王艷瓊董利利李 敏張 磊徐沙沙湯 昱

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院呼吸科,鄭州 450018)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)是一種革蘭氏陽性的胞外細(xì)菌,通常是定植在人們口腔和鼻咽部的正常菌群,當(dāng)機(jī)體免疫功能受損時可引起急性感染,是造成社區(qū)獲得性肺炎的常見原因,重者可危及生命[1],其在人肺泡上皮細(xì)胞(human alveolar epithelial cells,HPAEpiC)中可通過活性氧的過度生成和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的抑制,顯著增加微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)的表達(dá)來激活自噬[2]。而自噬可通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放,進(jìn)一步調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞的損傷[3]。另外,miRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有基因調(diào)控功能的非編碼RNA,其大小長約20～25個核苷酸,其中,miR-27a在細(xì)胞生長和發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用[4]。前人研究發(fā)現(xiàn),miR-27a可通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/mTOR信號通路調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的自噬和凋亡[5],而沉默miR-27a可通過激活脾酪氨酸激酶依賴的mTOR信號通路,調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞自噬和凋亡[6]。但是,目前miR-27a調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路對SP誘導(dǎo)HPAEpiC自噬和損傷的影響尚未見報道。因此,本研究使用SP誘導(dǎo)HPAEpiC同時下調(diào)miR-27a或過表達(dá)/干擾PI3K,觀察其對細(xì)胞增殖、凋亡、自噬及PI3K/AKT/mTOR通路的影響,初步探討其分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和菌株

HPAEpiC(貨號:XY-XB-1271)購自上海烜雅生物科技有限公司;肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,SP;貨號:ATCC 49619),購自上海欣碩生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基,Giboc公司;白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)ELISA試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司;RNA提取試劑盒,天根生化科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,Genecopoeia公司;雙熒光素酶檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,索萊寶生物科技有限公司;qRT-PCR檢測試劑盒,上海生工生物科技有限公司;CCK-8試劑盒,濟(jì)南遠(yuǎn)達(dá)晶美生物科技有限公司;野生型和突變型PI3K 3’UTR熒光素酶報告基因載體(PI3K-WT、PI3KMUT)、pcDNA-NC(過表達(dá)陰性對照)、pcDNA-PI3K(PI3K過表達(dá)載體)、Si-NC(RNA干擾陰性對照)和Si-PI3K(RNA干擾PI3K載體)、miR-27a NC(miR-27a陰性對照)、miR-27a模擬物(miR-27a mimics)、miR-27a抑制物(miR-27a inhibitor)以及miR-27a、U6引物,上海生工生物工程有限公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒,Invitrogen公司;PVDF膜、β-actin鼠抗,Sigma公司;ECL顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒,北京中山金橋生物科技有限公司;PI3K、Beclin1、LC3-I、LC3-II、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、β-actin鼠抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗,Abcam公司;尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡,上海普赫生物科技有限公司;FACSCanto流式細(xì)胞儀,Beckman公司;TL988 qRT-PCR儀,西安天隆科技有限公司;ChemiDoc-MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng),山東三瑞科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

HPAEpiC使用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基(含100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素),置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長密度達(dá)90%左右時,在培養(yǎng)基中加入菌液濃度為1×108CFU/mL的SP誘導(dǎo)損傷[7]。在加入SP誘導(dǎo)前48 h使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-27a-NC(miR-27a-NC組)、miR-27a-inhibitor(miR-27a-inhibitor組)、pcDNA-NC(pcDNA-NC組)、pcDNA-PI3K(pcDNA-PI3K組),共轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-27a-NC和Si-NC(miR-27a-NC+Si-NC組)、miR-27ainhibitor和Si-NC(miR-27a-inhibitor+Si-NC組)、miR-27a-NC和Si-PI3K(miR-27a-NC+Si-PI3K組)、miR-27a-inhibitor和Si-PI3K(miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組)。另取非誘導(dǎo)細(xì)胞為對照組,誘導(dǎo)且未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為誘導(dǎo)組。

