左俊麗，白巨星(西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 ,西安 710100)

關(guān)鍵字:哮喘；程序性死亡分子1；干擾素-γ；白介素-4；Th 細(xì)胞

哮喘為一種氣道慢性炎癥性疾病，由嗜酸性粒細(xì)胞、T 細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與，導(dǎo)致反復(fù)的氣道高反應(yīng)性和氣道重塑，常表現(xiàn)為氣短、胸悶、氣促和咳嗽的反復(fù)發(fā)作，接觸外界刺激時(shí)易發(fā)作，常于夜間和清晨發(fā)作或加劇[1-2]。近年來，哮喘的發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)增加趨勢(shì)，目前難以徹底治愈，主要以防治為主，早期診斷早期干預(yù)對(duì)哮喘的控制和治療有重要的意義[3]。輔助性T 細(xì)胞(helper T cell)，簡(jiǎn)稱為Th 細(xì)胞，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，能分泌多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生多種白細(xì)胞介素，參與激活被感染細(xì)胞溶酶體酶[4-5]。白細(xì)胞介素-4(interleukin-4, IL-4)和干擾素- γ(interferon-γ, IFN-γ)是Th1 和Th2 細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，在哮喘發(fā)病的多個(gè)環(huán)節(jié)中均有參與[6]。程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1, PD-1）為一種55 kDa 的跨膜蛋白，在細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4 胞膜外區(qū)和氨基酸有24%的同源性，PD-1 為負(fù)性協(xié)同刺激受體之一，能表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面[7-8]。Th 細(xì)胞、PD-1，IL-4 和IFN-γ 在氣道炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮了重要作用。因此本研究通過測(cè)定并比較支氣管哮喘患者與正常成人肺功能以及血清Th 細(xì)胞、PD-1，IL-4，IFN-γ 水平以及T細(xì)胞亞群的差異，研究以上指標(biāo)在支氣管哮喘發(fā)病中的作用及意義，具體如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年9月～2020年9月就診于我院的80 例哮喘患者為研究組，男性37例，女性43 例，平均年齡49.2±7.3 歲，病程1～9年，F(xiàn)EV1（70.94±8.43）%，F(xiàn)EV1/預(yù)計(jì)值百分比（72.98±10.42）%。另以同期在本院體檢的80 例健康成人為對(duì)照組，其中男性38 例，女性42 例，平均年齡48.9±7.5 歲，F(xiàn)EV1（103.78±11.56）%，F(xiàn)EV1/預(yù)計(jì)值百分比（89.23±7.32）%，兩組基本信息性別構(gòu)成、年齡等經(jīng)分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合診斷標(biāo)準(zhǔn)《支氣管哮喘防治指南》[9]；②年齡≥20 歲；③在入組前一個(gè)月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素類藥物；④檢測(cè)前未使用β2 受體激動(dòng)劑。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有膿毒血癥、敗血癥等疾病者；②易過敏體質(zhì)者；③并發(fā)心肺疾病、寄生蟲疾病等；④近期有手術(shù)、創(chuàng)傷和感染者。

本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的準(zhǔn)許，患者及家屬均充分了解研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 瑞士ndd EasyOne 便攜式肺功能儀；貝克曼庫(kù)爾特Optima XPN 超速離心機(jī)（型號(hào)：XPN-100/90/80）；人PD-1，IFN-γ 和IL-4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；克隆抗體間接免疫熒光抗體（賽默飛世爾科技）；熒光單細(xì)胞內(nèi)染色試劑盒（美國(guó)BIO-SOURCE 公司）；單克隆抗體間接免疫熒光試劑盒（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）等。

1.3 方法

1.3.1 肺功能測(cè)定: 對(duì)研究組和對(duì)照組的肺功能進(jìn)行肺功能檢測(cè)，采用肺功能儀檢測(cè)兩組第1 秒鐘用力呼氣容積（FEV1）和FEV1 占預(yù)計(jì)值%并進(jìn)行比較。

