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        miR-452-5p 靶向SOX5 調控信號通路對乳腺癌細胞增殖與侵襲的影響

        2021-12-13 12:29:34馮連杰付小娜趙世杰劉偉鵬
        實用醫(yī)藥雜志 2021年8期
        關鍵詞:熒光素酶細胞系靶向

        魏 濤,馮連杰,付小娜,趙世杰,劉偉鵬,梁 豪

        乳腺癌患者的死亡多由局部腫瘤轉移引起[1],在腫瘤轉移過程中,侵襲性癌細胞的增殖程序受基因的調控[2]。miRNA 是一類內源性非編碼小RNA,可通過與靶基因結合,調控蛋白的表達和細胞功能。已有研究發(fā)現,miR-452-5p 可抑制乳腺癌細胞轉移[3],miR-485-5p 通過靶向survivin 抑制乳腺癌的進展和化學敏感性[4]。在細胞中,小RNA 通過與靶基因的3'-未翻譯區(qū)互補結合抑制基因表達,研究顯示,miR-146a-5p 通過調控SOX5 的表達影響三陰性乳腺癌細胞的增殖和轉移[5]。SOX5 作為癌基因發(fā)揮作用,抑制SOX5 的表達可抑制非小細胞肺癌和前列腺癌的發(fā)展[6,7]。SOX5 被證明是由多個小RNA 調控的,但在乳腺癌中,miR-452-5p 是否調控SOX5 還沒有研究。筆者通過檢測miR-452-5p、SOX5 的表達,探討miR-452-5p 對乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料人乳腺上皮細胞株HBL-100、人乳腺癌MCF-7、SKBR-3、BT549 細胞株(上海細胞庫);胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司);Tranwell 小室(美國Millipore 公司);Matrigel 膠(美國BD 公司);MTT、DMSO(美國Sigma 公司);miRcon、miR-con mimic 的構建(上海吉凱基因公司);SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 一抗(美國Abcam 公 司);Twist、N-cadherin、Vimentin、βactin 抗體(美國CST 公司);lipofectamine TM2000轉染試劑(美國invitrogen 公司);SOX5 過表達載體及空載體、SOX5 野生型(WT)或突變型(MUT)熒光素酶報告載體(廣州復能基因有限公司);miR-452-5p、SOX5 引物(上海生工公司);IgG 二抗(北京博奧森生物科技有限公司);RIPA 裂解液、BCA 蛋白檢測試劑盒(美國Thermo scientificals 公司);酶標儀購自Bio-Red 公司;電子熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司;Western blot 發(fā)光成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 細胞的培養(yǎng)與分組 HBL-100、MCF-7、SKBR-3、BT549 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗首先分為空白對照組(NC),陰性對照組(miRcon),miR-452-5p 過表達組(miR-452-5p mimic);miR-con 組:將miR-con 轉染至SKBR-3 細胞中;miR-452-5p mimic 組:將miR-452-5p mimic 轉染至SKBR-3 細胞中。后續(xù)實驗分為miR-con 組,miR-452-5p mimic 組,miR-452-5p+pcDNA 組,miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組;miR-452-5p +pcDNA 組,將pcDNA空載體轉染miR-452-5p mimic 細胞;miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組,將pcDNA-SOX5 載體轉染miR-452-5p mimic 細胞,比較2 組間檢測數據的差異。

        1.2.2 細胞轉染 miR-452-5p mimic、miR-con 使用lipofectamineTM2000 轉染試劑進行轉染,轉染后6 h 后更換培養(yǎng)基,熒光顯微鏡下觀察轉染效率;pcDNA-SOX5 通過慢病毒轉染細胞。

