萬人源，馬會杰，蔣 賓，楊麗冉，周大鵬，和明珠，楊廣容

（1云南農(nóng)業(yè)大學茶學院，昆明 650201；2恩施州農(nóng)業(yè)科學院，湖北恩施 445000；3宜賓職業(yè)技術(shù)學院，四川宜賓 644003）

0 引言

土壤是茶樹賴以生存的基質(zhì)，茶園土壤養(yǎng)分狀況是影響茶葉產(chǎn)量品質(zhì)的重要因素[1-2]。茶樹在長期適應熱帶和亞熱帶高溫、高濕氣候條件和土壤強淋溶生態(tài)環(huán)境的過程中，形成了其如喜溫喜濕、喜酸嫌鈣、喜銨厭硝、聚鋁富錳等特性，茶園土壤特殊的生態(tài)環(huán)境造就了其獨特的微生物群落結(jié)構(gòu)[3-4]。微生物群落的組成結(jié)構(gòu)、活性及多樣性很大程度上決定了土壤中的營養(yǎng)元素循環(huán)和土壤的肥力，是反映土壤質(zhì)量及評價土壤生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性的重要生物學指標[5-7]。

大量研究表明，茶園土壤微生物真菌類群有：鞭毛菌亞門、接合菌亞門、子囊菌亞門、擔子菌亞門、半知菌亞門，其中茶園有益微生物有固氮微生物、菌根真菌、茶樹病原拮抗真菌等，并且，茶園土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)與數(shù)量隨著植被種類、土壤肥力與pH、季節(jié)與降水、茶樹品種、植茶年限、耕作、施肥管理等因子的改變而發(fā)生相應的變化[3,8-11]。茶樹是富含多酚的植物，研究表明：富含低分子酚類化合物的凋落物會增加所有微生物的生物量，尤其是真菌[12-13]；目前已從茶園土壤中分離出很多的真菌優(yōu)勢菌種，如：如青霉菌、木霉菌、曲霉菌、白僵菌、綠僵菌、鐮刀菌等，其中很少有茶樹根部的病原菌，它們中的一部分昆蟲病原真菌類群，是茶園病蟲害生物防治的重要種群[14-16]。因此，研究茶園土壤真菌及細菌群落結(jié)構(gòu)對茶園生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

為提高茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)，中國茶葉栽培化肥和農(nóng)藥施用不斷增長，茶葉的種植面臨許多挑戰(zhàn)，如茶園土壤酸化、肥力退化及茶園生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性下降及病蟲害滋長爆發(fā)等，嚴重威脅茶葉生產(chǎn)的持續(xù)發(fā)展[17-18]。提高茶葉種植的效率和可持續(xù)性已成為中國乃至世界茶葉生產(chǎn)的必然趨勢。目前關(guān)于云南不同類型茶園土壤真菌及土壤環(huán)境質(zhì)量，尤其古茶園的研究報道比較少。本研究通過真菌擴增子測序技術(shù)，檢測瀾滄江下游南糯山、景邁山和布朗山3座古茶山的森林、現(xiàn)代茶園和古茶園土壤的真菌群落組成，并結(jié)合土壤養(yǎng)分狀況測定，分析土壤真菌群落與環(huán)境因子間關(guān)系，以期為揭示不同類型茶園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及其與茶園土壤環(huán)境質(zhì)量關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤采樣與處理

1.1.1 取樣位點概況 土壤采樣點分別位于云南省西雙版納州勐?？h代表性3座古茶山：景邁山（大平掌）、布朗山（賀開村）和南糯山（半坡竹林小組），各古茶山均以森林土壤為對照，現(xiàn)代茶園和古茶園土壤為研究對象，共9個樣本，分別為：森林土壤(S1、S2、S3)、現(xiàn)代茶園土壤(X1、X2、X3)和古茶園土壤(G1、G2、G3)。各茶園均為生態(tài)茶園，除景邁山和布朗山現(xiàn)代茶園每年進行土壤翻耕外，其他茶園均處于免耕狀況，茶園栽培管理均為不施肥、不施農(nóng)藥的有機茶園或生態(tài)茶園，茶園的生態(tài)環(huán)境概況見表1。

