楊佳慶，陳興浩，巫首燕，劉 慶，曹佳怡，張福梅

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 中國-馬來西亞國家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；4.甘南牦牛乳研究院，甘肅 甘南 747000）

生物活性肽是蛋白質(zhì)中20個(gè)天然氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱，是源于蛋白質(zhì)的多功能化合物，對(duì)生命體的生命活動(dòng)具有積極作用，并最終影響機(jī)體健康。乳源性活性肽因?yàn)槠洫?dú)特的營養(yǎng)價(jià)值備受關(guān)注[1]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白的水解產(chǎn)物不具有較強(qiáng)的羥自由基清除率[2-5]，但具有降低血清膽固醇[6]等作用。

在所有物種的乳制品中，驢乳的組成更接近母乳，且對(duì)患牛奶過敏的嬰兒致敏性較小[6]。此外，驢奶還具有減輕氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎和改善免疫功能等作用[7]，是適合老年人的營養(yǎng)乳品。

目前已證實(shí)乳清蛋白水解物能夠清除自由基[8]，延緩機(jī)體衰老，但驢乳清粉水解物對(duì)衰老的研究未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用驢乳清粉水解物連續(xù)干預(yù)D-半乳糖衰老小鼠6周，監(jiān)測(cè)其體重、血清中SOD活性和MDA含量、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、負(fù)重游泳等指標(biāo)，探究驢乳清粉水解物改善D-半乳糖衰老小鼠機(jī)體衰老的相關(guān)機(jī)制，為驢乳高附加產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性昆明小鼠，由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；丙二醛（MDA）試劑盒和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所有限公司；D-半乳糖和VC，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋、DT-200小鼠跳臺(tái)測(cè)試儀、游泳箱（50 cm×40 cm×60 cm有機(jī)玻璃槽）。

1.3 方法

1.3.1 驢乳清粉水解物的制備 稱取0.5 g驢乳清粉，用蒸餾水配成30 mg/L的底物濃度，90℃預(yù)處理5 min，降溫至最適溫度，調(diào)節(jié)pH值到酶的最適值。在酶最適宜的反應(yīng)溫度下用恒溫磁力攪拌并稱取適量蛋白酶放在溶液中。反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，依據(jù)所測(cè)結(jié)果加入1 mol/L的NaOH溶液或HCI溶液進(jìn)行修正，保證pH值的恒定在到達(dá)預(yù)定時(shí)間調(diào)整至7.0左右。水解終止后進(jìn)行水浴滅酶（水浴條件為100℃），9 000 r/min，離心10 min，倒掉上清液，剩下即為驢乳清粉水解物。

1.3.2 水解度DH的測(cè)定 根據(jù)pH-stat法（Alder-Nissen[9]，1986）測(cè)定驢乳清粉水解率。

1.3.3 衰老模型的制備 選取25～30 g健康成年雌性小鼠65只，正常對(duì)照組（12只）不做任何干預(yù)，其余小鼠頸背部注射0.25 ml/20 g體重的10%D-半乳糖生理鹽水，每日1次，連續(xù)注射42 d，用來制備D-半乳糖衰老小鼠。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組 衰老模型制作成功后，小鼠先進(jìn)行4 d的適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，按照表1分組。腹腔注射標(biāo)準(zhǔn)為每只小鼠每天注射0.25 ml/20 g體重的10%D-半乳糖。

表1 驢乳清粉水解物干預(yù)衰老小鼠實(shí)驗(yàn)分組

1.3.5 負(fù)重游泳 采用50 cm×40 cm×60 cm有機(jī)玻璃槽，水深約35 cm，水溫25±0.5℃。置小鼠在游泳箱中游泳（每周1次），鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮，并做好標(biāo)記，記錄小鼠游泳情況，至小鼠力竭時(shí)間（即小鼠從入水游泳開始記錄時(shí)間至口鼻沒入水中8 s，無抬頭）。力竭后立即將小鼠用吹風(fēng)機(jī)吹干，置于籠中正常飼喂。

1.3.6 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 在跳臺(tái)訓(xùn)練時(shí)先將小鼠置于跳臺(tái)測(cè)試箱內(nèi)3 min，保證小鼠適應(yīng)環(huán)境，然后通入36 V電流，在小鼠受電擊后，其正常反應(yīng)是跳到安全平臺(tái)以躲避電擊[10]。記錄10 min內(nèi)小鼠跳下逃避臺(tái)的次數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

1.3.7 指標(biāo)檢測(cè) 用驢乳清粉水解物干預(yù)1～6周，檢測(cè)體重；參考Farhangi等[11]方法，計(jì)算體重增長率。6周后對(duì)小鼠采血，在4℃冰箱中靜置2 h，再用離心機(jī)離心，3 500 r/min，15 min。按照說明書步驟檢測(cè)血清中SOD活力和MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 驢乳清粉水解物水解率

經(jīng)分析計(jì)算，驢乳清粉水解率為9.9%。

2.2 驢乳清粉水解物對(duì)D-半乳糖衰老小鼠體重的影響

由圖1可知，NS-N、DWPPL、DWPPM和VC組，體重增長率與干預(yù)時(shí)間均呈正相關(guān)，且NS-N組增長率最高，DWPPL、DWPPM和VC組3組體重增長率相似，均與NS組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DWPPH組與NS組的體重增長率均呈下降趨勢(shì)。

