張琪，胡安琪，范倩，陳勝，肖細(xì)姬，張翠仙

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006

柑普茶是將云南普洱茶填入新鮮新會(huì)柑中，然后經(jīng)低溫烘干收縮貯存而成的一種新型茶品。因其味醇甘香，口感甚佳，得到眾多愛茶人士的青睞［1-2］。同時(shí)其兼具新會(huì)陳皮和云南普洱茶的功效［3］，具有保健養(yǎng)生的作用。新會(huì)陳皮作為國(guó)家地理標(biāo)志性產(chǎn)品，擁有幾百年的使用歷史［4-5］。陳皮有廣泛的藥理活性［6］，最被人們熟知的就是理肺健脾、化痰生津的功效［7］，一般被用來治療咳嗽多痰、滯食和消化不良等疾?。?］。但隨著對(duì)陳皮研究的逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)陳皮還具有防止心血管疾病［9-11］、抗血小板聚集［12］、抗衰老和抗氧化作用［13］。近年來隨著大家養(yǎng)生保健意識(shí)的加強(qiáng)，柑普茶更是深受人們喜愛。但柑普茶作為茶品，多以煎煮沖泡為主，盡管目前關(guān)于柑普茶溶出成分已有一些報(bào)道，但大多圍繞陳皮中橙皮苷、揮發(fā)性成分或黃酮類成分展開［1，14-15］。該研究旨在對(duì)陳皮的水溶性化學(xué)成分進(jìn)行綜合分析，以期從整體的角度為后續(xù)柑普茶全成分研究提供理論數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

TripleTOFTM5600+型三重四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（美國(guó)AB SCIEX 公司）。超高效液相系統(tǒng)：LC-30AD 高效液相色譜儀、SIL-30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器（日本Shimadzu 公司）；煎煮鍋（廣州文新電器有限公司）； Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；盧湘儀DD-5M 低速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Sartorius 賽多利斯十萬分之一天平（季爾國(guó)際貿(mào)易有限公司）。甲醇（色譜純，德國(guó)Merck 公司），超純水（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)平臺(tái)自制），乙腈（色譜純，德國(guó)默克Merck 公司）。柑普茶為市售新會(huì)產(chǎn)柑普茶（批號(hào)2016-1，3 年品）和鮮新會(huì)陳皮（批號(hào)2019-X1）均購(gòu)自廣州靳寶堂茶葉有限公司，鮮砂糖橘皮（購(gòu)自市場(chǎng)，批號(hào)2019-1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件ACE C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流動(dòng)相：φ=0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～2.5 min，90%～70% A；2.5～11.5 min，70%～10% A；11.5～16 min，0% A；PDA 全波長(zhǎng)掃描；柱溫30 ℃；體積流量0.7 mL/min；進(jìn)樣量4 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子化源（ESI），采用正離子掃描模式，掃描范圍m/z100～1 500，用腦啡肽作校正液，進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。正離子模式離子噴霧電壓（ISVF）：+5 500 eV；渦輪噴霧溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣壓力（GUR）：35 psi；霧化氣（Gas1）：55 psi；輔助氣（Gas2）：55 psi；解簇電位（DP）：100 V；碰撞能量（CE）：30 eV；碰撞能散布（CES）：15 eV；離子釋放延遲（IRD）：67 eV；離子釋放寬度（IRW）：25 eV；一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描范圍100～1 500；IDA 設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps 的8 個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍：100～1 500。

2.2 供試品溶液的配置

分別取適量干燥的柑普茶外果皮藥材（PGT）、鮮新會(huì)陳皮（CRC）和鮮砂糖橘皮（CT），粉碎后過2號(hào)篩。精密稱定3種樣品粉末各15.0 g 置于圓底燒瓶中，加入蒸餾水1 500 mL 并加熱回流提取5 h，靜置冷卻后用雙層紗布過濾，再濃縮并配置成10 mg/mL 的樣品溶液。取1 mL 溶液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液備用，等待進(jìn)行LC-MS檢測(cè)。

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1 數(shù)據(jù)庫(kù)建立使用Peak ViewTM軟件（版本1.2，AB SCIEX）對(duì)陳皮中水溶性成分進(jìn)行定性鑒別。首先，通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)和化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（CNKI、Chemspider、Web of Science、PubMed 和SciFinder 等），建立了一個(gè)屬于陳皮的化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，包括名稱、分子式和化學(xué)結(jié)構(gòu)式文件。

