洪曉泉 傅錦波 林福生 羅曄哲 林恩德

（廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院普通外科 福建廈門361004）

結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer）是近年來發(fā)病率和病死率上升顯著的一類癌癥，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率位居第三，病死率位居第四，且在發(fā)達(dá)國家和地區(qū)更為多見[1～3]。鳶尾黃酮（Tectorigenin）是鳶尾科植物射干中的一種成分，研究表明其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種作用，并可能對細(xì)胞自噬過程存在影響[4～6]。自噬性死亡（Autophagic Cell Death）是指依賴于自噬過程的程序性細(xì)胞死亡。對細(xì)胞自噬過程的干預(yù)可能導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制的失衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7～9]。本研究分析了鳶尾黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞自噬水平的影響，并通過聯(lián)合使用抑制劑及下調(diào)自噬過程關(guān)鍵蛋白探究鳶尾黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性及凋亡的影響?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株來源和制劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480和正常人結(jié)腸細(xì)胞系CCD 841 CoN購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection,ATCC）。高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購自美國Hyclone公司。鳶尾黃酮購自Sigma-Aldrich公司。凋亡抑制劑Z-VAD-FMK（S7023）、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（S7243）、壞死性凋亡抑制劑（S8037）購自美國Selleck公司。CCK-8試劑購自博士德公司。兔抗人p62（#8025）、兔抗人LC3（#3868）抗體購自美國CST公司，鼠抗人GAPDH（#AC033）購自武漢愛博泰克公司。Trizol、Lipofectamine 2 000試劑購自美國Thermo Fisher公司。SiATG5及siNC由銳博生物科技有限公司負(fù)責(zé)構(gòu)建。

1.2 研究方法

1.2.1 人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞培養(yǎng) 在加入雙抗的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2天更換新鮮培養(yǎng)基或進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性及半抑制濃度（IC50）曲線的繪制 取對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和正常人結(jié)腸細(xì)胞系CCD 841 CoN，以10^4 CCU/ml的密度種于96孔板中并加入100μl培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后吸取上清液，分別加入100μl含不同濃度鳶尾黃酮及相應(yīng)抑制劑的培養(yǎng)基，以加入二甲基亞砜（DMSO）組作為陰性對照，僅加培養(yǎng)基組作為空白對照，每組設(shè)5個復(fù)孔。待培養(yǎng)24 h后吸棄上清，每孔加入10μl CCK-8液及100μl培養(yǎng)基，37℃孵育1 h后于酶標(biāo)儀波長450 nm處讀取吸光度（OD）值。根據(jù)吸光度值計算細(xì)胞增殖的相對速率，以鳶尾黃酮濃度作為橫軸，細(xì)胞增長抑制率作為縱軸，擬合出IC50曲線，曲線上抑制率為50%的點所對應(yīng)的濃度即為鳶尾黃酮在SW480細(xì)胞系和正常人結(jié)腸細(xì)胞系CCD 841 CoN中的IC50值。

1.2.3 Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況取對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，分別加入50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L鳶尾黃酮，并以加入DMSO作為對照組。作用24 h后以放射免疫沉淀法（Radio-Immunoprecipitation Assay,RIPA）提取蛋白，檢測蛋白濃度并根據(jù)濃度調(diào)整上樣量，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后以LC3、p62及GAPDH一抗4℃孵育過夜、TBST洗膜3次后，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后采用增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）曝光。

1.2.4 透射電鏡觀察結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量取對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480于6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入200μmol/L鳶尾黃酮作用24 h，對照組加入等量DMSO。培養(yǎng)24 h后棄去上清，加入2.5%戊二醛，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞收集入EP管中，離心棄上清后以2.5%戊二醛重懸，并于4℃固定。經(jīng)鋨酸固定、丙酮逐級脫水、環(huán)氧樹脂包埋后作超薄切片，染色后于透射電鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。取4個視野下結(jié)腸癌細(xì)胞SW480內(nèi)自噬體的平均數(shù)量進(jìn)行對比。

1.2.5 小干擾RNA（siRNA）沉默自噬關(guān)鍵蛋白ATG5轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時，使用Lipofectamine2000將siATG5及對應(yīng)的陰性對照物（siNC）轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，24 h后換液，48 h時取部分細(xì)胞提取RNA并確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率，剩余細(xì)胞重新種板，待貼壁后，取siATG5及siNC組加入200μmol/L鳶尾黃酮，另取siNC組加入DMSO作為對照。分別使用或不使用Z-VAD預(yù)處理并作用24 h后用CCK-8法（同1.2.2）檢測細(xì)胞增殖活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗均設(shè)3次重復(fù)，實驗數(shù)據(jù)的分析處理采用SPSS23.0軟件，柱狀圖及曲線繪制采用Graphpad Prism7軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鳶尾黃酮在結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和正常人結(jié)腸細(xì)胞系CCD 841 CoN中的IC50比較 使用CCK-8法分析不同濃度鳶尾黃酮作用下結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480的生長抑制情況，繪制得出對應(yīng)的IC50曲線，通過曲線進(jìn)一步得出SW480細(xì)胞系中鳶尾黃酮的IC50為（221.90±35.31）μM，CCD 841CoN細(xì)胞系中鳶尾黃酮的IC50為（327.50±7.89）μM。見圖1。

