張 超吳俊學(xué)王 冶謝海洋彭 玲

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨外科,四川 南充 637000;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 臨床營養(yǎng)科,四川 南充 637000)

椎間盤退變是一種與年齡相關(guān)的慢性過程,其特征是髓核細(xì)胞數(shù)量和功能減少,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生不足[1]。研究認(rèn)為炎癥在細(xì)胞外基質(zhì)代謝的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[2]。促炎細(xì)胞因子抑制髓核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì),誘導(dǎo)衰老,細(xì)胞死亡和變性椎間盤細(xì)胞自噬,導(dǎo)致椎間盤結(jié)構(gòu)改變并引起臨床體征和癥狀[3]。目前對(duì)椎間盤退變的治療手段從保守治療到外科手術(shù),然而,這些椎間盤退變的臨床治療方法存在很大的局限性,只能部分緩解椎間盤退變引起的癥狀,不能從根本上逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。因此,應(yīng)開發(fā)相應(yīng)的有效藥物,真正改善椎間盤退變的進(jìn)展。和厚樸酚是一種天然黃酮類化合物,從厚樸的根和樹皮中提取,研究表明,和厚樸酚在體內(nèi)外具有抗氧化、脂質(zhì)過氧化、抗炎癥的藥理作用及神經(jīng)保護(hù)作用[4-7]。此外,最近一項(xiàng)使用大鼠尾巴模型的研究表明,和厚樸酚可以滲透并分布在椎間盤退變中,從而在體外和體內(nèi)均達(dá)到治療效果[8]。這使得和厚樸酚成為治療椎間盤退變的一個(gè)有吸引力的候選物。本研究探索和厚樸酚對(duì)D-半乳糖致腰間盤退變大鼠血清炎癥因子含量變化,細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)水平及凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響,以期為今后椎間盤退變的臨床治療提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

45只SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(川)2018-018],鼠齡為6～7周,體重200～260 g。實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于該中心[SYXK(川)2018-076],溫度24℃～26℃,濕度50%～60%,光照12 h,自由飲食飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到了川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(IACUC-2019-011),實(shí)驗(yàn)過程中遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

和厚樸酚和D-半乳糖,美國Sigma公司;SRY相關(guān)HMG盒9(SOX-9)、II型膠原(Collagen II),蛋白聚糖(Aggrecan)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9、c-Myc兔來源一抗和HRP標(biāo)記的山羊抗兔二 抗,英 國Abcam公 司;蛋 白Marker,美 國Fermentas公司;EDTA緩沖液(pH=8.0),武漢百耐特化工有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit,TaKaRa(DRR037S);SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus),TaKaRa(DRR420A);PVDF膜,谷歌生物;RIPA強(qiáng)裂解液、ECL發(fā)光試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;大鼠IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α ELISA試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司。

高速低溫離心機(jī),德國艾本德公司;Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀和Nano Drop 2000,中國賽默飛世爾公司;OLYMPUS DP71顯微鏡,日本奧林巴斯光學(xué)有限公司;AMA440N高壓滅菌鍋,英國Astell公司;ABI StepOnePlusTM熒光定量PCR儀,美國基因儀器公司;電泳槽、電轉(zhuǎn)儀和BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng),美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組、模型建立與藥物干預(yù)

將SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組9只,分別為對(duì)照組(Control)、D-半乳糖(D-galactose,D-gal)模型組(Model)、和厚樸酚低劑量組(2 mg/kg)、和厚樸酚中劑量組(4 mg/kg)、和厚樸酚高劑量組(8 mg/kg)。模型組和和厚樸酚低、中、高劑量組參照劉仁造模的方法[9],如表1所示,采用皮下注射D-半乳糖(300 mg/kg)方法建立衰老大鼠椎間盤退變模型。和厚樸酚低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給和厚樸酚2、4、8 mg/kg,對(duì)照組和模型組大鼠灌胃給予生理鹽水。連續(xù)給藥4周后處死大鼠,取腰部椎間盤進(jìn)行相關(guān)研究。

