付茵茵，閆文瀟，王友曉，龐彩紅，李雙云，周繼磊，閔旭峰，劉盛芳，臧真榮，亓玉昆，夏 陽

（1山東省林業(yè)科學研究院/山東省林木遺傳改良重點實驗室，濟南 250014；2山東農業(yè)大學林學院，山東 泰安 271018；3中山陵園管理局，南京 210014；4山東省林木種苗和花卉站，濟南 250014；5棗莊市山亭區(qū)自然資源局，山東 棗莊 277100）

0 引言

國內鹽堿地總面積達9913萬hm2，從沿海到內陸均有分布，約占全國土地面積的10%，分布在23個省、市、自治區(qū)[1]，且面積還在不斷增加，這既是經濟、社會和生態(tài)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙因子，也是重要的后備土地資源[2]。土壤鹽堿化已經成為備受矚目的全球性問題[3-5]。改良和利用鹽堿土已經成為確?！案丶t線”不被突破，農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要手段[6]。Ren等[7]通過對水稻開展鹽脅迫適應性的基礎研究，選育和培育出了許多耐鹽堿性強的水稻品種，大大提高了作物在鹽堿地上的產量，使通過選育和培育耐鹽堿性強的植物品種種植在鹽堿地上成為生物改良的主要手段。相關研究表明，植物形成了一系列復雜的生理機制，包括激素調節(jié)、滲透調節(jié)、活性氧清除、多胺及信號分子調節(jié)等來抵抗鹽脅迫[5,8]。因此，通過研究鹽脅迫下植物的生理指標進行綜合定量評價，是耐鹽植物新品種選育的重要依據。

國槐(Sophora japonica)屬于豆科(Leguminocae)蝶形花亞科(Papilionoideae)肉果屬(Styphnolobium)，又名槐樹、家槐、黑槐、槐花木、守宮槐、槐花樹、豆槐、金藥樹等[9]，是中國栽培最為普遍的集觀賞、藥用、材用等多用途為一體的人文鄉(xiāng)土樹種[10]。目前關于植物鹽脅迫的研究常見于水稻、黃蜀葵、甜瓜等農作物和中草藥等草本植物[11-13]，木本植物的耐鹽性研究主要集中在楊樹、柳樹和絨毛白蠟[14-16]等樹種上，國槐的鹽脅迫研究僅見于氣孔導度和光合作用的研究[17-18]，對于鹽脅迫的研究鮮有報道。篩選作物的耐鹽品種且加以利用是鹽堿土改良和利用的有效措施[3,19]，分析鹽脅迫下植物的生理效應和分子機制是培育耐鹽植物的關鍵[20]。鑒于此，筆者以收集的山東省1000余份種質資源為基礎，通過田間耐鹽實驗，篩選出4份在不同地域鹽堿地上生長優(yōu)良的無性系，以山東省現有良種為對照，以5個無性系盆栽2年生植株為試材，運用主成分分析對其綜合評價抗性指標進行，以期了解其在鹽脅迫下的抗逆機理，同時為合理選用鹽堿地造林材料提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以山東省林業(yè)科學研究院選育的無性系564（A處理）、‘華夏’（B處理）、‘華碩’（D處理）、‘嫣紅3號’（E處理）4份無性系為試材，山東省國槐良種‘魯槐1號’（C處理）為對照進行實驗。

供試材料為2年生嫁接苗。2017年3月8日從苗圃挖取幼苗，移栽至裝有培養(yǎng)土（按土7份、沙2份，腐熟有機肥1份比例配制）的塑料花盆（外口徑38 cm、內口徑32 cm、高28 cm、底部直徑25 cm）內育苗。盆土17 kg，每個無性系栽30盆，每盆1株。

試驗在山東省濟南市歷城區(qū)的山東省林業(yè)科學研究院實驗苗圃智能溫室（溫度25～35℃，濕度70%～90%）內進行。

1.2 研究方法

每個無性系各選取24株冠形均勻長勢基本一致、莖粗大致相同的苗木進行實驗，在嫁接口高為10 cm處平茬，對苗木進行常規(guī)養(yǎng)護管理，土壤含水量一般維持在70%～90%。于2017年8月1日進行NaCl濃度0‰、0.2‰、0.4‰、0.6‰處理，各處理按照盆土干重所加NaCl質量分別為0、34、68、102 g。將NaCl溶液澆入盆中，每個處理重復6株。每盆苗木下放置塑料托盤，以防止土壤溶液流失，在每次澆水后把托盤內液體回澆到盆內，以保持盆內土壤的含鹽量。整個實驗處理過程為45天，并在9月14日8:30采樣，用冰袋冷藏帶回實驗室。