1.3.2 qRT-PCR檢測正常HPAEpiC和SP誘導(dǎo)的HPAEpiC中miR-27a表達(dá)水平

RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA,以cDNA為模板,按照qRT-PCR試劑盒說明書配置PCR反應(yīng)體系、設(shè)定反應(yīng)條件。以U6作為內(nèi)參,根據(jù)2-ΔΔCt算法計算miR-27a表達(dá)水平,miR-27a正、反向引物為5’-TCCGTGAGAGC TGGAAAACC-3’、5’-TGGTTCTAACTAACTCCAGCC G-3’、U6正、反向引物為5’-GACGGCTTCCCAATAA CAG-3’、5’-ATTGAGGCTTCAGCACCAC-3’。

1.3.3 生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶驗(yàn)證miR-27a和PI3K的靶向關(guān)系

采用TargetScan在線網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)對miR-27a和PI3K的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析。取對數(shù)生長期的HPAEpiC接種于96孔板,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞分為miR-27a-mimics+PI3K-WT組、miR-27a-NC+PI3K-WT組、miR-27amimics+PI3K-MUT組和miR-27a-NC+PI3K-MUT組,每組設(shè)6個復(fù)孔,使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行細(xì)胞共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后,按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性,驗(yàn)證miR-27a與PI3K的靶向關(guān)系。

1.3.4 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖活性

收集各組細(xì)胞,每孔100 μL接種至96孔板中,加入濃度為10%的CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,于酶標(biāo)儀上測定各孔在450 nm波長下的OD值,細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD450nm-空白組OD450nm)/(對照組OD450nm-空白組OD450nm)。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率

收集各組細(xì)胞,1200 r/min離心5 min,棄培養(yǎng)基,參照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 ELISA檢測各組細(xì)胞上清液中IL-6和IL-10含量

每組各取約2 mL細(xì)胞懸液,1200 r/min離心10 min,取上清,嚴(yán)格按照IL-6和IL-10 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測,每組設(shè)置6個重復(fù)。

1.3.7 Western blot法檢測各組細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞,使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進(jìn)行定量,依次進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉、1∶2000濃度稀釋后的PI3K、Beclin1、LC3-I、LC3-II、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、β-actin鼠抗4℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5000)中室溫孵育2 h,用ECL顯色試劑盒顯色,以β-actin內(nèi)參,全能型凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常和SP誘導(dǎo)的HPAEpiC中miR-27a及PI3K蛋白表達(dá)水平

與對照組miR-27a(1.00±0.00)、PI3K蛋白(0.84±0.09)相比,誘導(dǎo)組細(xì)胞中miR-27a表達(dá)水平(1.73±0.18)升高(P＜0.05),PI3K蛋白表達(dá)水平(0.29±0.03)降低(P＜0.05)。見圖1。

圖1 對照組和誘導(dǎo)組PI3K蛋白表達(dá)圖Figure 1 PI3K protein expression in control group and induction group

2.2 下調(diào)miR-27a或過表達(dá)PI3K對SP誘導(dǎo)HPAEpiC增殖、凋亡及炎性因子影響

與對照組相比,誘導(dǎo)組miR-27a表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、IL-6含量升高(P＜0.05),PI3K蛋白水平、細(xì)胞增殖率和IL-10含量降低(P＜0.05);與miR-27a-NC組相比,miR-27a-inhibitor組miR-27a表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、IL-6含量降低(P＜0.05),細(xì)胞增殖率和IL-10含量升高(P＜0.05);與pcDNA-NC組相比,pcDNA-PI3K組細(xì)胞凋亡率、IL-6含量降低(P＜0.05),PI3K蛋白水平、細(xì)胞增殖率和IL-10含量升高(P＜0.05)。見圖2、表1。

表1 各組細(xì)胞增殖、凋亡及炎性因子含量比較(n=6)Table 1 Proliferation,apoptosis and inflammatory factor content of each group

圖2 各組細(xì)胞凋亡檢測圖Figure 2 Apoptosis detection of each group

2.3 下調(diào)miR-27a或過表達(dá)PI3K對SP誘導(dǎo)HPAEpiC中Beclin1、LC3-I、LC3-II、AKT、mTOR蛋白表達(dá)影響

與對照組相比,誘導(dǎo)組、miR-27a-NC組和pcDNA-NC組細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-II/I比值升高(P＜0.05),AKT、mTOR蛋白磷酸化水平降低(P＜0.05);miR-27a-inhibitor組細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-II/I比值降低(P＜0.05),AKT、mTOR蛋白磷酸化水平升高(P＜0.05);與pcDNANC組相比,pcDNA-PI3K組細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-II/I比值降低(P＜0.05),AKT、mTOR蛋白磷酸化水平升高(P＜0.05)。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平比較Note.Compared with the control group,aP＜0.05.Compared with the miR-27a-NC group,bP＜0.05.Compared with the pcDNA-NC group,cP＜0.05.Figure 3 Autophagy related proteins and phosphorylation levels of AKT and mTOR proteins of each group