表1 動(dòng)物模型建立與藥物干預(yù)Table 1 Animal model establishment and drug intervention

1.3.2 HE染色

取部分大鼠腰部椎間盤放入4%多聚甲醛溶液固定24 h以上,然后將組織置于脫水機(jī)內(nèi)依次梯度乙醇進(jìn)行脫水后,石蠟包埋、切片;將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ、梯度乙醇進(jìn)行脫蠟處理,然后蘇木精、伊紅染色;隨后依次用乙醇和二甲苯處理直至脫水透明,用中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.3.3 番紅O染色

石蠟組織切片制備同1.3.2,PBS清洗3次后,用1%番紅O染液浸染1.5 min;1%固綠染液復(fù)染1 min;體積分?jǐn)?shù)75%乙醇分化2 s;自然晾干,二甲苯透明,中性樹脂封片后,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 qRT-PCR檢測(cè)基因mRNA水平

使用TRIzol試劑提取大鼠椎間盤組織總RNA,并通過Nanodrop2000測(cè)定濃度,然后使用Super RT cDNA試 劑 盒 將RNA反 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA。使 用Quantifast? SYBR? GreenPCR Kit在ABI 7500儀器上進(jìn)行PCR,反應(yīng)條件為95℃15 s;60℃60 s。SOX-9、Collagen II、Aggrecan和GAPDH的引物如下:SOX-9:5’-GGCCCTTCCTCTCCTCAACC-3’,5’-ACTGCCGTGGCCTTTTACA-3’;CollagenII:5’-GGG CTCCCAGAACATCACCTACCA-3’,5’-TCGGCCCTC ATCTCCACATCATTG-3’;Aggrecan:5’-ACATCCCA GAAAACTTCTTT-3’,5’-CGGCTTCGTCAGCAAAGC CA-3’;GAPDH:5’-AGCCGCATCTTCTTGTGCAGTG-3’,5’-TGGTAACCAGGCGTCCGATACG-3’。

1.3.5 免疫印跡法

取適量大鼠腰椎間盤組織勻漿,用RIPA裂解緩沖液在4℃下提取蛋白質(zhì),使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠對(duì)等量蛋白質(zhì)(40 μg)進(jìn)行電泳,然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用含5%脫脂牛奶的TBST封閉膜1 h,一抗4℃孵育過夜,TBST洗滌3次,然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h,TBST洗滌3次,使用化學(xué)發(fā)光劑ECL顯示條帶,用Image J定量蛋白條帶灰度值。

1.3.6 ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子含量

采用ELISA法測(cè)定大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量。操作步驟嚴(yán)格按照大鼠IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.7 TUNEL染色

石蠟組織切片制備同1.3.2,取石蠟切片用PBS清洗3次,每次5 min,然后與含有TdT和生物素化dUTP的TUNEL反應(yīng)混合物37℃孵育1 h,用PBS洗3次,每次10 min,在37℃的洗滌緩沖液中孵育30 min終止反應(yīng)。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚對(duì)椎間盤組織形態(tài)學(xué)變化的影響

HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組髓核排列規(guī)則;模型組大鼠椎間盤纖維環(huán)多不完整,出現(xiàn)破裂,髓核細(xì)胞減少;和厚樸酚低、中、高劑量組纖維環(huán)膠原纖維層較對(duì)照組薄,纖維環(huán)稍有裂隙,軟骨細(xì)胞浸潤比對(duì)照組增多,髓核細(xì)胞稍有減少;但與模型組相比退變方面表現(xiàn)出改善。與對(duì)照組相比,模型組和和厚樸酚低、中劑量組椎間盤組織形態(tài)學(xué)評(píng)分顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比,和厚樸酚中、高劑量組椎間盤組織形態(tài)學(xué)評(píng)分顯著降低(P＜0.05)。模型組和和厚樸酚低劑量組較對(duì)照組番紅O淡染表明軟骨基質(zhì)流失嚴(yán)重,軟骨組織受損,和厚樸酚中、高劑量組番紅O染色較對(duì)照組稍有減少,但與模型組比較軟骨組織損傷較輕(圖1)。