圖1 不同劑量驢乳清粉水解物干預(yù)D-半乳糖衰老小鼠體重增長率的變化

2.3 小鼠血清抗氧化活性的變化

由圖2可知，NS與NS-N相比，血清中SOD活力值下降，而MDA的含量卻明顯上升，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。驢乳清粉水解物和VC干預(yù)后，NS與乳清粉水解物低、中、高劑量組相比，MDA含量明顯下降，SOD活力顯著上升，且低、中劑量組與VC組結(jié)果相近，僅高劑量組MDA含量與NS組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 小鼠血清中SOD活力MDA的含量變化

2.4 小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)屬一次性刺激回避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，是間接反映機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)方法。由表2可知，D-半乳糖造模后，衰老小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期均明顯下降，與正常對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；隨著驢乳清水解物干預(yù)時(shí)間的延長，DWPPL和DWPPM潛伏期較干預(yù)前明顯延長，DWPPH組與衰老組間無明顯變化。0周、3周、6周錯(cuò)誤次數(shù)組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 驢乳清粉水解物干預(yù)衰老小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 負(fù)重游泳

由表3可知，衰老模型建成后，游泳時(shí)間均有所下降，與正常對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；隨著低、中濃度驢乳清水解物的逐漸干預(yù)，游泳時(shí)間延長且與衰老組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但高濃度組游泳時(shí)間無變化，表明高濃度水解物對(duì)小鼠抗氧化能力效果不明顯。

表3 驢乳清粉水解物干預(yù)衰老小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，體重會(huì)逐漸下降，同樣肥胖的人更容易衰老[12]。本實(shí)驗(yàn)中D-半乳糖衰老小鼠隨干預(yù)時(shí)間的延長，體重明顯下降，而低、中濃度驢乳清水解物和VC均能逆轉(zhuǎn)衰老導(dǎo)致的體重下降。

Denham Harman認(rèn)為衰老過程中細(xì)胞功能的改變是由ROS的積累導(dǎo)致生物分子氧化和細(xì)胞損傷。血清內(nèi)SOD的活力是機(jī)體清除自由基能力的體現(xiàn)，同時(shí)MDA含量是機(jī)體脂質(zhì)過氧化物的重要顯現(xiàn)，SOD活力和MDA含量與氧化應(yīng)激和衰老密切相關(guān)[13,14]。本實(shí)驗(yàn)中，衰老組的小鼠MDA含量較正常組升高，而SOD活性則降低，但在添加低、中濃度驢乳清粉水解物后MDA含量明顯下降，SOD活性升高，且與VC陽性對(duì)照組結(jié)果無顯著差異，說明低、中濃度驢乳清粉水解物在機(jī)體內(nèi)具有抗氧化活性，可以減輕衰老導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。

小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D-半乳糖衰老小鼠潛伏期明顯下降，隨著驢乳清水解物干預(yù)時(shí)間的延長，DWPPL和DWPPM潛伏期較干預(yù)前明顯延長，0周、3周、6周時(shí)，10 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)錯(cuò)誤次數(shù)正常組較其他組少，組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明D-半乳糖可通過半乳糖醇在細(xì)胞內(nèi)堆積，提高機(jī)體氧化應(yīng)激，引起細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙，學(xué)習(xí)記憶能力下降；而干預(yù)VC和低、中濃度驢乳清水解物能降低氧化應(yīng)激，進(jìn)而恢復(fù)部分學(xué)習(xí)記憶能力。

中樞疲勞理論認(rèn)為，耐力運(yùn)動(dòng)過程中，在肌糖原和肝糖原大量消耗的同時(shí)，血液中的支鏈氨基酸也隨之降低，但游離色氨酸水平升高，大量色氨酸進(jìn)入腦屏障轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥色胺，其可抑制中樞興奮性，從而產(chǎn)生嗜睡和疲勞的感覺。本實(shí)驗(yàn)中，衰老小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間較正常對(duì)照組明顯下降，隨著低、中濃度驢乳清水解物的逐漸干預(yù)，游泳時(shí)間延長且與衰老組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。證明低、中濃度驢乳清水解物在機(jī)體內(nèi)具有較好的抗疲勞作用。其可能機(jī)制是驢乳清水解物中乳清蛋白水解肽能在機(jī)體中更快地參與肌肉合成過程，同時(shí)乳清蛋白含有支鏈氨基酸，可以阻斷色氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，在延緩疲勞的同時(shí)，支鏈氨基酸阻止肌肉分解，促進(jìn)肌肉合成，對(duì)于修復(fù)運(yùn)動(dòng)損傷具有重要作用。

高濃度驢乳清粉水解物在體重增長率、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和負(fù)重游泳等實(shí)驗(yàn)結(jié)果與衰老組相比無差異，雖能降低衰老過程中的MDA含量，提高SOD活性，但仍與衰老組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造成這一結(jié)果的可能原因是大量氨基酸代謝脫氨，形成過量尿素在體內(nèi)堆積導(dǎo)致機(jī)體腎損傷，進(jìn)而與低、中濃度產(chǎn)生差異，具體損傷機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明驢乳清水解物低、中濃度在機(jī)體內(nèi)具有較好的抗氧化、抗疲勞和提高記憶力的作用。