圖1 鳶尾黃酮作用于SW480和CCD 841 CoN細(xì)胞的IC50曲線

2.2 鳶尾黃酮作用于SW480細(xì)胞的克隆平板實驗結(jié)果 根據(jù)2.1中的IC50結(jié)果，將鳶尾黃酮的作用濃度定為200μM?？寺∑桨鍖嶒灡砻?，鳶尾黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞的長期增殖能力具有抑制作用。其中，對照組克隆形成個數(shù)平均為（219.00±7.94）個，鳶尾黃酮作用組克隆形成個數(shù)平均為（133.30±6.33）個，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.436，P＜0.01），說明鳶尾黃酮抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的長期增殖能力。見圖2。

圖2 鳶尾黃酮作用于SW480細(xì)胞的克隆平板實驗結(jié)果

2.3 不同抑制劑預(yù)處理后鳶尾黃酮作用下SW480細(xì)胞活性檢測結(jié)果 為進(jìn)一步明確鳶尾黃酮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480增殖能力的機制，分別使用凋亡抑制劑Z-VAD（50μM）、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（1μM）、壞死性凋亡抑制劑Necrostatin-1（1μM）預(yù)處理SW480細(xì)胞1 h后，加入200μM鳶尾黃酮繼續(xù)作用24 h。結(jié)果表明凋亡抑制劑Z-VAD顯著逆轉(zhuǎn)了鳶尾黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用，其中鳶尾黃酮單藥作用組平均吸光度為（0.82±0.04），Z-VAD預(yù)處理組平均吸光度為（1.25±0.04），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.12，P＜0.01），說明鳶尾黃酮激活了結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480的凋亡。而Ferrostatin-1、Necrostatin-1預(yù)處理組與鳶尾黃酮單藥作用組無明顯差異（P＞0.05）。見圖3。

圖3 不同抑制劑預(yù)處理后鳶尾黃酮作用下SW480細(xì)胞活性檢測

2.4 Western blot檢測不同濃度鳶尾黃酮作用后SW480細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白變化情況 使用Western blot檢測0μM、50μM、100μM、200μM鳶尾黃酮作用24 h后結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480中自噬相關(guān)蛋白的變化情況，結(jié)果表明，隨著鳶尾黃酮作用濃度的升高，SW480細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白水平逐漸增高，p62逐漸降低，提示鳶尾黃酮作用后SW480細(xì)胞的自噬被激活。見圖4。

圖4 鳶尾黃酮作用于SW480細(xì)胞后蛋白免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白含量的變化情況

2.5 SW480細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量變化情況電鏡觀察結(jié)果 采用透射電鏡分別對200μM鳶尾黃酮作用24 h后以及未經(jīng)處理的SW480細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，鳶尾黃酮作用后SW480細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量明顯增多。其中，對照組SW480細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量平均為（5.00±1.16）個，200μM鳶尾黃酮作用24 h后的SW480細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量平均為（29.67±2.91）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.888，P＜0.01）。見圖5。

圖5 鳶尾黃酮作用于SW480細(xì)胞后其細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量變化情況電鏡觀察結(jié)果

2.6 沉默ATG5聯(lián)合Z-VAD作用下鳶尾黃酮作用于SW480細(xì)胞的細(xì)胞活性檢測結(jié)果 分別使用siATG5和siNC對SW480細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后提取細(xì)胞核糖核酸（RNA），用qPCR進(jìn)行ATG5表達(dá)量檢測以驗證敲低效率，結(jié)果顯示siATG5組ATG5相對表達(dá)量為（0.42±0.03）。使用上述驗證過的siATG5和siNC質(zhì)粒對SW480細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，伴或不伴Z-VAD預(yù)處理的情況下加入200μM鳶尾黃酮或等量DMSO，作用24 h后使用CCK-8法檢測SW480細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果表明，鳶尾黃酮的殺傷作用在轉(zhuǎn)染了siATG5的SW480細(xì)胞中受到了抑制，沉默ATG5抑制了鳶尾黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用。其中，鳶尾黃酮作用于siNC對照組平均吸光度為（0.94±0.04），作用于siATG5實驗組平均吸光度為（1.42±0.06），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.225，P＜0.01）。同時，siATG5聯(lián)合Z-VAD預(yù)處理實驗組平均吸光度為（1.42±0.04），與僅轉(zhuǎn)染siATG5的實驗組相比，未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異（t=0.516，P＞0.05）。表明Z-VAD預(yù)處理并未在轉(zhuǎn)染了siATG5的結(jié)腸癌細(xì)胞中進(jìn)一步抑制鳶尾黃酮的殺傷作用。見圖6。