2.4 miR-27a和PI3K基因靶向關(guān)系的預(yù)測與驗(yàn)證

生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示,miR-27a序列上存在與PI3K3’UTR結(jié)合的連續(xù)位點(diǎn)。與miR-27a-NC+PI3K-WT組(1.00±0.00)相比,miR-27a-mimics+PI3K-WT組(0.37±0.04)熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05),而miR-27a-NC+PI3K-MUT組(0.95±0.10)和miR-27a-mimics+PI3K-MUT組(1.03±0.11)熒光素酶活性無明顯變化。見圖4。

圖4 生物信息學(xué)預(yù)測miR-27a和PI3K3’UTR結(jié)合位點(diǎn)Note.WT,Wild-type.MUT,Mutant-type.UTR,Untranslated region.Figure 4 Bioinformatics prediction of miR-27a and PI3K3’UTR binding sites

2.5 下調(diào)miR-27a和干擾PI3K對SP誘導(dǎo)HPAEpiC增殖、凋亡及炎性因子含量的影響

與miR-27a-NC+Si-NC組相比,miR-27a-inhibitor+Si-NC組細(xì)胞增殖率和IL-10含量升高(P＜0.05),細(xì)胞凋亡率和IL-6含量降低(P＜0.05);miR-27a-NC+Si-PI3K組細(xì)胞增殖率和IL-10含量降低(P＜0.05),細(xì)胞凋亡率和IL-6含量升高(P＜0.05)。miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組細(xì)胞增殖率和IL-10含量較miR-27a-inhibitor+Si-NC組降低(P＜0.05),較miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組升高(P＜0.05),細(xì)胞凋亡率和IL-6含量較miR-27a-inhibitor+Si-NC組升高(P＜0.05),較miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組降低(P＜0.05)。見圖5、圖6。

圖5 各組細(xì)胞增殖、凋亡及炎性因子含量比較Note.Compared with the miR-27a-NC+Si-NC group,aP＜0.05.Compared with the miR-27a-inhibitor+Si-NC group,bP＜0.05.Compared with the miR-27a-NC+Si-PI3K group,cP＜0.05.Figure 5 Proliferation,apoptosis and inflammatory factor content of each group

圖6 各組細(xì)胞凋亡檢測圖Figure 6 Apoptosis detection of each group

2.6 下調(diào)miR-27a和干擾PI3K對SP誘導(dǎo)HPAEpiC的蛋白表達(dá)影響

與miR-27a-NC+Si-NC組 相 比,miR-27ainhibitor+Si-NC組細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-II/I比值降低(P＜0.05),AKT和mTOR蛋白磷酸化水平升高(P＜0.05);miR-27a-NC+Si-PI3K組細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-II/I比值升高(P＜0.05),AKT和mTOR蛋白磷酸化水平降低(P＜0.05)。miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-II/I比值較miR-27a-inhibitor+Si-NC組升高(P＜0.05),較miR-27a-NC+Si-PI3K組降低(P＜0.05),AKT和mTOR蛋白磷酸化水平較miR-27a-inhibitor+Si-NC組降低(P＜0.05),較miR-27a-NC+Si-PI3K組升高(P＜0.05)。見圖7。

圖7 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平Note.Compared with the miR-27a-NC+Si-NC group,aP＜0.05.Compared with the miR-27a-inhibitor+Si-NC group,bP＜0.05.Compared with the miR-27a-NC+Si-PI3K group,cP＜0.05.Figure 7 Autophagy related proteins and phosphorylation levels of AKT and mTOR proteins of each group

