本地石榴功能部位皮中生物多酚類物質GA、EA含量時，考察了不同溶劑對樣品中石榴多酚類物質GA、EA的溶解程度、提取量及提取效率，不同時間對樣品的浸漬與超聲萃取的影響，不同溫度下提取回流及濃縮中抗氧劑維生素C保護作用，結果顯示50%甲醇水溶液浸漬樣品約12 h，再超聲(500 W，40 kHz)萃取30 min，提取回流溫度90℃，可有效浸提樣品中GA、EA成分；80%丙酮浸漬約6 h，超聲(500 W，40 kHz)萃取1h，再用酸化甲醇液有利于石榴皮中游離GA、EA的生成，加入抗氧劑維生素C可減少GA、EA多酚類物質濃縮與純化過程中的氧化作用，且通過超聲預處理樣品也可以保護石榴皮提取物的抗氧化特性和生物活性。此外，在溶劑選擇上，通過不同濃度乙醇、甲醇、丙酮對石榴皮部位的提取干燥物進行溶解度對比實驗，結果發(fā)現(xiàn)半極性溶劑甲醇中的溶解度較好，且干擾雜峰較少，有利于石榴皮提取物干粉制備，從而優(yōu)選甲醇溶劑。

通過比較多個流動相組份(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-三氟乙酸溶液、乙腈-三氟乙酸溶液、甲醇-磷酸溶液)，多個流速(0.5，0.8，1.0 mL/min)，不同進樣量(5、10、20 μL)，不同pH值，依據根據色譜的基線、保留時間、分離度、面積、數(shù)目等，最終確定EA、GA流動相系統(tǒng)為甲醇-0.08%磷酸溶液梯度，流速1.0 mL/min，10 μL，柱溫30℃，通過PDA掃描，2個對照品色譜峰在270 nm均有較強的紫外吸收，優(yōu)選270 nm作為檢測波長，實現(xiàn)樣品峰和雜質峰分離。與曲文娟等[20]報道相比，GA保留時間基本一致，均為8～10 min之間，且不容易分離，但本實驗采用甲醇提取石榴皮中GA、EA多酚類成分的穩(wěn)定性更好，且流動相條件設置較為簡單易操作。

本課題組采集了安徽懷遠地區(qū)的不同優(yōu)良品種石榴皮樣品，對其中GA、EA總含量進行了測定，結果分析表明與紅酸石榴皮(B品種)相比，白玉石榴皮(A品種)所含GA和EA含量分別增加了0.13%和0.55%，從而為安徽本地石榴皮多酚類物質EA和GA質量控制提供參考。因此，本研究通過RP-HPLC初步建立了同時檢測安徽本地不同品種石榴皮中EA、GA含量方法，經方法學驗證，該檢測方法與現(xiàn)行版《中國藥典(2020年版)》0512中有關質量標準具有一致性[21]，且具有準確方便、靈敏穩(wěn)定、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢，可以作為石榴皮功能部位中GA、EA的含量檢測方法。