圖1 各組腰椎間盤組織形態(tài)學(xué)變化Note.A,HE staining.B,Safranin O staining.C,Histological score.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with Model group,#P＜0.05.Figure 1 Histomorphological changes of lumbar intervertebral discs in each group

2.2 和厚樸酚對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比,模型組SOX-9 mRNA、Collagen II mRNA、Aggrecan mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05);和厚樸酚低、中、高劑量組SOX-9 mRNA和Aggrecan mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05);和厚樸酚低、中劑量組Collagen II mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。與模型組相比,和厚樸酚中、高劑量組SOX-9 mRNA、Collagen II mRNA和Aggrecan mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)(表2)。與對(duì)照組相比,模型組SOX-9、Collagen II和Aggrecan蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05);和厚樸酚低、中劑量組SOX-9、Collagen II和Aggrecan蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)。與模型組相比,和厚樸酚中、高劑量組SOX-9、Collagen II和Aggrecan蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)(圖2)。

圖2 各組SOX-9、Collagen II和Aggrecan的蛋白表達(dá)水平變化Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with Model group,#P＜0.05.Figure 2 Changes in the expression levels of SOX-9,Collagen II and Aggrecan proteins in each group

表2 各組SOX-9、Collagen II、Aggrecan的mRNA表達(dá)水平變化Table 2 Changes in mRNA expression levels of SOX-9,Collagen II and Aggrecan in each group

2.3 和厚樸酚對(duì)血清中各炎癥因子含量的影響

與對(duì)照組相比,模型組和和厚樸酚中、高劑量組IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量均顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比,和厚樸酚中、高劑量組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著降低(P＜0.05);IL-10的含量顯著升高(P＜0.05)(表3)。

表3 各組IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量變化Table 3 Changes of IL-1β,IL-6,IL-10 and TNF-α levels in each group

2.4 和厚樸酚對(duì)椎間盤組織凋亡的影響

與對(duì)照組相比,模型組和和厚樸酚低、中劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比,厚樸酚中、高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著降低(P＜0.05)(圖3)。

圖3 各組腰椎間盤細(xì)胞凋亡變化(TUNEL染色)Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with Model group,#P＜0.05.Figure 3 Apoptosis of lumbar disc cells in each group(TUNEL staining)

2.5 和厚樸酚對(duì)線粒體凋亡相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,模型組和和厚樸酚低、中劑量組Bcl-2/Bax蛋白水平顯著降低(P＜0.05);Caspase-9、Caspase-3、c-Myc的蛋白水平均顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比,和厚樸酚中、高劑量組Bcl-2/Bax蛋白水平顯著升高(P＜0.05);Caspase-9、Caspase-3、c-Myc的蛋白水平均顯著降低(P＜0.05)(圖4)。

圖4 各組中Bcl-2/Bax、Caspase-9、Caspase-3和c-Myc蛋白的表達(dá)變化Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with Model group,#P＜0.05.Figure 4 Protein expression changes of Bcl-2/Bax,Caspase-9,Caspase-3 and c-Myc in each group

3 討論

椎間盤退變是一種多因素疾病,可導(dǎo)致多種脊柱相關(guān)疾病,如慢性腰痛、椎間盤突出和椎管狹窄。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,目前最常見的是保守治療和外科手術(shù)治療,但是這些治療方法療效有限,無法從根本上治療和逆轉(zhuǎn)椎間盤的退變進(jìn)程。因此研究椎間盤退變的分子生物學(xué)機(jī)制,為尋找新的治療椎間盤退變的方法具有非常重要的意義。