1.1.2 采樣方法與處理 土壤樣品采集時間為2018年5月中旬，具體采集及處理方法與楊廣容等[19]土樣采集與處理相同。一部分土樣（約20 g）裝入無菌袋并及時貯樣于液氮灌中保存，在-86℃低溫保存，供分子生物學研究。另一部分剩余土壤（約500 g）置于室內(nèi)自然風干，碾磨并過2 mm或0.15 mm篩用于土壤pH、堿解氮、速效磷、速效鉀、有機質(zhì)、全氮、全磷和全鉀測定。

1.2 土壤化學性質(zhì)及養(yǎng)分含量測定與統(tǒng)計分析

土壤pH采用1:2.5土水（質(zhì)量比）用玻璃復合電極法測定；陽離子交換量(cation exchange apacity，CEC)用乙酸銨交換提取—蒸餾法；有機質(zhì)(soil organic matter，SOM)用重鉻酸鉀容量法—外加熱法；全氮(total nitrogen，TN)用濃硫酸—雙氧水消煮—凱氏定氮法；全磷(total phosphorous，TP)用硫酸—雙氧水消煮—鉬銻抗比色法；全鉀(total potassium，TK)用濃硫酸—雙氧水消煮—火焰光度法；有效氮磷鉀：堿解氮(alkalihydrolyzable nitrogen，AHN)用1 mol/L NaOH堿解擴散法；速效磷(available potassium，AP)即Olsen-P用0.5 mol/L NaHCO3溶液浸提—鉬藍比色法；速效鉀(available potassium，AP)用乙酸銨浸提—火焰光度法[20]。

土壤化學性質(zhì)數(shù)據(jù)處理用SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，采用單因素方差分析(oneway-ANOVA)和多重比較(LSD)法進行差異顯著性檢驗和多重比較分析（α=0.05和0.01），本研究土壤采樣位點基本概況及養(yǎng)分狀況見表1（表中數(shù)據(jù)均為mean±SD）。

表1 土壤采樣位點基本情況及養(yǎng)分狀況

1.3 土壤真菌宏基因組測序及研究方法

1.3.1 土壤樣品DNA提取 土壤DNA提取采用SDSGITC-PEG法[21]，并作適當改進。稱取0.5 g土樣于2 mL離心管中，所加試劑均按照比例減少20倍，加入氯仿-異戊醇后離心速度為15000 g，10 min。

1.3.2 18S rDNA基因擴增與測序 18S rDNA基因擴增：用18S rDNA基因引物ITS3-KYO2F和ITS4R進行PCR擴增，引物及序列見表2。

表2 研究中使用的引物

測序：對擴增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluorTM熒光計進行定量。選擇符合測序要求的樣品18Sr DNA送基迪奧生物科技有限公司（廣州）在IlluminaHiseq2500的PE250模式機上進行真菌擴增子測序，并根據(jù)官方說明構(gòu)建測序文庫。

1.3.3 土壤真菌18S rDNA基因組多樣性的高級生物學信息分析 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與Tags拼接：參照楊廣容等人的方法[19]進行。

Tags豐度統(tǒng)計：利用Mothur(v.1.34.0)軟件包對tag序列進行去冗余處理，從中挑選出unique tag序列，并對unique tag進行豐度分布統(tǒng)計；最后使用基于Naive Bayesian方法分類器rdp classifier工具對tag進行物種注釋[22]。根據(jù)序列長度變化，選擇Confidence Threshold為0.5適當參數(shù)進行物種分類與豐度分析。為更好地獲得樣品中物種多樣性信息，利用Mothur(v.1.34.0)軟件包計算0.03距離下（97%的相似度）物種分類單元(OTU，Operating Taxonomic Unit)數(shù)量及其豐度。