2.3.2 數(shù)據(jù)分析將數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入到Peak ViewTM軟件的XIC Manager 模塊對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行峰提取和匹配。提取參數(shù)設(shè)置如下：XIC intensity ＞50 counts，S/N ＞10，isotope ratio% difference ＜20，mass error ＜10×10-6。經(jīng)計(jì)算篩選后，軟件將各化合物的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)與軟件理論的數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，將匹配度大于75%且質(zhì)譜碎片裂解過程合理的結(jié)果作為陳皮中最終鑒別出來的化合物。

3 結(jié)果與結(jié)論

將供試品溶液按2.1項(xiàng)下檢測(cè)條件注入U(xiǎn)PLCQ-TOF-MS 系統(tǒng)進(jìn)行分析，得到PGT、CRC 和CT提取物正離子模式下的基峰圖（圖1）。對(duì)CRC 的目標(biāo)化合物色譜峰進(jìn)行提取和匹配，共有94 個(gè)色譜峰具有較完備的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過與相關(guān)參考文獻(xiàn)MS2數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合質(zhì)譜碎片離子信息及根據(jù)其推導(dǎo)出的質(zhì)譜裂解規(guī)律，對(duì)圖譜PGT 中47個(gè)、CRC中72個(gè)和CT中56個(gè)色譜峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果為黃酮類（PGT：44 個(gè)、 CRC：63 個(gè)、CT：50 個(gè)）、檸檬苦素類（PGT：1 個(gè)、后二者均4 個(gè)）、香豆素類（僅CRC：2 個(gè)）、生物堿類（PGT：1 個(gè)、CRC：2 個(gè)、CT：1 個(gè)）及環(huán)肽類化合物（均1 個(gè)）（見表1）。三者差異性成分主要體現(xiàn)在多甲氧基黃酮類成分和香豆素類成分上。

表1 PGT、CRC和CT的UPLC-Q-TOF-MS化學(xué)成分分析1）Table 1 Chemical Constituents of PGT，CRC and CT by UPLC-Q-TOF-MS

圖1 PGT、CRC和CT提取物在正離子模式下的基峰圖Fig.1 Base Peak Chromatogram(BPC)of extracts of PGT,CRC and CT in positive ion mode

3.1 黃酮（苷）類成分鑒定

PGT 的水提液中共鑒定到44 個(gè)黃酮類成分，包括4 個(gè)黃酮苷類和40 個(gè)多甲氧基黃酮類成分；CRC 的水提液中共鑒定到63 個(gè)黃酮類成分，包括17 個(gè)黃酮苷類與46 個(gè)多甲氧基黃酮類成分，其中黃酮苷類成分含量相對(duì)較高，而多甲氧基黃酮類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)更多樣。CT 中則鑒定50 個(gè)黃酮類成分包括33 個(gè)多甲氧基黃酮類成分和17 個(gè)黃酮苷類成分。而CRC 和CT 二者鑒定的黃酮苷類化合物主要為氧苷和碳苷兩大類，且一般鏈接1～2 個(gè)糖基。黃酮氧苷類化合物包括1 個(gè)7 位單糖基黃酮氧苷類（16）、8 個(gè)雙糖基黃酮氧苷類化合物（7、8、9、12、13、20、22和27），而黃酮碳苷類化合物則包括2個(gè)單糖黃酮碳苷類（11 和19）與4 個(gè)雙糖黃酮碳苷類化合物（2、5、6和10）。以橙皮苷（Hesperidin 13）與Lucenin-2（2）為例分別闡述黃酮氧苷和黃酮碳苷類化合物的裂解途徑。

化合物13 為典型的7 位黃酮氧苷類化合物，在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z611.197 6，分子式C28H34O15。MS2圖譜中出現(xiàn)糖苷鍵斷裂產(chǎn)生的標(biāo)志性碎片離子峰[M+H-Rha]+m/z465.138 6（圖2-Y 裂解，即脫去糖基而保留羥基），[M+H-Rha -O]+m/z449.144 4（圖2-Z 裂解，即同時(shí)脫去糖基和羥基） 與[M+H-Rha-Glc]+m/z303.085 7。由此可推斷該化合物為雙糖黃酮氧苷類化合物。MS2圖譜中的碎片離子峰[M+H-Rha-O-18]+m/z431.134 0 與[M+H-Rha-O-54]+m/z395.112 5推測(cè)為[M+H-Rha-O]+碎片離子峰進(jìn)一步裂解丟失H2O（18）所產(chǎn)生的。此外，MS2圖譜中還存在大量由于黃酮苷元母核C 環(huán)1，3 鍵發(fā)生RDA 裂解產(chǎn)生的1，3A 碎片離子峰[M+H-Rha-C9H10O2]+m/z315.086 0,[M+H-Rha-Glc-C9H10O2]+m/z153.017 8 等及其后續(xù)連續(xù)丟失H2O(18)所產(chǎn)生的碎片離子峰[M+H-Rha-O-C9H10O2-H2O]+m/z281.065 8、 [M+H-Rha-O-C9H10O2-2H2O]+m/z263.054 8 和[M+H-Rha- O-C9H10O2- 3H2O]+m/z245.044 1 等進(jìn)一步證明13 推斷無誤。碎片離子信息與文獻(xiàn)［16-18］研究一致，推斷其為橙皮苷（圖2）。