        1.2.3 實時熒光定量PCR 細胞中提取總RNA,反轉錄為cDNA,熒光定量PCR 儀進行實時熒光定量PCR,反應參數設置為95 ℃預變性2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40 個循環(huán)。以U6 和β-actin 分別為miR-452-5p、SOX5 的內參基因,采用2-ΔΔct方法計算miR-452-5p、SOX5 的相對表達量,實驗重復3 次取平均值。引物序列:miR-452-5p:F 5'-GACCCAATACGAGTCGGCAATTCCA ACT-3',R 5'-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3';U6:F 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',R 5'-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3';SOX5:F 5'-CAGCCAG AGTTAGCACAATAGG-3',R 5'-CTGTTGTTCCCGT CGGAGTT-3';β-actin:F 5'-GGAGCGAGATCCCT CCAAAAT-3',R 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT GG-3'。

        1.2.4 MTT 法檢測細胞增殖情況 調整SKBR-3細胞濃度至5×104個/ml,96 孔板每孔加入100 μl細胞懸液,分別于24 h,48 h,72 h 檢測細胞活力;每孔加入MTT 試劑20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心保留下層細胞,每孔加入100 μl DMSO,錫箔紙包裹震蕩孵育15 min,酶標儀檢測490 nm 波長的吸光度。

        1.2.5 Transwell 實驗檢測乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力 Transwells 小室接種5×104個SKBR-3 細胞,培養(yǎng)24 h 后檢測遷移至小室膜細胞數,200 倍光鏡下隨機選取5 個視野比較穿膜細胞數。Matrigel包被小室基底膜,其余步驟與遷移實驗相同,檢測細胞侵襲能力。實驗均獨立重復3 次。使用相同方法檢測miR-con 組,miR-452-5p mimic 組,miR-452-5p+pcDNA 組,miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組SKBR-3 細胞的遷移侵襲能力。

        1.2.6 雙熒光素酶實驗檢測miR-452-5p 對SOX5的影響 構建野生型pGL3-SOX5-3’UTR(wt-SOX5 3’UTR)和突變型pGL3-SOX5-3’UTR(mutpGL3-SOX5-3’UTR)表達載體轉染至miR-con、miR-452-5p mimic SKBR-3 細胞,轉染后48 h 裂解細胞,雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測雙熒光素酶活性,檢測miR-452-5p 對SOX5 熒光活性的調控。

        1.2.7 采用蛋白印跡(western blot,WB)法檢測蛋白表達情況 RIPA 裂解液裂解細胞,提取細胞中總蛋白,BCA 試劑盒測定蛋白濃度;SDS 變性蛋白;電泳轉膜封閉1,一抗以1∶500 稀釋后4 ℃孵育過夜,二抗孵育1 h,ECL 顯影液顯影,AI600 成像系統(tǒng)觀察目的蛋白條帶,Image J 軟件對目的條帶進行灰度值分析,以β-Actin 為內參進行灰度值比較。

        1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 進行數據分析。2 組間比較采用t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用snk-q 檢驗;以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 miR-452-5p 和SOX5 在乳腺癌細胞系中的表達RT-qPCR 檢測結果顯示,乳腺癌細胞系MCF-7、SKBR-3、BT549 中miR-452-5p 表達顯著低于正 常乳腺癌細胞系HBL-100(P<0.05),且SKBR-3 細胞中miR-452-5p 表達水平最低(圖1A)。乳腺癌細胞系MCF-7、SKBR-3、BT549 中SOX5 mRNA 及蛋白水平顯著高于HBL-100(P<0.05),且SKBR-3 細胞中SOX5 mRNA 及蛋白水平均最高(圖1B~D),選擇乳腺癌細胞系SKBR-3 進行后續(xù)功能實驗。

        圖1 miR-452-5p、SOX5 在乳腺癌細胞系中的表達

        2.2 轉染miR-452-5p 抑制乳腺癌SKBR-3 細胞增殖在SKBR-3 細胞中分別轉染 miR-con、NC和miR-452-5p mimic,RT-qPCR 檢測顯示,與NC、miR-con 組比較,轉染miR-452-5p mimic 后,乳腺癌SKBR-3 細胞miR-452-5p 表達水平顯著升高(P<0.05)(圖2A)。MTT 檢測顯示,與NC、miR-con組比較,過表達miR-452-5p 后乳腺癌SKBR-3 細胞活性顯著降低(P<0.05)(圖2B)。Western blot 結果顯示,與NC、miR-con 組比較,過表達miR-452-5p 后,細胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4 表達水平顯著降低(P<0.05)(圖2C、D)。