OTU注釋及聚類：采用眾數(shù)原則，先統(tǒng)計該OTU中所有tags的物種注釋信息，如果66%的tags都支持同一個物種分類單元，那么該物種分類就作為該OTU的物種分類信息，否則則在遞歸到上一級分類單元進行統(tǒng)計，直到滿足要求。結(jié)合OTU的物種注釋信息以及OTU在不同樣品中的表達信息，獲得所有樣品的OTU的表達譜。通過繪制樣品在0.03距離下的OTU稀釋曲線(rarefaction curve)來評價測序量是否足以覆蓋所有類群，并間接反映樣品中物種的豐富程度及聚類情況。當曲線趨于平緩或者達到平臺期時也就可以認為測序量趨于飽和。結(jié)合OTU物種注釋信息及OTU在不同樣品中的表達譜，統(tǒng)計界、門、綱、目、科、屬和種各個分類水平上各樣品的表達情況，獲得物種分類表達譜、Alpha多樣性指數(shù)和覆蓋度，并選取豐度較高的部分物種分類單元(OTU)，應用R軟件統(tǒng)計繪制最佳分類水平上的物種分布堆疊圖及聚類分析。

土壤真菌群落組成多樣性與環(huán)境因子間的冗余分析(RDA，Redundancy Aanalysis)：用Canoco5.0進行主成分PCA分析，及其真菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子相關(guān)性冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土壤類型真菌群落豐度及多樣性分析

3座茶山9個樣品土壤真菌18S rDNA測序序列經(jīng)數(shù)據(jù)過濾，獲得高質(zhì)量的、有效的read數(shù)：森林土壤依次為：93083(S1)＞51070(S2)＞6334(S3)；現(xiàn)代茶園土壤為：71249(X1)＞69308(X3)＞56485(X2)；古茶園土壤則為：68570(G1)＞65514(G3)＞61709(G2)。經(jīng)統(tǒng)計不同類型土壤樣品真菌群落在各個分類水平上的tag序列數(shù)及物種分類單元OTU（從上往下）為：界(100%)＞門(97.74%)＞綱(57.77%)＞目(56.48%)＞科(55.60%)＞屬(48.14%)＞種(35.64%)，在此情況下選擇“屬”作為9個樣品的最佳分類水平。圖1為樣品在0.03距離下的OTU稀釋曲線(a)及樣品間bray距離層級聚類圖(b)。從圖1(a)可知，景邁山森林(S1)、現(xiàn)代茶園(X1)和古茶園(G1)土壤真菌數(shù)目均高于布朗山和南糯山的森林（S2和S3）、現(xiàn)代茶園（X2和X3）和古茶園（G2和G3）土壤真菌數(shù)，并且S1＞X1＞G1，而布朗山與之相反S2＜X2＜G2，南糯山森林(S3)土壤OTUs指數(shù)明顯低于其他土壤。圖1(b)則表明，3座茶山非茶園土壤（S1、S2和S3）真菌群落的物種結(jié)構(gòu)比較相似而聚為一類；同一茶山的景邁山現(xiàn)代茶園(X1)與古茶園(G1)、南糯山現(xiàn)代茶園(X3)與古茶園(G3)土壤的真菌種群結(jié)構(gòu)相近，首次聚類為一類，而布朗山的現(xiàn)代茶園(X2)與古茶園(G2)真菌群落組成差別較大，但通過二次、三次聚類與其他兩座茶山的茶園土壤聚為一大類?？傮w表明，森林土壤與茶園土壤真群落菌組成差異性最大，其次是不同茶山之間。

表3為不同類型土壤真菌群落Alpha多樣性分析結(jié)果，表明：所建立真菌文庫的覆蓋率達95.39%～99.19%，說明研究所建立的文庫可比較真實有效地反映樣本環(huán)境真菌的多樣性。研究9個土壤樣本真菌群落的Alpha多樣性統(tǒng)計表明，chao1和ACE指數(shù)變化趨勢與OTU指數(shù)相一致；森林土壤中真菌Shannon指數(shù)為：南糯山(S3，4.07)＞布朗山(S2，3.99)＞景邁山(S1，3.92)，與之相一致，不同茶山的茶園土壤的Shannon指數(shù)呈現(xiàn)：古茶園為南糯山(G3，4.11)＞布朗山(G2，3.90)＞景邁山(G1，2.35)。與圖1相結(jié)合表明：除景邁山外，茶園土壤真菌群落豐度和多樣性水平普遍高于森林土壤。

