文/任 冰 盧 鴦 王一薇 王曉晴 沈金金

絲綿是以蠶絲為原料加工而成的綿絮、被用材料。用絲綿作為填充物的蠶絲被因具有保暖、輕柔、舒適等優(yōu)良特性而備受消費(fèi)者青睞，已成為中國(guó)絲綢行業(yè)主打終端產(chǎn)品[1]。由于蠶絲是一種較為珍貴的資源，蠶絲綿的市場(chǎng)價(jià)值較高，一些不法商家受利益驅(qū)使，通過(guò)人為添加物質(zhì)對(duì)絲綿進(jìn)行增重，嚴(yán)重?cái)_亂了絲綿及蠶絲被市場(chǎng)的健康發(fā)展，侵害消費(fèi)者利益[2-3]。因此，GB/T 24252—2019《蠶絲被》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定“蠶絲填充物不得進(jìn)行增重處理，蠶絲總氨基酸含量實(shí)測(cè)結(jié)果應(yīng)不低于95%”。

氨基酸分析儀在食品、飼料等樣品的氨基酸含量測(cè)定中較多被采用[4-6]，但因該儀器設(shè)備價(jià)格昂貴且專(zhuān)屬性強(qiáng)，在紡織類(lèi)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室較少配備，因此，GB/T 24252—2019《蠶絲被》標(biāo)準(zhǔn)制定中考慮到檢測(cè)方法的推廣而采用柱前衍生-液相色譜法，即蠶絲經(jīng)水解后通過(guò)柱前衍生，再經(jīng)過(guò)液相色譜對(duì)氨基酸衍生物的測(cè)定來(lái)得到17種氨基酸含量。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜因結(jié)合了液相色譜的分離功能和質(zhì)譜的高選擇性、高特異性和高靈敏度等特點(diǎn)，尤其適用于多種目標(biāo)化合物的篩查和確證分析。近年來(lái)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在茶葉、乳品、化妝品等產(chǎn)品的氨基酸分析中也得到了較多應(yīng)用[7-9]。本文通過(guò)優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，建立了采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定17種氨基酸含量的方法，不需要衍生化，儀器分析過(guò)程在10 min內(nèi)完成。方法應(yīng)用于5批實(shí)際絲綿樣品檢測(cè)和判定，得到與增重定性試驗(yàn)一致的結(jié)論。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UltiMate 3000/TSQ Quantum Ultra，賽默飛世爾科技有限公司）；恒溫烘箱（FD115型，賓德公司）；真空干燥箱（DZF-6020型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；分析天平（感量0.0001g，梅特勒-托利多公司）；超純水系統(tǒng)（默克密理博公司）。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（Dr. Erenstorfer公司）：精氨酸（純度91.3%）、賴(lài)氨酸（純度88.19%）、組氨酸（純度99.9%）、苯丙氨酸（純度99.0%）、酪氨酸（純度99.6%）、亮氨酸（純度99.9%）、異亮氨酸（純度99.5%）、蛋氨酸（純度99.0%）、纈氨酸（純度99.3%）、胱氨酸（純度99.3%）、丙氨酸（純度99.9%）、甘氨酸（純度99.77%）、脯氨酸（純度99.59%）、谷氨酸（純度98.0%）、絲氨酸（純度99.9%）、蘇氨酸（純度99.9%）、天冬氨酸（純度99.7%）。乙酸銨、甲酸（色譜純，美國(guó)ROE公司）；乙腈（色譜純，艾利拓公司）；氮?dú)猓兌葹?9.99%）。

方法試驗(yàn)及應(yīng)用絲綿樣品采購(gòu)自市場(chǎng)和絲綿生產(chǎn)企業(yè)，共5批，每批數(shù)量不少于200g，均為100%桑蠶絲絲綿。

1.2 絲綿酸解方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取20mg絲綿樣品置于水解管中，加入10mL濃度為6mol/L的鹽酸，放置于冰水（0℃）中冷凍1min～2min，然后抽真空（近0Pa），充入氮?dú)?，再抽真空充氮?dú)?，重?fù)3次后在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口。封口后的水解管放置于（110±2）℃恒溫烘箱中，水解24h。取出水解管，冷卻至室溫，混勻、開(kāi)管，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水多次沖洗水解管，并轉(zhuǎn)移至容量瓶中，定容至刻度。吸取1mL水解液，放置在真空干燥箱中，于60℃下蒸發(fā)至干。準(zhǔn)確加入2mL、濃度為0.01mol/L的鹽酸，充分溶解后經(jīng)0.45mm微孔膜過(guò)濾后進(jìn)行儀器分析。

1.3 儀器分析條件

色譜柱：Hypesil Gold C18（100mm×2.1mm，1.9mm）； 流動(dòng)相： 0.01mol/L乙酸銨水溶液（含0.2 %甲酸）：乙腈=95∶5（體積比）；恒定流速：0.2mL/min；柱溫： 25℃；進(jìn)樣量：10.0μL；檢測(cè)模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式，使用ESI源，正離子方式；噴霧電壓：4000V；傳輸毛細(xì)管溫度：300℃；蒸發(fā)溫度：350℃；掃描時(shí)間：0.8s；特征離子及碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 氨基酸的主要質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