1.3 實驗方法

1.3.1 生長指標測定 實驗開始前，測定每個處理內參試苗木苗高H0和地徑B0，實驗結束后再測定苗高H1和地徑B1，苗高增長量為H1-H0，地徑增長量為B1-B0，測量工具為鋼卷尺和游標卡尺。實驗結束時，測定參試苗木的生物量。將參試苗木的根系、枝條、葉子用水清洗干凈后于105℃烘箱烘干至恒重，使用電子秤稱量質量。

1.3.2 生理指標測定 葉綠素含量測定采用乙醇提取法；細胞膜透性測定采用電導儀法測定；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法測定；脯氨酸(Pro)含量測定采用酸性茚三酮法；SOD活性測定采用NBT還原法；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法；CAT活性測定采用紫外吸收法[21]。

1.3.2 數據處理 實驗數據處理及柱狀圖的繪制使用Microsoft Excel進行，用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析、多重比較（Duncan’s法）及主成分分析，采用主成分分析法對5個無性系的耐鹽堿能力進行綜合評價。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對苗高增長量的影響

由圖1可以看出，5個國槐無性系的苗高增長量隨著NaCl處理濃度的增加而明顯下降?！A夏’在4‰和6‰NaCl脅迫下高生長量均高于對照，‘華夏’和‘華碩’在4‰NaCl處理下的苗高增長量最大，且與對照及其他無性系差異達到顯著水平，在6‰NaCl處理下‘華夏’與其他無性系苗高增長量差異達到顯著水平。無性系的苗高增長量較對照水平下降幅度最小的為‘華夏’(49.8%)，下降幅度最大的為無性系564(62.1%)。

圖1 NaCl脅迫對苗高增長量的影響

2.2 NaCl脅迫對地徑增長量的影響

由圖2可以看出，5個無性系的地徑增長量隨著NaCl處理濃度的增加表現出下降的趨勢?！A夏’在4‰處理和6‰處理下的地徑增長量均是最大，且與其他無性系地徑增長量差異達到顯著水平。在4‰處理下，‘華夏’地徑增長量較對照下降幅度最小，為25.78%，其次為‘華碩’(33.36%)和‘嫣紅3號’(34.21%)，下降幅度最大的為無性系564(39.46%)。

圖2 NaCl脅迫對地徑增長量的影響

2.3 NaCl脅迫對生物量的影響

如圖3所示，5個國槐無性系的生物量隨著NaCl處理濃度的增加而下降。在對照和2‰處理下，生物量最大的為無性系456，最小的為‘嫣紅3號’，但各無性系生物量差異不顯著，且兩種水平下，生物量差異不明顯，表明在2‰處理下，國槐無性系受抑制程度非常小，可正常生長。在4‰NaCl處理下，生物量最大的為‘華夏’，與其他無性系差異顯著，與對照相比，其下降幅度為18.08%，受抑制程度最小，其次為‘華碩’，與對照相比其下降幅度為23.61%，苗木生長受到抑制；在6‰處理下，生物量最大的為‘華夏’，與其他無性系差異顯著，與對照相比，其下降幅度為30.44%，生物量最小的為‘嫣紅3號’，與其他無性系差異顯著，與對照相比，其下降幅度為38.54%，苗木生長受到明顯抑制。

圖3 NaCl脅迫對生物量的影響

2.4 NaCl脅迫對葉綠素含量的影響

隨著NaCl處理濃度的增加，各無性系的葉綠素含量均呈下降趨勢（圖4）。與對照相比，在2‰處理下，‘華夏’的葉綠素含量下降幅度最小，為5.82%，‘華碩’的下降幅度最大，為32.29%，葉綠素含量排在前3位的為‘華夏’、‘魯槐1號’、無性系564，與已推廣良種‘魯槐1號’差異不顯著。此時，苗木還能正常生長。在4‰處理下，‘嫣紅3號’葉綠素含量下降幅度最小(16.17%)，無性系564下降幅度最大(35.30%)，葉綠素含量排在前3位的為‘嫣紅3號’、‘魯槐1號’、‘華碩’。在6‰處理下，葉綠素含量最大的為‘華夏’。‘嫣紅3號’葉綠素含量下降幅度最小(39.16%)，無性系564下降幅度最大(48%)，NaCl脅迫的抑制作用達到最大。

