門 琛，邵永豐，馬路遙，黃浩斌，鄭翔翔（通訊作者）

（1 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年科 江蘇 南京 210029）

（2 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科 江蘇 南京 210029）

主動(dòng)脈夾層（aortic dissection, AD）是主動(dòng)脈疾病中最嚴(yán)重的一種臨床疾病，起病急、發(fā)展快、病情復(fù)雜、病死率和誤診率高。據(jù)主動(dòng)脈夾層國際登記組織（International Registry of Acute Aortic Dissections,IRAD）分析，推算出男性發(fā)病率為16/10 萬，女性發(fā)病率為9.1/10 萬[1]。AD 的發(fā)病特點(diǎn)在于中膜病變，內(nèi)膜撕裂而造成血液經(jīng)撕裂口進(jìn)入動(dòng)脈壁中形成夾層。根據(jù)Stanford 夾層分型，A 型主動(dòng)脈夾層（type A aortic dissection, AAD）累及升主動(dòng)脈，也可累及主動(dòng)脈弓、胸降主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈；Stanford B 型夾層累及胸降主動(dòng)脈，可同時(shí)累及腹主動(dòng)脈[2]。其中以AAD 最為危險(xiǎn)，外科手術(shù)是其主要救治方法，但手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高，手術(shù)花費(fèi)巨大。因此，如何預(yù)防AD 的發(fā)生發(fā)展，降低其病死率仍然是當(dāng)前臨床醫(yī)療急需解決的問題。近年來不斷有研究證實(shí)了炎癥反應(yīng)在主動(dòng)脈壁重塑及夾層形成過程中起重要作用[3]。炎癥小體（Inflammasome）是一種調(diào)控IL-1β產(chǎn)生的大分子多蛋白復(fù)合體，NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD, ASC）和前體蛋白pro-Caspase-1 參與了NLRP3炎癥小體的組成。炎癥小體在自身免疫性疾病及血管粥樣硬化中的重要性已被充分證明[4]，但在主動(dòng)脈瘤及主動(dòng)脈夾層形成機(jī)制中研究較少。本研究旨在明確NLRP3炎癥小體在AAD 中的表達(dá)，探討其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在AAD 發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年1 月—2021 年1 月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科收治的A 型主動(dòng)脈夾層急診行升孫氏手術(shù)（升主動(dòng)脈置換+主動(dòng)脈弓替換+象鼻支架植入）的患者作為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組為同期在我在院行心臟移植的供體。兩組在年齡方面進(jìn)行匹配，每組各15 例。兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。排除標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病至急診手術(shù)時(shí)間超過24 h；②患者有自身免疫性疾病、結(jié)締組織病或長期服用激素；③某些遺傳性疾病，如馬凡綜合征、先天性二葉式主動(dòng)脈瓣；④慢性肝腎功能不全。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2020-SR-450），所有患者在入組前均簽署知情同意書。

表1 兩組臨床資料比較

1.2 組織標(biāo)本收集

AAD 組選取在升主動(dòng)脈夾層破口附近的主動(dòng)脈壁組織。主動(dòng)脈壁組織離體后立即剔除外周脂肪及血栓，并用0.9%氯化鈉溶液沖洗，一部分組織-80 ℃液氮保存，另一部分組織甲醛固定。對(duì)照組為在本中心行心臟移植，供心移植前修剪棄用的升主動(dòng)脈壁組織，保存方式和AAD 組相同。

Western blotting。將主動(dòng)脈組織剪碎，將其加入RIFA 裂解緩沖液取上清液。使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，上清液置于-70 ℃冰箱保存。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，加熱后再取上清加樣后進(jìn)行蛋白電泳。利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離總蛋白，并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）。分別加NLRP3、ASC、caspase-1、炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的特異性一抗4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST 洗滌3 遍后，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫反應(yīng)，ECL 化學(xué)發(fā)光顯色。由自動(dòng)曝光儀曝光拍照，用Image J 軟件（National Institutes of Health）對(duì)目標(biāo)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.3 免疫組化