        圖2 轉染miR-452-5p 對乳腺癌細胞增殖的影響

        2.3 轉染miR-452-5p 抑制乳腺癌SKBR-3 細胞遷移和侵襲Transwell 侵襲實驗顯示,與NC、miR-con 組比較,轉染miR-452-5p mimic 組乳腺癌SKBR-3 細胞遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)(圖3A、B),提示miR-452-5p 能夠抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。Western blot 結果顯示,與NC、miR-con 組比較,過表達miR-452-5p 后,乳腺癌SKBR-3 細胞中與侵襲、轉移密切相關的MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)(圖3C、D)。

        圖3 轉染miR-452-5p 對抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響

        2.4 miR-452-5p 靶向SOX5TargetScan 軟件預測miR-452-5p 與SOX5 3’UTR 存在結合位點(圖4A),熒光素酶實驗進一步驗證miR-452-5p 與SOX53’UTR 關系,根據預測結果構建SOX5-WT-3’UTR 和SOX5-MUT-3’UTR 質粒,分別與miR-452-5p mimic 或miR-452-5p NC 共轉染至SKBR-3 細胞,熒光素酶報告基因顯示,只有SOX5-WT--3’UTR 與miR-452-5p mimic 共轉染組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),其余三組熒光素酶活性無明顯差異,提示miR-452-5p 可與SOX5 特異性結合(圖4B)。Western blot 結果顯示,過表達miR-452-5p 后SOX5 表達顯著減少,沉默miR-452-5p后SOX5 表達顯著升高(P<0.05)(圖4C)。

        圖4 miR-452-5p 靶向SOX5

        2.5 過表達SOX5 降低miR-452-5p 對乳腺癌SKBR-3 細胞的抑制作用MTT 檢測顯示,與miR-con 組比較,過表達miR-452-5p 后,miR-452-5p 組乳腺癌SKBR-3 細胞增殖活性受到抑制,遷移數和細胞侵襲數顯著減少,SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平均顯著降低(P<0.05);過表達SOX5 后,與miR-452-5p+pcDNA 組比較,miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組細胞活性顯著增加、遷移和侵襲數顯著增加,SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著增加(P<0.05)(圖5)。

        圖5 過表達SOX5 部分逆轉miR-452-5p 抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲

        2.6 miR-452-5p 調控SOX5 影響乳腺癌SKBR-3細胞中Twist1 信號通路和EMT 的發(fā)生Western blot 結果顯示,與miR-con 組比較,過表達miR-452-5p 后,Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平顯著降低,E-cadherin 水平顯著升高(P<0.05);過表達SOX5 后,與miR-452-5p 組比較,miR-452-5p+pcDNA-SOX5 組Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋 白水平顯著增加,E-cadherin 水平顯著降低,miR-452-5p+pcDNA 組各蛋白水平與miR-452-5p 組無顯著變化(圖6)。

        圖6 miR-452-5p 調控SOX5 影響乳腺癌細胞中AKT 信號通路

        3 討論

        乳腺癌進展緩慢,但仍是引起女性癌癥死亡的主要原因[8]。目前關于乳腺癌的治療主要有手術、化療、放療、激素治療和靶向治療。隨著對乳腺癌研究的深入,目前的治療方法極大地改善了患者的預后,但是耐藥性和腫瘤細胞復發(fā)轉移仍然限制了當前治療方法的有效性。

        miRNA 是一類長約20~25 個核苷酸的內源性非編碼小RNA,通過堿基互補配對的方式與靶基因結合,調控基因的表達。有研究報道,提高miR-452-5p 的表達可抑制肝癌細胞的惡性侵襲和遷移[9]。該研究結果顯示,miR-452-5p 在乳腺癌細胞中低表達,過表達miR-452-5p 可抑制細胞的增殖、侵襲和轉移,與上述研究結果相似,提示miR-452-5p 在乳腺癌細胞中發(fā)揮抑癌基因作用。