1.3.2 PD-1，IFN-γ 和IL-4 的檢測(cè)：清晨采集兩組研究對(duì)象的空腹靜脈血3 ml，室溫下放置30min后，于4 ℃下3 000r/min 離心15 min，取上層血清于-80℃下保存待檢。采用ELISA 法檢測(cè)PD-1，IFN-γ和IL-4表達(dá)水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.3.3 Th 細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè):兩組研究對(duì)象均采集肝素抗凝血2 ml，采用熒光單細(xì)胞內(nèi)染色法檢測(cè)Th1/Th2，采用單克隆抗體間接免疫熒光法檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞亞群，均采用對(duì)應(yīng)試劑盒并按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以 SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清PD-1，IFN-γ 和IL-4 的水平及肺功能指標(biāo)FEV 和FEV1/預(yù)計(jì)值百分比比較 見表1。對(duì)兩組對(duì)象的血清PD-1，IFN-γ 和IL-4 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)并比較，研究組的PD-1 和IFN-γ 水平均顯著低于對(duì)照組，研究組的IL-4 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。研究組肺功能指標(biāo)FEV1 和FEV1/預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%pred）均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 兩組血清PD-1，IFN-γ 和IL-4 的水平及肺功能指標(biāo)FEV 和FEV1/預(yù)計(jì)值百分比比較（±s）

表1 兩組血清PD-1，IFN-γ 和IL-4 的水平及肺功能指標(biāo)FEV 和FEV1/預(yù)計(jì)值百分比比較（±s）

項(xiàng) 目 對(duì)照組(n=80) 研究組(n=80) t P PD-1（%） 18.93±8.45 0.18±0.04 19.847 ＜0.001 IF N-γ（pg/ml ） 803.54±521.98 587.75±294.37 3.221 0.002 IL-4（pg/ml） 768.36±573.65 1216.87±822.84 3.999 ＜0.001 FEV1(%) 103.78±11.56 70.94±8.43 20.530 ＜0.001 FIV1/%Pred(%) 89.23±7.32 72.98±10.42 11.414 ＜0.001

2.2 兩組外周血Th 細(xì)胞占比情況比較 見表2。對(duì)兩組的Th 細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析，研究組Th1細(xì)胞占比以及Th1/Th2 比值顯著低于對(duì)照組，Th2細(xì)胞占比顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 兩組外周血Th 細(xì)胞占比情況比較（±s）

表2 兩組外周血Th 細(xì)胞占比情況比較（±s）

項(xiàng)目 對(duì)照組(n=80)研究組 (n=80) t P Th1（%） 16.43±2.49 11.32±2.19 13.783 ＜0.001 Th2（%） 16.02±5.43 19.79±4.32 4.860 ＜0.001 Th1/Th2 1.02±0.23 0.57±0.19 13.492 ＜0.001

2.3 兩組外周血T細(xì)胞亞群占比情況比較 見表3。對(duì)兩組的T 細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)分析，兩組CD3+水平無顯著差異（P＞0.05），研究組CD4+水平顯著高于對(duì)照組，CD8+水平和CD4+/CD8+比值顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表3 兩組外周血T 細(xì)胞亞群占比情況比較（±s）

表3 兩組外周血T 細(xì)胞亞群占比情況比較（±s）

項(xiàng)目 對(duì)照組(n=80)研究組(n=80) t P CD3+（%） 61.13±3.46 60.45±4.11 1.132 0.259 CD4+（%） 33.01±1.55 36.51±2.19 11.668 ＜0.001 CD8+（%） 29.97±1.28 27.13±2.37 9.431 ＜0.001 CD4+/ CD8+ 1.17±0.23 1.45±0.14 9.301 ＜0.001

3 討論

哮喘的發(fā)病過程涉及了T 淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及肥大細(xì)胞等，其中T 淋巴細(xì)胞發(fā)揮了重要的免疫調(diào)節(jié)作用。Th 細(xì)胞平衡失調(diào)學(xué)說為一個(gè)發(fā)病機(jī)制研究熱點(diǎn)，Th 細(xì)胞對(duì)B 淋巴細(xì)胞合成IgE 有促進(jìn)作用，而抑制性T 細(xì)胞可抑制IgE 合成，有研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者血液中Th 細(xì)胞增多，功能增強(qiáng)[10-11]。