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

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續(xù)表

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由鑒定結(jié)果分析可知：黃酮氧苷類化合物在正離子模式下以發(fā)生糖苷鍵斷裂（圖2 中Y 裂解或Z 裂解）為特征性裂解方式，常見的碎片離子丟失包括C6H10O4（146）、C6H10O5（162）和C6H10O6（178）等。其苷元結(jié)構(gòu)可繼續(xù)丟失CH3+（15）和CO（28）等碎片，或在黃酮苷元C 環(huán)1，3 鍵位置發(fā)生RDA 裂解，此類裂解規(guī)律可作為黃酮氧苷類化合物結(jié)構(gòu)的重要鑒別途徑。

圖2 橙皮苷的質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 Mass spectrometric cracking pathway of Hesperidin

化合物2為典型的6，8-碳苷黃酮類化合物，在正離子模式下[M+H]+m/z611.161 6，分子式為C27H30O16。MS2圖譜中出現(xiàn)碎片離子峰[M+H-18]+m/z593.156 4，[M+H-36]+m/z575.142 2，[M+H-54]+m/z557.128 3，[M+H- 72]+m/z539.119 1 和[M+H-90]+m/z521.109 1 推測(cè)由準(zhǔn)分子離子峰連續(xù)丟失H2O（18）產(chǎn)生；同時(shí)出現(xiàn)碎片離子峰[M+H-324]+m/z287.052 3，推測(cè)由準(zhǔn)分子離子峰丟失兩分子葡萄糖基（C6H10O5，162）所得。此外，MS2圖譜中出現(xiàn)碎片離子峰[M+H-120]+m/z491.107 9，符合黃酮碳苷己糖六元環(huán)0，2 鍵開環(huán)裂解，丟失C4H8O4（120）的特點(diǎn)。碎片離子峰[M+H-2C4H8O4]+進(jìn)一步裂解可得到連接于黃酮苷元上的糖殘基丟失H2O（18）與CO（28）產(chǎn)生的碎片離子峰[M+H-2C4H8O4-H2O]+m/z353.066 3 和[M+H-2C4H8O4-H2O-2CO]+m/z299.052 8，由此可進(jìn)一步確認(rèn)該化合物為雙糖黃酮碳苷類化合物，碎片離子峰信息與文獻(xiàn)［16-18］研究一致，推斷其為L(zhǎng)ucenin-2（圖3）。

綜合分析發(fā)現(xiàn)：黃酮碳苷類化合物在正離子模式下以連續(xù)中性丟失H2O 碎片為主，常見糖環(huán)的開環(huán)裂解（圖3-X 裂解）與其殘留基團(tuán)中性丟失H2O（18）與CO（28）等碎片。糖環(huán)的0，2 鍵開環(huán)裂解是黃酮碳苷的特征裂解形式，己糖中性丟失C4H8O4（120），戊糖中性丟失C3H6O3（90），此類裂解規(guī)律可作為黃酮碳苷類化合物結(jié)構(gòu)的重要鑒別途徑。

圖3 Lucenin-2 的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Mass spectrometric cracking pathway of Lucenin-2