圖6 沉默ATG5聯(lián)合Z-VAD作用下鳶尾黃酮作用于SW480細(xì)胞的細(xì)胞活性檢測結(jié)果

3 討論

隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率正逐年上升，且城市地區(qū)遠(yuǎn)高于農(nóng)村[10～11]。結(jié)腸癌早期可無明顯癥狀，多數(shù)病人發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，其總體發(fā)病率在惡性腫瘤中處于前列，盡管醫(yī)療工作者在治療上進(jìn)行了諸多嘗試，但結(jié)腸癌仍然是威脅生命安全的主要惡性腫瘤之一，對化療藥物的耐藥是結(jié)腸癌治療中面臨的主要問題[12～14]。結(jié)腸癌的病因?qū)W涉及遺傳及環(huán)境因素，而一些新的有機化合物通過不同的機制調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答并發(fā)揮其抗癌作用，這些機制包括調(diào)節(jié)凋亡、自噬、抑制血管生成以及上調(diào)抑癌基因等[15～17]。有研究表明，鳶尾黃酮可以通過NF-κB和MAPK通路抑制增殖而起到抗腫瘤的作用，此外，其在小鼠巨噬細(xì)胞中還能抑制干擾素γ/脂多糖導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。同時，其對細(xì)胞自噬過程可能存在影響[18～20]。自噬是細(xì)胞調(diào)節(jié)環(huán)境和遺傳壓力的基本反應(yīng)機制，兩種途徑相互聯(lián)系，并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對環(huán)境刺激的反應(yīng)[21～23]。本研究著重探究了鳶尾黃酮作用后結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及自噬情況的變化，并通過下調(diào)自噬過程關(guān)鍵基因ATG5，探究鳶尾黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用與其對自噬的影響是否有關(guān)。

本研究通過CCK-8法對不同濃度鳶尾黃酮作用下結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行了測定，并繪制出了IC50曲線，結(jié)果表明鳶尾黃酮在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中的IC50約為（221.90±35.31）μM。同時，我們也通過同樣的方法繪制了鳶尾黃酮作用于正常人結(jié)腸細(xì)胞系的IC50曲線，得到鳶尾黃酮在正常人結(jié)腸細(xì)胞系CCD 841 CoN的半抑制濃度約為（327.50±7.89）μM，表明鳶尾黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞更敏感，而對正常人結(jié)腸細(xì)胞具有更小的毒性。隨后我們通過克隆平板實驗，進(jìn)一步確認(rèn)了鳶尾黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞長期增殖能力的抑制作用。并且，通過使用不同抑制劑的預(yù)處理，我們發(fā)現(xiàn)凋亡抑制劑Z-VAD顯著逆轉(zhuǎn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的死亡，而鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（1μM）和壞死性凋亡抑制劑Necrostatin-1（1μM）對其抑制作用無明顯效應(yīng)，表明鳶尾黃酮激活了結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡通路。Western blot結(jié)果表明鳶尾黃酮作用后細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ含量上升，而自噬降解底物蛋白p62表達(dá)下降；同時，透射電鏡觀察到鳶尾黃酮作用后結(jié)腸癌細(xì)胞中自噬體的數(shù)量明顯增加，表明鳶尾黃酮激活了結(jié)腸癌細(xì)胞的自噬過程。

ATG5被認(rèn)為是自噬過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。其在自噬體的形成過程中起著至關(guān)重要的作用，ATG5缺失或突變的細(xì)胞將不能有效地形成自噬體[24～26]。本研究通過向結(jié)腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siATG5使ATG5蛋白表達(dá)量下降，從而抑制了細(xì)胞的自噬作用，并聯(lián)合鳶尾黃酮作用后發(fā)現(xiàn)其對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用明顯減弱。由此我們認(rèn)為，鳶尾黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷與其激活自噬過程存在聯(lián)系。既往研究表明自噬是細(xì)胞在外界應(yīng)激條件下對細(xì)胞內(nèi)組分進(jìn)行吞噬和清除的過程[27～28]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)自噬過度激活時，由于胞內(nèi)成分被過度吞噬和消化，將會引起細(xì)胞的自噬性死亡[29～31]。同時，轉(zhuǎn)染siATG5后聯(lián)合使用凋亡抑制劑Z-VAD并未進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)鳶尾黃酮對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用，表明鳶尾黃酮很可能通過促進(jìn)細(xì)胞自噬進(jìn)而激活了結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡通路，從而引起結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。綜上所述，鳶尾黃酮通過促進(jìn)細(xì)胞自噬抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，并激活其凋亡通路。鳶尾黃酮對自噬過程的影響有望使其成為抗結(jié)腸癌治療的候選藥物。