正常人椎間盤HE染色發(fā)現(xiàn)髓核結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)良好。隨著椎間盤退變的加重,髓核組織內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸消失,纖維逐漸增多、增粗,髓核組織分裂增多,體積縮小。Tang等[10]研究發(fā)現(xiàn),在給予和厚樸酚后,裂隙數(shù)量減少,髓核組織大小恢復(fù),和厚樸酚處理的大鼠椎間盤的組織學(xué)評(píng)分(表明椎間盤退變的程度)明顯降低。與前人研究一致,本研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚明顯降低椎間盤組織形態(tài)學(xué)評(píng)分,減少軟骨基質(zhì)流失,表明和厚樸酚對(duì)椎間盤退變具有緩解的作用。

SOX-9、Collagen II、Aggrecan是細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物,與椎間盤退變有著密切的聯(lián)系。Collagen II和Aggrecan使髓核保持水分,從而緩沖和吸收壓力[11]。當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝活性超過其合成代謝活性時(shí),Collagen II和Aggrecan的相對(duì)含量降低,導(dǎo)致水分流失和椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展[12]。研究發(fā)現(xiàn)SOX-9的增加可以正向調(diào)控包括aggrecan和collagen在內(nèi)的軟骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)[13]。此外,和厚樸酚能明顯增加SOX-9和Aggrecan的表達(dá),緩解細(xì)胞外基質(zhì)的變性[10]。與前人研究一致,本研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚明顯上調(diào)SOX-9、Collagen II、Aggrecan的表達(dá),表明和厚樸酚能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的生成,延緩椎間盤退變的發(fā)展。

炎癥在椎間盤退變的早期階段起著重要的作用,促炎介質(zhì)由椎間盤退變過程中炎癥細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)和椎間盤成分(纖維環(huán)和髓核)的雙重來源產(chǎn)生[3,14]。IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α與其他炎癥介質(zhì)一起誘導(dǎo)衰老,細(xì)胞死亡和變性椎間盤細(xì)胞自噬,導(dǎo)致椎間盤結(jié)構(gòu)改變并引起臨床體征和癥狀[3]。據(jù)報(bào)道,IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平在椎間盤退變中被上調(diào),IL-10表達(dá)水平被下調(diào),從而觸發(fā)降解酶的產(chǎn)生以及免疫細(xì)胞向椎間盤突出或退變的椎間盤中的浸潤[15-18]。研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚能夠抑制IL-1β和IL-6的表達(dá),表明和厚樸酚可能在抑制椎間盤退變的發(fā)病機(jī)制方面有價(jià)值[10]。與前人研究一致,本研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚明顯降低IL-1β、IL-6和TNF-α含量,提高IL-10的含量,表明和厚樸酚能減輕炎癥,從而減緩椎間盤退變。

細(xì)胞凋亡是椎間盤細(xì)胞死亡的一種非常重要的類型,在椎間盤退變過程中起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)川芎內(nèi)酯能促進(jìn)髓核細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá),并降低Bax和Cleaved-Caspase 3的表達(dá)[19]。miR-532可下調(diào)c-Myc和Survivin蛋白的表達(dá)[20]。而在關(guān)于和厚樸酚對(duì)椎間盤退變的研究,Tang等[10]研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚預(yù)處理可以抑制凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3和Bax的表達(dá)。與前人研究一致,本研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚明顯增加Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)水平,降低Caspase-9、Caspase-3、c-Myc的蛋白表達(dá)水平,表明和厚樸酚能夠抑制椎間盤細(xì)胞的凋亡,有望防止或逆轉(zhuǎn)早期椎間盤退變的發(fā)生。

綜上所述,本研究通過和厚樸酚降低血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,提高IL-10的含量,促進(jìn)SOX-9、Collagen II、Aggrecan的 表 達(dá) 以 及 抑 制Caspase-9、Caspase-3、c-Myc的蛋白水平,表明和厚樸酚對(duì)腰椎間盤退變具有緩解作用,為和厚樸酚用于椎間盤退變的防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。