表3 不同土壤樣本真菌Alpha多樣性統(tǒng)計

圖1 各土壤真菌的OTU稀釋曲線圖及OTU的bray距離聚類分析圖

2.2 不同分類水平上土壤樣本真菌群落組成分析

根據(jù)OTU物種注釋信息，9個樣本土壤真菌群落組成歸屬于為5個門、117屬、806種以及未知序列(UnClassified)。表4為不同類型土壤真菌5個門分布概括，分別是子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接 合 菌 門 (Zygomycota)、壺 菌 門(Chytridiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)，它們占土壤真菌種類的97.17%～99.67%，其中，子囊菌門和擔子菌門是優(yōu)勢菌門，在9個土壤中豐度占比分別高達42.60%～74.10%和20.58%～49.15%，其次是接合菌門為1.57%～14.92%。

表4 不同土壤樣本門類水平reads數(shù)目及所占比例

圖2為本研究最佳分類水平上的物種分布堆疊圖及聚類關(guān)系分析。由于涉及真菌群落的種類很多，圖2僅對物種至少在一個樣本中包含tags數(shù)量達到總tags數(shù)量的1%作為閾值的29個屬（其中兩個為未知真菌屬Unclassified）進行作圖。在屬最佳分類水平上，3座茶山森林土壤（S1，S2和S3）的真菌群落組成聚為一類，說明它們的物種類型比較接近，與之相一致，現(xiàn)代茶園土壤X1和X3與古茶園土壤G2和G3能夠通過首次、二次聚類為一類，說明景邁山和布朗山的4個茶園土壤真菌群落組成較為相似。而X2和G2雖然與其他4個茶園土壤最后聚為一來，表明布朗上的茶園土壤與南糯山和景邁山的茶園土壤差異較大。

圖2 屬最佳分類水平上的真菌物種分布堆疊圖及聚類分析

對所有土壤樣品測得的OTUs所對應的生物分類學信息進行統(tǒng)計分析表明，隱球菌屬(Cryptococcus)、Archaeorhizomyces和被孢霉屬(Mortierella)在森林和

茶園土壤中分布均比較廣泛；而曲霉菌屬(Aspergillus)、革菌屬(Tomentella)和Membranomyces與紅菇菌屬(Russula)分別在南糯山森林土壤S3與布朗山森林土壤S2分布優(yōu)勢明顯；茶園土壤優(yōu)勢真菌類群多樣性比森林土壤有所提高，外瓶霉屬(Exophiala)、毛殼菌屬(Chaetomium)、鐮刀菌屬(Fusarium)和青霉屬(Penicillium)均演變?yōu)閮?yōu)勢菌屬。

2.3 不同類型土壤真菌群落多樣性與土壤環(huán)境因子的冗余分析(RDA)

為進一步闡明不同類型土壤pH值和碳氮磷鉀養(yǎng)分對真菌群落分布的影響，先通過Canoco5.0軟件進行去趨勢對應分析，分析結(jié)果表明適合做冗余分析(RDA)。從表1中選取6個存在顯著相關(guān)關(guān)系的土壤環(huán)境指標與土壤真菌多樣性指標作RDA如圖3所示。X1、S2、G2、X3和G3茶園土壤樣本比較靠近第一排序軸，即這5個土壤樣本真菌群落多樣性比較接近。其次，C:N與代表土壤真菌數(shù)量的（ACE和Chao1）2個指數(shù)均呈顯著性正相關(guān)，說明土壤碳氮比水平提高，有利于森林和茶園土壤真菌數(shù)量增加；與之相反，土壤SOM、AHN和Olsen-P與ACE和Chao1呈顯著性負相關(guān)關(guān)系，即土壤有機質(zhì)和有效氮磷水平提高不利于增強其真菌數(shù)量和群落豐度增強。雖然，6個土壤環(huán)境因子pH、SOM、C:N、AHN、Olsen-P和AP與土壤真菌群落豐度和多樣性之間有一定的相互關(guān)系，但與pH、C:N和Olsen-P的相關(guān)性明顯高于SOM、AHN和AP。