        Cyclin D1 調控細胞增殖周期的G1-S 過程,其在正常組織中不表達或者低表達,在惡性腫瘤組織中高表達[10]。CDK 也是調節(jié)細胞周期的重要蛋白,包括CDK1~7,CDK 蛋白的激活依賴于Cyclin 的結合[11]。CDK4 是細胞增殖周期G1-S 過程的重要成分,其在腫瘤和細胞系中異常高表達[12]。研究報道,喉癌細胞中Cyclin D1、CDK4 表達水平顯著高于正常喉上皮細胞,抑制Cyclin D1 或CDK4 表達后喉癌細胞的增殖受到抑制[13]。該研究中過表達miR-452-5p 后,乳腺癌SKBR-3 細胞Cyclin D1、CDK4蛋白水平顯著降低,提示miR-452-5p 發(fā)揮抑癌基因作用,阻滯細胞的增殖。

        MMPs 活化可促進細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)降解,促進癌細胞的侵襲和轉移[14]。研究報道,MMP-2、MMP-9 在人卵巢黏液囊腺上皮癌細胞高表達,其表達水平與細胞的惡性程度,侵襲和轉移密切相關[15]。該研究中過表達miR-452-5p后,乳腺癌SKBR-3 細胞MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著降低,提示過表達miR-452-5p 可抑制細胞侵襲和轉移能力,進一步驗證了miR-452-5p 的抑癌作用。

        TargetScan 軟件預測miR-452-5p 與SOX5 3’UTR 存在結合位點,該研究進一步采用雙熒光素酶實驗驗證顯示,miR-452-5p 靶向調控SOX5 的表達。SOX 家族可編碼包括SOX1~15、17、18、21、30等一系列轉錄因子,SOX5 基因位于染色體12p12.1區(qū)域,其在細胞生長、增殖、分化中發(fā)揮重要作用[16]。近年來發(fā)現,SOX5 作為癌基因在前列腺癌、三陰性乳腺癌等幾種癌癥中高表達[5,7]。該研究結果顯示,SOX5 在乳腺癌細胞系中的表達水平顯著高于正常乳腺癌細胞,與上述研究結果一致,提示SOX5 在乳腺癌中發(fā)揮癌基因作用。研究表明,SOX5 可以被小RNA 調控,在前列腺癌細胞中,miR-139-5p 的升高導致SOX5 表達下降[17]。該研究中過表達miR-452-5p 后,乳腺癌SKBR-3 細胞SOX5 蛋白水平顯著降低,提示miR-452-5p 可調控SOX5 的表達。研究報道,過表達SOX5 可促進胃癌細胞的增殖和侵襲[18]。該研究中過表達SOX5 后發(fā)現,細胞的增殖活性顯著增強,細胞遷移和侵襲數顯著增加,SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著增加,提示過表達SOX5,可降低miR-452-5p 對乳腺癌細胞的增殖抑制、侵襲和遷移抑制作用。惡性腫瘤的發(fā)展是多因素、多步驟的病理變化,有研究報道,Twist信號通路、EMT 過程與多種腫瘤細胞的侵襲轉移途徑相關,調節(jié)前列腺癌細胞中SOX5 的表達,可以抑制Twist 表達進而抑制EMT 過程[19]。該研究中過表達miR-452-5p 后,Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平顯著降低,E-cadherin 水平顯著升高,EMT進程受到抑制。過表達SOX5 后,Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平顯著增加,E-cadherin 水平顯著降低,減弱miR-452-5p 對EMT 的抑制作用,提示可通過調節(jié)SOX5 表達調控EMT 過程。從機制上講,miR-452-5p 調控SOX5 的表達,抑制EMT 過程,抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移,為miR-452-5p作為乳腺癌的治療靶點提供有力的理論依據。

        綜上所述,該研究初步證實miR-452-5p 可能通過靶向SOX5 調控Twist 信號通路進而抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移,其機制可能與Twist 通路相關。

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