圖4 NaCl脅迫對葉綠素含量的影響

2.5 NaCl脅迫對MDA含量的影響

隨著NaCl處理濃度的增加，各無性系的丙二醛含量均呈上升趨勢（圖5）。與對照相比，在2‰處理下，5個國槐無性系的增幅均在500%以上，MDA含量較低的為‘華碩’、‘嫣紅3號’、‘華夏’，與‘魯槐1號’差異顯著。在4‰NaCl處理下，5個國槐無性系的增幅明顯增大，MDA較低的為‘華碩’、‘華夏’、‘嫣紅3號’，與‘魯槐1號’差異顯著。在6‰處理下，5個國槐無性系的增幅明顯增大，MDA最低的為‘華夏’，與‘魯槐1號’差異顯著。在2‰和4‰NaCl處理下MDA含量一直較低的‘華碩’在6‰處理下急劇增長，表明‘華碩’并不耐高鹽。

圖5 NaCl脅迫對MDA含量的影響

2.6 NaCl脅迫對SOD活性的影響

隨著NaCl處理濃度的增加，各無性系的SOD活性均呈現出先增大后減小的趨勢（圖6）。與對照相比，在2‰NaCl處理下，5個國槐無性系的SOD活性達到最大，與對照相比，增幅由大到小依次為‘華夏’、‘華碩’、‘嫣紅3號’、‘魯槐1號’、無性系564。在4‰和6‰NaCl處理下，SOD活性出現下降，‘魯槐1號’和‘華碩’活性較大，高于‘嫣紅3號’、‘華夏’和無性系564。

圖6 NaCl脅迫對SOD活性的影響

2.7 NaCl脅迫對CAT活性的影響

由圖7可以看出，在不同濃度NaCl處理下，國槐葉內CAT活性較對照有明顯增長，在脅迫初期CAT活性隨處理濃度的增加呈上升趨勢，且‘華夏’和‘魯槐1號’在4‰鹽濃處理下活性值達到最大，而后其活性呈下降趨勢，而無性系564和‘華碩’在2‰和4‰NaCl處理下活性值相當，推測這2個無性系的CAT活性值高峰應出現在2‰到4‰值高峰應處理之間，‘嫣紅3號’的CAT在2‰處理下達到最高值。由此推測，‘嫣紅3號’、無性系564和‘華碩’比‘華夏’和‘魯槐1號’更早在CAT活性值上達到高峰，在耐鹽抗逆方面不如后者。

圖7 NaCl脅迫對CAT活性的影響

2.8 NaCl脅迫對POD活性的影響

由圖8可以看出，在不同濃度NaCl處理下，國槐葉內POD活性呈先增長后下降的趨勢，在脅迫初期POD活性隨處理濃度的增加呈上升趨勢，在4‰處理下活性值達到最大，而后其活性呈下降趨勢，說明4‰處理是國槐能承受的最大閾值。在4‰處理下，‘華夏’和‘魯槐1號’POD活性值最大。在6‰NaCl處理下，‘華碩’活性值最低，且與其他無性系差異顯著，由此推測，‘華夏’和‘魯槐1號’在耐鹽抗逆性方面優(yōu)于其他無性系，且‘華碩’比其他無性系不耐高鹽。

圖8 NaCl脅迫對POD活性的影響

2.9 NaCl脅迫對細胞膜透性的影響

隨著NaCl處理濃度的增加，各國槐無性系的細胞膜透性均表現出逐漸升高的趨勢（圖9）。在4‰處理下，5個國槐無性系的膜透性與對照相比明顯增大，除‘嫣紅3號’外其他國槐增幅均在61%以上?！碳t3號’、‘華碩’膜透性較低，與其他無性系差異顯著。在6‰NaCl處理下，各國槐無性系的膜透性達到最大，‘華碩’膜透性最高，是最低‘華夏’的1.21倍，膜透性較低的為‘華夏’和‘嫣紅3號’，與其他國槐無性系差異顯著。

圖9 NaCl脅迫對細胞膜透性的影響

2.10 NaCl脅迫對脯氨酸含量的影響

隨著NaCl處理濃度的增加，各國槐無性系的脯氨酸含量均呈上升趨勢（圖10）。在2‰處理下，5個國槐無性系的脯氨酸含量差異并不顯著。在4‰NaCl處理下，‘魯槐1號’、‘華碩’、‘嫣紅3號’脯氨酸含量最高，顯著高于其他無性系。在6‰NaCl處理下，‘華夏’、‘華碩’脯氨酸含量最高，與其他無性系差異顯著。

圖10 NaCl脅迫對脯氨酸含量的影響

2.11 各指標的相關性分析

對6‰NaCl處理下的5個無性系各項指標進行相關性分析，結果（表1）表明，苗高增長量與生物量、葉綠素、MDA、脯氨酸呈相關性，MDA與細胞膜透性、SOD、POD、生物量呈相關性，脯氨酸與CAT呈相關性。生長指標和生理指標之間以及生理指標和生理指標之間都存在明顯的相關性，因此，在研究植物應對鹽脅迫的適應機制時應將兩者聯合起來進行綜合評價。