圖3 不同類型土壤真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性與土壤環(huán)境因子間的冗余分析

2.4 不同類型土壤真菌群落組成與土壤環(huán)境因子間的冗余分析

選擇屬最佳分類水平真菌群落豐度占比大于2%的菌屬作為RDA物種輸入變量，利用Canoco5.0軟件對真菌群落特征和經(jīng)過變異膨脹因子篩選后的6個土壤環(huán)境因子進行RDA分析如圖4。首先，第一、二排序軸解釋量分別達到35.21%和19.52%，說明6個土壤環(huán)境因子pH、SOM、C:N、AHN、Olsen-P和AP是顯著影響樣本土壤真菌群落分布的環(huán)境因子。其次，3座茶山森林土壤由于地理分布區(qū)域距離較遠，土壤母質(zhì)及植被等差異較大，各森林土壤的主要優(yōu)勢真菌類群差異較大。最后，3座茶山的6個茶園土壤樣本的象限分布看，6個茶園土壤優(yōu)勢真菌的群落結(jié)構(gòu)比較接近，其中，X2、G1和G2的真菌類群結(jié)構(gòu)分別與S3和S2相近，X1、G3和X3的優(yōu)勢真菌類群有綠僵菌屬(Metarhizium)、 Archaeorhizomyces、鐮 刀 菌 屬(Fusarium)、隱 球 菌 屬 (Cryptococcus)、被 孢 霉 屬(Mortierella)和外瓶霉屬(Exophiala)和未能鑒定的(Unclassified)屬群，并且這些真菌屬的分布豐度與茶園土壤SOM、AHN、AP、Olsen-P和pH呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。

圖4 不同類型土壤真菌群落組成與環(huán)境因子間的冗余分析

3 結(jié)論

茶園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)在門分類水平與森林土壤相似，以子囊菌、擔子菌、接合菌、壺菌和球囊菌5個門為 主 ，并 且 Cryptococcus、Archaeorhizomyces和Mortierella 3個屬分布較為廣泛。影響茶園土壤真菌群落多樣性和豐度的主要因素比較復雜，從宏觀的生態(tài)環(huán)境范圍看茶山土壤母質(zhì)及植被狀況是重要影響因素，其次是植茶年限的長短，隨著茶樹種植茶園土壤真菌 類 群 有 向 Cryptococcus、Archaeorhizomyces、Fusarium、Exophiala、Mortierella和Metarhizium 等屬群演替的趨勢；在微觀的土壤理化特性和養(yǎng)分狀況上看，土壤pH、C:N及碳氮磷鉀肥力水平與茶園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性關(guān)系較為密切。

4 討論

茶園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)受多方面影響，除茶樹葉片凋落物本身特性外，還與茶樹根系分泌物數(shù)量、土壤有機質(zhì)含量和pH等有關(guān)[23-24]。本研究的土壤樣本在pH 4.30～4.86之間，屬于適宜茶樹生長范圍，研究結(jié)果表明，大多數(shù)茶園土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性與pH、SOM、有效氮磷鉀（AHN、Olsen-P和AP）和C:N呈顯著相關(guān)關(guān)系，其中，SOM、有效氮磷含量與真菌數(shù)量和多樣性呈負相關(guān)（圖3），而大部分優(yōu)勢真菌屬豐度與土壤C:N也是負相關(guān)關(guān)系（圖4）。本研究中森林土壤與茶園真群落菌組成差異性最大，其次是不同茶山之間，再次為同一茶山不同植茶年齡的茶園之間（圖1）。本研究中導致森林和茶園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢菌群豐度間的差異的主要原因可能是：一是不同茶山土壤母質(zhì)及植被差異較大，二是供試土壤在pH 4.50左右，當土壤pH＜5.0時，對耐酸性較強的真菌的生長繁殖影響不大，三是本試驗的土壤肥力水平較高，可供腐生真菌生長所需基質(zhì)（纖維素等）相對較多。