同時(shí)PGT、CRC 和CT 的水提液中共鑒定到40、46 個(gè)和33 個(gè)多甲氧基黃酮苷元類化合物。以3，5，6，7，8，3?，4?-七甲氧基黃酮（3，5，6，7，8，3?，4?-Heptemethoxyflavone，63）為例闡述多甲氧基黃酮類化合物的裂解途徑。化合物63 在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z433.147 7，分子式C22H24O9。 MS2圖譜中出現(xiàn)碎片離子峰[M+H-30]+m/z403.099 8 與[M+H-45]+m/z388.077 9，推測(cè)由準(zhǔn)分子離子峰連續(xù)丟失CH+（15）所產(chǎn)生；同時(shí)出現(xiàn)碎片離子峰[M+H-16]+m/z417.116 1，推測(cè)由準(zhǔn)分子離子峰丟失CH4（16）得到。MS2圖譜中出現(xiàn)大量以[M+H -nCH3]+為基礎(chǔ)進(jìn)一步丟失CO（28）及H2O（18）碎片離子峰如： [M+H-3CH3- CO]+m/z360.083 0、[M+ H-4CH3-CO]+m/z345.059 1、[M+H-4CH3-CO-H2O]+m/z327.051 2、 [M+H-4CH3-2CO]+m/z317.064 1、[M+H-4CH3-2CO- H2O]+m/z299.054 6、[M+H-4CH3-3CO]+m/z289.069 9、[M+H-4CH3-3CO-H2O]+m/z271.059 5 和[M+H-4CH3-4CO-H2O]+m/z243.064 4 等。由此可推斷該化合物為多甲氧基黃酮類化合物。此外，MS2圖譜中還出現(xiàn)碎片離子峰[M+H-267]+m/z165.053 7 推測(cè)為多甲氧基黃酮C 環(huán)0，2 鍵發(fā)生裂解，丟失C13H15O6（267）生成的0，2B 碎片。0，2B 碎片丟失CO（28）得到碎片離子峰[M+H-C13H15O6-CO]+m/z137.059 0。而碎片離子峰[M+H-192]+推測(cè)由于多甲氧基黃酮C 環(huán)1，3 鍵發(fā)生RDA 裂解導(dǎo)致1，3B 碎片（C11H12O3）丟失，此后繼續(xù)丟失CH3+(15)與CO (28)得到[M+HC11H12O3-2CH3]+m/z211.023 9、 [M+H-C11H12O3-2CH3-CO]+m/z183.028 8 等碎片離子峰。質(zhì)譜信息與文獻(xiàn)［19-20］研究一致，推斷其為3，5，6，7，8，3?，4?-七甲氧基黃酮。正離子模式下3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黃酮可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖4。多甲氧基黃酮類化合物在正離子模式下以連續(xù)丟失C碎片為特征裂解方式，后續(xù)可見丟失H2O 和CO，同時(shí)黃酮母核C環(huán)發(fā)生1，3鍵RDA裂解或0，2鍵開環(huán)裂解。

圖4 3，5，6，7，8，3?，4?-七甲氧基黃酮的質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 Mass spectrometric cracking pathway of 3,5,6,7,8,3?,4?-Heptemethoxyflavone

3.2 檸檬苦素類成分的鑒定

從PGT 中僅檢測(cè)到一個(gè)檸檬苦素類化合物（52），而CRC 和CT 的水提取物中則均鑒定到4 個(gè)檸檬苦素類成分，包括諾米林酸（Nomilinic acid 34）、檸檬苦素（Limonin 52）、諾米林（Nomilin 60）和Limonexic acid（71）。以諾米林為例闡述檸檬苦素類化合物的裂解途徑。

化合物60 正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z515.228 8，分子式為C28H34O9。MS2圖譜中出現(xiàn)碎片離子峰[M+H-46]+m/z469.228 5，暗示其由準(zhǔn)分子離子峰同時(shí)脫去一分子H2O（18）和CO（28）產(chǎn)生。同時(shí)[M+H-78]+m/z437.193 6 和[M+H-96]+m/z419.191 7 則由準(zhǔn)分子離子峰丟失CH3COOH（60）后連續(xù)丟失兩分子H2O（18）產(chǎn)生，[M+H-C2H4O2-2H2O]+進(jìn)一步裂解產(chǎn)生碎片離子峰[M+H-124]+m/z391.195 5，推測(cè)丟失CO（28）所得。此外，MS2圖譜中出現(xiàn)高強(qiáng)度碎片離子峰m/z161.060 9，推測(cè)由準(zhǔn)分子離子峰在高能碰撞轟擊下直接丟失C18H26O7（354）所得。檸檬苦素類化合物［21］出現(xiàn)碎片離子峰m/z161.06 是呋喃環(huán)連接內(nèi)酯環(huán)斷裂后留下的殘基，而CH3COOH（60）的丟失可能是由于發(fā)生了McLafferty 重排，確定其為檸檬苦素類化合物，推斷其為諾米林［21］，正離子模式下諾米林的質(zhì)譜裂解途徑見圖5。

圖5 諾米林的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Mass spectrometric cracking pathway of Nomilin