免疫組化檢測(cè)主動(dòng)脈壁樣品中CD68 細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）。制備福爾馬林固定和石蠟包埋的切片，并與CD68（Abcam, Cambridge, MA, USA）的一抗在4 ℃下溫育過夜，然后用二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木精復(fù)染。用蓋玻片安裝切片并在光學(xué)顯微鏡下檢查。用Olympus 顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察、拍照。高倍鏡（×400）下觀察切片標(biāo)本，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)（Image-Pro plus, version 6.0, Media Cybernetics）測(cè)定陽性信號(hào)平均光密度值（IOD/area）作為陽性染色的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組患者主動(dòng)脈壁炎癥小體及相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平比較

AAD 組患者主動(dòng)脈壁中炎性小體的組成成分，即NLRP3、ASC 和caspase-1 的蛋白水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AAD 組主動(dòng)脈壁中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 蛋白水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組升主動(dòng)脈壁組織中炎性小體及炎癥因子表達(dá)水平比較（± s）

表2 兩組升主動(dòng)脈壁組織中炎性小體及炎癥因子表達(dá)水平比較（± s）

AAD 組對(duì)照組tP NLRP3140.5±12.1109.6±9.77.780.035 ASC243.4±14.690.7±4.233.100.012 caspase-1167.7±21.1 103.2±12.210.240.029 IL-1β140.2±17.6119.3±5.63.590.042 IL-6155.0±23.6111.3±4.15.950.034 TNF-α132.5±11.498.5±9.47.430.031

2.2 兩組患者主動(dòng)脈壁CD68 表達(dá)水平比較

AAD 組患者升主動(dòng)脈組織中CD68（5.31±0.51），免疫組化定量分析其表達(dá)量高于對(duì)照組的（1.23±0.11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.006），即AAD 患者升主動(dòng)脈壁的炎性表達(dá)較對(duì)照組更加明顯，炎癥反應(yīng)在AAD 患者主動(dòng)脈血管平滑肌組織上有明顯的表現(xiàn)。見圖1。

圖1 主動(dòng)脈平滑肌組織中CD68 分布（×400）深色為CD68 分布的區(qū)域

3.討論

動(dòng)物及人體研究均發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈夾層發(fā)生時(shí)血管局部炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，表現(xiàn)為大量單核巨噬細(xì)胞、多核白細(xì)胞及T/B 淋巴細(xì)胞浸潤，血管平滑肌細(xì)胞（vascularsmooth musclecells, VSMC）凋亡相關(guān)miRNAs 表達(dá)增多，炎癥相關(guān)miRNAs 水平顯著增加[5-6]。本文結(jié)果觀察到AAD 患者的主動(dòng)脈平滑肌組織中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤均較對(duì)照組顯著升高，炎性細(xì)胞標(biāo)記物CD68 的表達(dá)量也明顯增加。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AAD 患者主動(dòng)脈平滑肌中炎性小體組成蛋白NLRP3、ASC、caspase-1 的水平明顯升高，其下游炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的蛋白水平也顯著升高。這些結(jié)果表明NLRP3 炎癥小體活化，下游炎性細(xì)胞因子釋放增加介導(dǎo)了主動(dòng)脈血管平滑肌的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致了AAD 的形成。因此我們推測(cè)炎癥小體在這種炎癥介質(zhì)反應(yīng)的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)可能是導(dǎo)致AAD 炎癥機(jī)制的一個(gè)重要調(diào)控點(diǎn)。

綜上所述，炎癥小體可作為探索A A D 中導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，主動(dòng)脈血管重塑的信號(hào)傳導(dǎo)和功能機(jī)制研究的新靶點(diǎn)，并且可以作為預(yù)測(cè)主動(dòng)脈夾層病變發(fā)展的新型生物標(biāo)志物和藥物治療A A D 的新靶點(diǎn)。