關(guān)于森林和茶園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，本研究從不同類型土壤中鑒定到真菌群落基本分屬于：子囊菌、擔子菌、接合菌、壺菌和球囊菌5個門，其中前3個門為優(yōu)勢菌門（表4），各茶山現(xiàn)代茶園和古茶園土壤的優(yōu)勢真菌屬的數(shù)目和豐度均比森林土壤高（圖2和圖4），3個森林土壤優(yōu)勢真菌群落數(shù)目與種類差異較大，并以毛殼屬、隱球菌屬、毛孢子菌屬、青霉屬、木霉屬、曲霉菌屬等在不同森林土壤中分布比較廣泛。而茶園土壤的優(yōu)勢真菌類群則以Archaeorhizomyces、隱球菌屬、外瓶霉屬、綠僵菌屬、鐮刀菌屬、毛殼菌屬、被孢霉屬等類群為主；此外，青霉屬、木霉屬和曲霉菌屬在布朗山茶園土壤（X2和G2）中分布也比較豐富，說明不同茶山的茶園土壤優(yōu)勢真菌群落的差異明顯。本研究與季凌飛、袁賽艷和胡雲(yún)飛[9-11]等前人的研究結(jié)果比較相似：在不同施肥、茶樹修剪枝葉還田及季節(jié)條件下，茶園真菌群落結(jié)構(gòu)主要由子囊菌門、擔子菌門、接合菌門、壺菌門和球囊菌門構(gòu)成，茶園及農(nóng)田長期施肥可能會促使土壤中的真菌群落多樣性降低，群落結(jié)構(gòu)主要朝子囊菌、擔子菌和接合菌3個方向演替，并且，不同植被覆蓋可能會導致土壤真菌群落組成的差異，在土壤pH的主控效應可能存在于不同植被覆蓋體系間，而在同一作物土壤中，土壤有機碳、碳氮比以及速效氮磷鉀可能強烈的影響微生物群落結(jié)構(gòu)，這與本研究的RDA分析結(jié)果相一致（圖3和4）：茶園土壤真菌群落的分布豐度與土壤SOM、AHN、Olsen-P、AP和pH呈顯著相關(guān)關(guān)系。

本研究表明，森林與茶園土壤優(yōu)勢真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性差異除受地理分布、植被類型、土壤養(yǎng)分、施肥與修剪等影響外，還與茶樹栽培及年限密切相關(guān)。張玥等[23]研究也表明：隨著植茶年限的增加，茶樹根際土壤肥力增加和真菌群落數(shù)量增加，有利于茶樹生長代謝的真菌種群增多。前人研究已發(fā)現(xiàn)，木霉(Trichoderma spp.)、青霉菌(Penicillium spp.)、曲霉菌(Aspergillusspp.)、嗜 熱 側(cè) 孢 霉 (Scytalidium thermophilum)、鐮 刀 菌 (Fusarium spp.)、球 囊 霉 屬(Glomus)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、綠僵菌(Metarhizium anisopliae)等真菌在茶園土壤中廣泛分布，它們對茶樹凋落物、修剪物、根系分泌物中的木質(zhì)素和多酚等有較強的降解作用，可提高土壤肥力和活性，并作為茶園生防真菌對茶園土壤清潔、茶樹小綠葉蟬、茶卷葉蛾等昆蟲和螨類及根腐病等方面都可能發(fā)揮重要作用[5,13-16,24-25]。所以，茶園土壤特征性優(yōu)勢真菌群落可作為茶園土壤健康的重要標志，在開展茶園間套作遮蔭樹和其他作物增加茶園土壤微生物群落數(shù)量和多樣性，促進茶園土壤養(yǎng)分循環(huán)與健康[26-27]，合理利用茶樹修剪物及茶廠廢棄物還田和增施有機肥提高茶園土壤有機質(zhì)及微生物數(shù)量和改良土壤理化性質(zhì)，增強土壤微生物的代謝活性[23,28]，已逐步成為國內(nèi)外茶園土壤微生物研究與肥力可持續(xù)性和茶樹病蟲害防治的重要領(lǐng)域[29-30]。