3 討論

細(xì)菌性肺炎每年可造成多達(dá)200萬人死亡,最常見的肺炎病原體是肺炎球菌和SP,約占社區(qū)獲得性肺炎的半數(shù),醫(yī)院獲得性肺炎的3%～10%[8],對人類健康造成嚴(yán)重威脅。劉煌等[9]研究發(fā)現(xiàn)SP感染肺泡上皮細(xì)胞后,IL-10含量顯著降低,IL-6含量顯著升高,引起炎癥反應(yīng)且使肺泡上皮細(xì)胞凋亡。本研究參照王勇等[7]方法,用1×108CFU/mL SP誘導(dǎo)HPAEpiC,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率、IL-6含量顯著升高,細(xì)胞增殖率、IL-10含量顯著降低,與劉煌等[9]一致,表明模型制備成功。本研究還發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)細(xì)胞中miR-27a表達(dá)水平、Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-II/I比值顯著升高,PI3K蛋白表達(dá)及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低,提示SP誘導(dǎo)HPAEpiC損傷與miR-27a和PI3K/AKT/mTOR通路密切相關(guān)。

miR-27a對調(diào)節(jié)多態(tài)性、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖、凋亡及血管生成中發(fā)揮重要作用。miR-27a水平增加可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯,抑制人少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖[10]。而敲低miR-27a-3p可通過增加人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的狹縫引導(dǎo)配體2表達(dá)來抑制脂多糖誘導(dǎo)的損傷[11]。miR-27a上調(diào)還可引起糖尿病腎病中足細(xì)胞損傷[12]。本研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-27a可提高SP誘導(dǎo)的HPAEpiC增殖率、IL-10含量、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平,降低miR-27a表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、IL-6含量、Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-II/I比值,其中Beclin1和LC3-II/I為自噬標(biāo)志物,可用于反映自噬強(qiáng)度[13],提示抑制miR-27a,可能通過抑制細(xì)胞凋亡及自噬,緩解SP誘導(dǎo)的HPAEpiC損傷。但miR-27a是否通過調(diào)控PI3K發(fā)揮作用,尚需進(jìn)一步研究。

PI3K參與多種細(xì)胞功能,可與AKT結(jié)合,磷酸化AKT的Ser308致使AKT活化,AKT通過下游多種途徑對靶蛋白進(jìn)行磷酸化而發(fā)揮抗凋亡作用。PI3K/AKT/mTOR信號通路與自噬密切相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)PI3K可提高SP誘導(dǎo)的HPAEpiC增殖率、IL-10含量、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平,降低細(xì)胞凋亡率、IL-6含量、Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-II/I比值,提示過表達(dá)PI3K,可能通過抑制細(xì)胞凋亡及自噬,緩解SP誘導(dǎo)的HPAEpiC損傷。Zeng等[15]研究發(fā)現(xiàn)4苯基丁酸能夠上調(diào)急性肺損傷模型中AKT/mTOR通路,抑制自噬,緩解LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷,與本研究結(jié)果一致。然而,Du等[16]研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶激活受體-2能夠通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路,抑制自噬,從而引發(fā)腎小管上皮細(xì)胞炎癥,另有研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路,可通過促進(jìn)自噬,減輕動脈粥樣硬化病變斑塊的形成[17]。這與本研究并不一致,這可能是由于自噬過程較快,而且細(xì)胞既可通過提高自噬減少細(xì)胞壞死,減輕有毒物質(zhì)的積累,又可通過主動降低自身自噬活性,減少因自噬引起的細(xì)胞死亡,并且來自于外界的多種刺激條件及環(huán)境因素各不相同[18],所以不同細(xì)胞和組織間的自噬活性存在一定的差異性。早期Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-27a通過靶向PI3K調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),miR-27a和PI3K存在靶向關(guān)系,將miR-27a-inhibitor和Si-PI3K共轉(zhuǎn)染SP誘導(dǎo)HPAEpiC,發(fā)現(xiàn)miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組細(xì)胞增殖率、IL-10含量、Beclin1蛋白表達(dá)水平和LC3-II/I比值較miR-27a-inhibitor+Si-NC組降低,而細(xì)胞凋亡率、IL-6含量、AKT和mTOR蛋白磷酸化水平升高,提示抑制miR-27a表達(dá)對SP誘導(dǎo)HPAEpiC損傷的緩解作用,可被干擾PI3K逆轉(zhuǎn)。

綜上所述,在SP誘導(dǎo)HPAEpiC損傷過程中,miR-27a表達(dá)上調(diào),而抑制miR-27a可靶向上調(diào)PI3K蛋白表達(dá),激活其下游AKT/mTOR信號通路,進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬,緩解SP所致HPAEpiC損傷。但是,關(guān)于miR-27a的靶基因較多,是否還涉及其它信號通路,尚需深入研究。