氨基酸由于帶有氨基（—NH2）和羧基（—COOH），所以具有兩性電解質(zhì)性質(zhì)，采用電噴霧源（ESI）離子源時(shí)，正離子模式較負(fù)離子模式下響應(yīng)值更高。將各氨基酸分別配成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用直接針泵方式進(jìn)樣，在正離子模式下以各目標(biāo)化合物準(zhǔn)確的［M+H］+峰為母離子，進(jìn)行 MRM 模式的二級(jí)質(zhì)譜優(yōu)化分析，選出信號(hào)較強(qiáng)的二級(jí)碎片子離子及各自的碰撞能量等參數(shù)，所得氨基酸的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

在色譜條件優(yōu)化中，重點(diǎn)考察了甲酸、乙酸胺對(duì)氨基酸離子化效率的影響。當(dāng)流動(dòng)相中未添加甲酸時(shí)，丙氨酸不能正常出峰，同時(shí)異亮氨酸和亮氨酸保留時(shí)間相近，不能分離，見(jiàn)圖1(a)。當(dāng)流動(dòng)相中加入適量甲酸后，異亮氨酸和亮氨酸可完全分離，見(jiàn)圖1(b)。加入甲酸各氨基酸的響應(yīng)值變化不明顯，且丙氨酸的響應(yīng)值始終較低。

圖1 (a) 流動(dòng)相未添加甲酸時(shí)異亮氨酸與亮氨酸的分離色譜圖 (b) 流動(dòng)相中添加0.2 %甲酸時(shí)異亮氨酸與亮氨酸的分離色譜圖

為了解決丙氨酸響應(yīng)低的問(wèn)題，我們嘗試在流動(dòng)相中加入乙酸胺，以期提升該氨基酸的離子化程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入0.01mol/L乙酸銨后，丙氨酸的響應(yīng)明顯提升、峰形良好。通過(guò)條件優(yōu)化，最終以含0.2 %甲酸的0.01mol/L乙酸銨水溶液和乙腈為流動(dòng)相，體積比95∶5。在優(yōu)化后的色譜條件下，17種氨基酸均能有效分離且峰形良好，儀器分析過(guò)程在10 min內(nèi)完成。

2.3 方法評(píng)價(jià)

利用逐級(jí)稀釋法配制氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的色質(zhì)譜分析條件下，考察了所建立方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量檢出限(LOQs)（以色譜峰面積10倍信噪比計(jì)算），結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，甘氨酸、丙氨酸等8種氨基酸在50μg/L～500μg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，其余9種氨基酸的線性范圍為5μg/L～200μg/L，定量檢出限在0.07mg/g～2.34 mg/g范圍內(nèi)，能滿(mǎn)足絲綿中氨基酸的含量測(cè)定要求。選取1個(gè)樣品，通過(guò)對(duì)同一個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定7次，各氨基酸含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%，其中胱氨酸和蛋氨酸因含量低于檢出限而未計(jì)算。

表2 氨基酸的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量檢出限和重復(fù)性

2.4 方法應(yīng)用

對(duì)來(lái)源于市場(chǎng)和生產(chǎn)企業(yè)的5批絲綿樣品分別按照本方法進(jìn)行了總氨基酸含量的測(cè)定，同時(shí)按GB/T 24252—2019附錄D的方法進(jìn)行增重定性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 5個(gè)絲綿樣品的氨基酸含量與增重定性試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，采用本文方法測(cè)得2#、4#絲綿樣品的總氨基酸含量均大于95%，所對(duì)應(yīng)的水解液均無(wú)沉淀析出，為正常的絲綿，而1#、3#、5#樣品的氨基酸含量在38.9%～62.7%范圍內(nèi)，低于75%，所對(duì)應(yīng)的水解液有不同程度的沉淀析出，同時(shí)證實(shí)這3批絲綿樣品中添加了其他非蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)。

3 結(jié)論

本文介紹了基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定17種氨基酸的方法。分析了色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化過(guò)程，對(duì)方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量檢出限及重復(fù)性等進(jìn)行了評(píng)價(jià)，方法應(yīng)用于5批絲綿樣品的試驗(yàn)判定。形成結(jié)論如下：

（1）在優(yōu)化后的色譜、質(zhì)譜條件下，17種氨基酸均能有效分離并響應(yīng)良好，定量檢出限在0.07mg/g～2.34mg/g范圍內(nèi)，能滿(mǎn)足絲綿中氨基酸含量測(cè)定的要求。

（2）與柱前衍生-液相色譜法相比，本方法不需要進(jìn)行衍生反應(yīng)，樣品水解完成后可直接上機(jī)測(cè)試，儀器分析過(guò)程在10 min內(nèi)完成，檢測(cè)過(guò)程更簡(jiǎn)單、快速。

（3）采用本方法應(yīng)用于絲綿樣品發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)增重處理的絲綿樣品總氨基酸含量明顯降低，在識(shí)別絲綿增重上更準(zhǔn)確。