表1 各指標相關性分析

2.12 主成分分析

用5個無性系的10個生長及生理生化指標進行主成分分析，對各無性系的耐鹽堿能力進行綜合評價。由表2可知，在4‰NaCl處理和6‰NaCl處理時，3個主成分的累積貢獻率分別為91.597%和94.306%。

表2 耐鹽指標主要特征值及貢獻率

根據各性狀對應的特征向量值可知，在4‰NaCl處理下，對第1主成分影響較大的為地徑增長量、生物量、POD活性值這3個性狀，其特征向量值分別為0.897、0.936和0.873，且都為正相關。對第2主成分影響較大的為苗高增長量、SOD活性值以及細胞膜透性這3個性狀，其特征向量值分別為0.764、0.741和-0.809，其中苗高增長量、SOD活性值為正相關，細胞膜透性為負相關。對第3主成分影響較大的為MDA活性值、SOD活性值以及CAT活性值這3個性狀，其特征向量值分別為0.499、0.569和0.716，都為正相關。在6‰NaCl處理下，對第1主成分影響較大的為地徑增長量、生物量、葉綠素含量3個性狀，其特征向量值分別為0.980、0.922和0.940，且都為正相關。對第2主成分影響較大的為SOD活性值，它的特征向量值為0.840，為正相關。對第3主成分影響較大的有地徑增長量和POD活性值，這2個性狀的特征向量值為0.431和0.402，都為正相關。

由表3得出，在4‰NaCl處理下，根據3個主成分值的大小得到各無性系的耐鹽堿能力由強到弱為‘華碩’、‘華夏’、‘魯槐1號’、無性系564、‘嫣紅3號’。在6‰NaCl處理下，根據3個主成分值的大小得到各個無性系的耐鹽堿能力由強到弱為無性系‘華夏’、‘魯槐1號’、‘華碩’、無性系564、‘嫣紅3號’?！A夏’和‘華碩’耐鹽性明顯高于其他無性系，適宜在鹽堿地推廣應用，可作為城市生態(tài)綠化建設國槐首選品種。

表3 主成分值

3 結論

研究結果表明，各無性系耐鹽性由強到弱為‘華夏’＞‘華碩’＞‘魯槐1號’＞‘嫣紅3號’＞無性系564。國槐幼苗中的SOD、POD和CAT活性變化趨勢為先上升后下降，在土壤鹽分質量濃度為2‰時，SOD活性達到最大值，在4‰時POD和CAT活性達到最大值，可以認為國槐所能承受的鹽脅迫臨界濃度在2‰～4‰之間，超過這個濃度就構成了鹽脅迫，這對增強國槐抗氧化性能有積極意義，為后期進行國槐幼苗抗鹽性鍛煉提供了依據。

在本研究中，為綜合評價5個無性系的耐鹽性，使用了10個指標（生長指標及生理生化指標）來進行綜合評價，但要想得到較為全面的評價結果還應考慮植物內源激素含量、根系活力、根尖陽離子流變化等多方面因素。同時，筆者是以兩根一干的嫁接苗盆栽數據為基礎進行的耐鹽性研究，林木的生長受到各種因素的影響，其對環(huán)境的相應和適應性在不同時期會發(fā)生變化，因此成年樹木的實際耐鹽能力如何，還需進一步檢驗。

4 討論

非生物脅迫下，植物的形態(tài)結構、滲透調節(jié)物質和抗氧化酶系統(tǒng)等生理生化指標、離子濃度及蛋白和基因等方面都會做出響應。其中，最直接的表現就是生長量和生物量的抑制[22]。因此，生長指標被認為是評價育種材料耐鹽堿能力的最直接的鑒定指標[23]。本研究中，利用苗高增長量、地徑增長量、生物量3個生長指標對5個無性系進行排序，‘華夏’和‘華碩’均排在前2位，為耐鹽性較好的無性系。

植物細胞質膜是細胞與外界環(huán)境的一道分界面，對維持細胞的微環(huán)境和正常的代謝起著重要作用。當植物器官在遭受逆境傷害時，會首先作用于這層由類脂和蛋白質構成的生物膜，其表現往往為細胞膜透性增大，細胞內部分電解質外滲，因此，在鹽脅迫下，細胞膜透性增加的越少，說明植物的耐鹽性越強。本實驗中，5個國槐無性系的細胞膜透性都持續(xù)增強，這與林雪峰[24]對3種濱海植物的研究結果一致。在6‰NaCl處理下，‘華夏’和‘華碩’的膜透性明顯低于其他3個無性系，具有較強的耐受性，為耐鹽性較強的無性系。