Th 細(xì)胞根據(jù)其表面標(biāo)志、轉(zhuǎn)錄因子和所分泌細(xì)胞因子可分為Th1，Th2，Treg 和Th17 等亞群，其中Th1 和Th2 細(xì)胞數(shù)目和功能的失衡在哮喘發(fā)病過程中影響較大[12]。Th1可以產(chǎn)生IFN-γ和IL-2等，主要作用是抵御細(xì)胞內(nèi)感染以及細(xì)胞免疫應(yīng)答，與多種器官的特異性自身免疫病有關(guān)；Th2 可以產(chǎn)生IL-4，IL-5 和IL-6 等，主要用于防御細(xì)胞外感染，其表達(dá)異常與超敏反應(yīng)有關(guān)[13]。T 淋巴細(xì)胞主要通過IL-4 促進(jìn)IgE 的合成，Th1 分泌的IFN-γ 可抑制Th2 的功能從而抑制IgE 的合成，由此說明Th1/Th2 細(xì)胞的失衡是哮喘發(fā)病的重要因素之一[14]。

IL-4 是由Th2 細(xì)胞產(chǎn)生的可以促進(jìn)體液免疫并抑制細(xì)胞免疫的細(xì)胞因子，可以通過促進(jìn)IgE 而引起肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的增多，嗜酸性粒細(xì)胞的生長(zhǎng)分化以及富集，使Th2 免疫反應(yīng)過強(qiáng)；又可抑制Th1 分泌，減少IFN-γ 的產(chǎn)生，使Th1 反應(yīng)低下[15]。IFN-γ 是由Th1 產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在機(jī)體一氧化氮途徑中能舒張氣管，并抑制平滑肌細(xì)胞DNA 的合成[16]。PD-1 為一種55 kDa 的跨膜蛋白，在CTLA-4 胞膜外區(qū)和氨基酸有24%的同源性，PD-1 為負(fù)性協(xié)同刺激受體之一，能表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面。PD-1 有PD-L1 和PD-L2 兩個(gè)配體，其中PD-L1 表達(dá)于單核細(xì)胞，活化后PD-L1 表達(dá)量下調(diào)，而PD-L2 在激活后被誘導(dǎo)[17]。PD-L1 能抑制Th1，使IL-4 生成增多，增強(qiáng)氣道高反應(yīng)性，而PD-L2 能抑制Th2 增加IFN-γ 的表達(dá)，降低氣道高反應(yīng)性。PD-1/PD-L1 通路可通過抑制Th17 細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)限制哮喘的嚴(yán)重程度，因此哮喘的發(fā)生可能與PD-1/PD-L1 調(diào)節(jié)軸缺陷有關(guān)[12]。PD-1/PD-L1 可以維持T 細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，PD-1 缺乏時(shí)外周免疫耐受狀態(tài)被破壞，引起多種免疫疾病的發(fā)生，PD-1 是免疫應(yīng)答負(fù)性調(diào)節(jié)的重要因子。本研究中，研究組的PD-1 和IFN-γ 水平均顯著低于對(duì)照組，IL-4 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明PD-1 的低表達(dá)可能與哮喘患者體內(nèi)T 細(xì)胞的異?；罨?、呼吸道特異性炎性反應(yīng)有關(guān)，與文獻(xiàn)[12]結(jié)論一致。另外，本研究?jī)山M外周血Th 細(xì)胞和T 細(xì)胞亞群占比情況比較結(jié)果表明：哮喘的發(fā)生伴隨著淋巴細(xì)胞亞群比例的失衡，因此CD4+/CD8+比值的穩(wěn)定在維持細(xì)胞免疫水平中有重要作用，與相關(guān)研究結(jié)論一致[18]。

綜上所述，哮喘患者血清PD-1 水平降低，IL-4 水平增高，抑制了Th1 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，并使Th1/Th2 和CD4+/ CD8+平衡狀態(tài)破壞，各細(xì)胞及細(xì)胞因子相互制約、相互調(diào)節(jié)，構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)哮喘的診斷治療有重要意義。