3.3 生物堿類成分的鑒定

從CRC 鑒定到2 個(gè)苯乙胺生物堿類化合物，分別為N-乙酰章魚胺（N-acetyl octopamine，3）和辛弗林（Synephrine，4）。而PGT 中僅檢測(cè)到了3，CT 中僅檢測(cè)到了4。以辛弗林4 為例闡述生物堿類化合物的裂解途徑。4 在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z168.101 8，分子式為C9H13NO2，MS2圖譜中出現(xiàn)高豐度碎片離子峰[M+H- 18]+m/z150.092 3，推測(cè)由準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子H2O（18）產(chǎn)生。同時(shí)MS2圖譜中可見碎片離子峰[M+H-33]+m/z135.069 4，推測(cè)由準(zhǔn)分子離子峰丟失一分子H2O（18）后發(fā)生α-斷裂脫去側(cè)鏈C（15）所產(chǎn)生。此外還見碎片離子峰[M+H-H2OCH3-14]+m/z121.065 1 與[M+H-H2O-CH3- 26]+m/z109.065 5，推測(cè)由碎片離子峰[M+H-H2O-CH3]+分別脫去N(14）或CN（26）所產(chǎn)生。碎片離子信息與文獻(xiàn)［22］研究一致，由此可推斷其為辛弗林，其正離子模式下可能質(zhì)譜裂解途徑見圖6。

圖6 辛弗林的質(zhì)譜裂解途徑Fig.6 Mass spectrometric cracking pathway of Synephrine

3.4 其他類成分的鑒定

此外從三者中均初步鑒定了環(huán)肽類化合物Citrusin Ⅲ（25），PGT 和CRC 中鑒定出簡(jiǎn)單香豆素類化合物東莨菪內(nèi)酯Scopoletin（17），CT 中鑒定出呋喃香豆素類化合物佛手酚（Bergaptol 1）。

4 討 論

UPLC-Q-TOF-MS 可以在合適液相條件分離基礎(chǔ)上，通過分析質(zhì)譜碎片信息快速鑒定物質(zhì)中含有的低含量成分。同時(shí)UPLC-Q-TOF-MS 的非數(shù)據(jù)依賴性采集技術(shù)（IDA）能夠無遺漏、無差異地獲得樣本中所有成分的全部碎片信息而不會(huì)造成低豐度離子信息的丟失，并且具有掃描點(diǎn)數(shù)均勻、定量準(zhǔn)確、數(shù)據(jù)可回溯性等優(yōu)點(diǎn)［23］，為化合物準(zhǔn)確鑒定提供了重要信息。柑普茶目前在市場(chǎng)上廣泛流通，不僅具有甘香濃郁的茶香更兼有陳皮藥理保健作用。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對(duì)柑普茶外層陳皮和鮮新會(huì)陳皮的水煎煮液進(jìn)行全成分分析，從柑普茶外果皮水煎煮液中初步鑒定了47 個(gè)成分、鮮陳皮中鑒定72 個(gè)成分，而從鮮砂糖橘皮水煎液中僅分析出56 個(gè)成分。主要為多甲氧基黃酮類成分（40 個(gè)、46 個(gè)和33 個(gè)）而黃酮苷類成分三者明顯存在差異，在柑普茶外果皮中僅鑒定出4個(gè)黃酮苷類成分，而二者鮮果皮中均鑒定出17 個(gè)。鮮果皮中均首次檢測(cè)到檸檬苦素類（34、52、60 和71） ，但在柑普茶外果皮中僅檢測(cè)到1個(gè)檸檬苦李素類成分。同時(shí)也未在柑普茶外果皮中檢測(cè)到香豆素類成分。Zheng 等［17］采用相同方法對(duì)42 批次陳皮鑒定的特征成分對(duì)比發(fā)現(xiàn)，黃酮及其苷類化合物種類數(shù)量相似，柑普茶外果皮檢測(cè)到的多氧基黃酮苷元類成分與多批次陳皮中鑒定的成分種類和數(shù)量相似，而鮮砂糖桔此類成分明顯減少。對(duì)于生物堿類成分而言，柑普茶外果皮檢測(cè)到的生物堿成分僅為1個(gè)，而鮮新會(huì)陳皮檢測(cè)到2 個(gè)，而砂糖橘外果皮也檢測(cè)到1 個(gè)，明顯比42批次陳皮的生物堿種類數(shù)量（4個(gè)）少。此現(xiàn)象是否與柑普茶的制作方式有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。通過本研究也發(fā)現(xiàn)砂糖橘外果皮與柑普茶外果皮化學(xué)成分具有較大差異，是否可以曬制成類似柑普茶一樣的茶品值得進(jìn)一步探討。本研究為進(jìn)一步深入研究柑普茶全成分分析提供理論數(shù)據(jù)，對(duì)后續(xù)柑普茶的化學(xué)成分和藥理活性研究的深入研究提供了理論支撐。