鹽漬、干旱、高低溫等逆境脅迫都會影響植物對水分的吸收而造成細胞水分虧損，這時植物細胞就會通過主動形成滲透調節(jié)物質來提高溶質濃度，降低細胞內水勢，以利于從外界獲得水分，提高植物對逆境的抗性來適應環(huán)境。脯氨酸就是一種理想且重要的有機滲透調節(jié)物質，它分子量小、水溶性高，在生理pH范圍內無靜電荷，以游離狀態(tài)存在于植物體內且毒性低[25]。在鹽漬脅迫下，植物會迅速積累脯氨酸并進行滲透調節(jié)，以維持細胞一定的含水量和胞內膨壓，來增強自身的耐鹽能力和抗逆性。Kemble等[26]于20世紀中期首次在受旱的多年生黑麥草葉片中發(fā)現了游離脯氨酸的積累。劉旻霞以6種甘南亞高山草甸植物為研究樣本，分析發(fā)現隨著逆境脅迫的加劇，6種植被葉片內脯氨酸含量都有不同程度的增加；而且不同的植物品種之間脯氨酸含量的增加幅度也有差異，認為葉片內脯氨酸含量的高低可作為衡量植物抗逆性的指標[27]。脯氨酸累積可以提高滲透脅迫耐受性，Furlan等[28]通過對2個耐旱性差異較大的花生品種進行研究發(fā)現，脯氨酸生物合成基因在水分脅迫下都有增加，而脯氨酸分解代謝基因的相對表達量在脅迫過程中僅在敏感品種中增加，進一步了解了脯氨酸在逆境保護中的作用。在本研究中，‘華夏’和‘華碩’的脯氨酸含量在6‰NaCl處理下，顯著高于其他無性系，具有更強的滲透調節(jié)能力以適應鹽脅迫環(huán)境。

植物在遭受鹽脅迫或者其他環(huán)境脅迫時，體內活性氧代謝增強，產生的過量過氧化物自由基會對細胞膜造成傷害，進而造成蛋白質、脂膜和其他細胞組分的損傷，由此植物自身會相應地提高抗氧化酶的活性，消除活性氧，減輕逆境條件下活性氧對植物的傷害。植物體內的抗氧化酶一般包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)，這些抗氧化酶組成了植物體內的酶促清除系統(tǒng)，在清除過量的自由基和過氧化物、抑制膜脂質過氧化、保護細胞免遭自由基傷害等方面起著重要作用[29]。其中，SOD可以催化O2-發(fā)生歧化反應生成O2和H2O2，是植物體內活性氧自由基清除系統(tǒng)的第一道防線；POD主要清除植物體內因逆境產生的和SOD催化反應產生的過量H2O2；CAT則主要分解和清除植物體內的過氧化氫自由基。丙二醛(MDA)是質膜過氧化產物[30]，其含量高低在一定程度上反映了植物細胞膜的受損害程度[31]。在本實驗中，NaCl脅迫下，國槐體內SOD、POD、CAT活性都是隨著NaCl濃度的增高呈現先上升后下降的變化趨勢，并且SOD首先在2‰脅迫下達到頂峰，POD、CAT則是在4‰NaCl脅迫下達到頂峰。這是由于國槐體內活性氧的主要代謝途徑是由SOD催化超氧自由基，再由POD和CAT共同協(xié)作來清除SOD催化O2-的產物，這也就解釋了SOD比POD和CAT更早出現活性值高峰。同時在相關性分析中，MDA含量與SOD活性呈現顯著正相關，這與兩者參與的代謝過程一致相關。

葉綠素是植物細胞葉綠體的重要組成部分，具有吸收、傳遞和轉換光能的功能，在植物進行光合作用的過程中發(fā)揮著重要的作用。植物受到鹽脅迫時，葉綠素的合成受到影響，而葉綠素的降解進程加快，從而使葉綠素的含量降低，進而影響到植物的生長發(fā)育，所以，葉綠素含量可以輔助評價植物無性系耐鹽性的高低。本實驗中，5個國槐無性系的葉綠素含量均隨著NaCl處理濃度的增大而降低，這與楊傳寶等對白楊派無性系的研究結果一致[32]。在3種濃度的NaCl處理下，葉綠素含量下降幅度最小的為‘華夏’和‘華碩’，表現出較高的耐鹽性。