張宏岐，鄧改改，汪鋆植，胡 昆，陳瀅潞，李堂麗

1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué))；3湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心(三峽大學(xué))，宜昌 443002

忍冬木層孔菌(Phellinuslonicerinus(Bond.) Bond.et Sing)為木層孔菌屬的一種多孔真菌，其干燥子實(shí)體是藥用真菌桑黃的品種之一，也是土家族常用藥材,收載于《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2009年版[1]。桑黃是目前國(guó)際公認(rèn)的抗癌效果最好的藥用真菌之一，作為桑黃使用的裂蹄針層孔菌P.linteus，鮑氏木層孔菌P.baumii等忍冬木層孔菌近緣品種的抗癌活性均有報(bào)道[2]。課題組前期對(duì)忍冬木層孔菌子實(shí)體化學(xué)成分[3]、抗腫瘤活性[4,5]、質(zhì)量控制[6]進(jìn)行了研究。但由于受氣候條件、地理分布及寄主植物的影響，野生桑黃資源珍稀瀕危，桑黃的人工發(fā)酵可以較容易地對(duì)各種生長(zhǎng)影響因素進(jìn)行控制和優(yōu)化，獲得穩(wěn)定高產(chǎn)的培養(yǎng)物。為獲得桑黃基源菌種培養(yǎng)物替代野生桑黃子實(shí)體的潛在價(jià)值，探究發(fā)酵培養(yǎng)物和子實(shí)體之間的共同之處并加以利用，本文對(duì)忍冬木層孔菌培養(yǎng)液及其菌絲體中的化學(xué)成分進(jìn)行了研究并對(duì)單體化合物的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了測(cè)試，以期為桑黃培養(yǎng)物替代子實(shí)體來(lái)獲得相關(guān)的活性化合物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器

Bruker 400 MHz核磁共振波譜儀(Bruker公司，瑞士)；Finnigin電噴霧質(zhì)譜儀(Finnigin公司，美國(guó))；Waters1525EF(Waters公司，美國(guó))和Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀(戴安公司，美國(guó))；制備柱為Cosmosil Packed Column 5C-MS-Ⅱ10ID×250 nm；分析柱為Cosmosil Packed Column 5C-MS-Ⅱ4.6ID×250 nm(Nacalai公司，日本)；WZZ-2S數(shù)字式自動(dòng)旋光儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，瑞士)；U-3010紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日立儀器(上海)有限公司，日本)；N21001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)等；柱色譜和薄層色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品，其他試劑均為分析純。

1.1.2 菌種及細(xì)胞株

實(shí)驗(yàn)用忍冬木層孔菌采自湖北宜昌，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所卯曉嵐教授鑒定為忍冬木層孔菌(Phellinuslonicerinus(Bond.) Bond.et Sing)，標(biāo)本及菌種現(xiàn)保存于三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

胃癌細(xì)胞株HGC-27、宮頸癌細(xì)胞株HeLa、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL95-2均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種發(fā)酵培養(yǎng)

將菌種從4 ℃冰箱中取出于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后轉(zhuǎn)接至PDA固體平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7天?；罨蟮木N長(zhǎng)滿平板后，用滅菌的打孔器打孔，取菌齡一致的5塊菌塊接種至液體培養(yǎng)基中(250 mL/500 mL三角瓶)，25 ℃、150 rpm恒溫震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后用勻漿機(jī)在超凈工作臺(tái)中勻漿，作為種子培養(yǎng)液以10%接種量接種至新的液體培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃、150 rpm恒溫震蕩培養(yǎng)14天。新培養(yǎng)基配方：葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨4 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.75 g/L，VB10.024 475 μg/L。

1.2.2 提取分離

菌株發(fā)酵14天后，發(fā)酵液經(jīng)3～4層紗布過(guò)濾后除菌絲體，濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，45 °C真空濃縮后得乙酸乙酯萃取物2.5 g。過(guò)濾得到的菌絲體經(jīng)烘箱45 °C干燥后，用適量95%乙醇冷凝回流提取3次，合并乙醇相，真空濃縮后乙酸乙酯萃取，回收溶劑得乙酸乙酯萃取物1.6 g。

發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物2.5 g，甲醇溶解后，經(jīng)200～300目正相硅膠柱層析分離，以石油醚-丙酮(100∶0、90∶10、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、1∶1)梯度洗脫，甲醇沖柱得10個(gè)組分(Fr.1～ Fr.10)，F(xiàn)r.3(200 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(氯仿：甲醇=1∶1)凝膠色譜，繼而經(jīng)反相HPLC半制備色譜(30%乙腈-水為流動(dòng)相)，反復(fù)純化得化合物1(22.8 mg)、2(16.3 mg)、3(10.2 mg)、4(5.6 mg)。Fr.4(100 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇=1∶1)凝膠色譜，繼而經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、1∶1)梯度反復(fù)純化得化合物8(10.6 mg)、9(7.8 mg)、10(9.6 mg)。

菌絲體提取物乙酸乙酯萃取物1.6 g，丙酮溶解后，經(jīng)200～300目正相硅膠柱層析分離，以石油醚-丙酮(100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、1∶1)梯度洗脫，甲醇沖柱得7個(gè)組分(Fr.1～Fr.7)，F(xiàn)r.3(300 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇=1∶1)凝膠色譜，繼而經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、1∶1)梯度反復(fù)純化得化合物5(30.2 mg)、6(11.6 mg)、7(22.3 mg)。

1.2.3 細(xì)胞毒活性篩選

用MTT法檢測(cè)10個(gè)化合物對(duì)HGC-27、HeLa、MCF-7、RL95-2細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性。從母液開(kāi)始，依次4倍稀釋，共5個(gè)梯度，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27、HeLa、MCF-7及RL95-2細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔100 μL(約1×104個(gè)細(xì)胞/孔)，6 h后加入不同濃度藥物100 μL，每一濃度3個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后加入MTT 10 μL(質(zhì)量濃度為5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜100 μL后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定492 nm處吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=[(對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/對(duì)照組平均OD值]×100%。以濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，應(yīng)用兩點(diǎn)法計(jì)算化合物的IC50值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-10

化合物8無(wú)色晶體(EtOAc)；ESI-MS：m/z137 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.52(5H，m，H-2，3，4，5，6)，3.65(2H，s，H-7)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：178.4(C-8)，133.8(C-1)，129.9(C-5)，129.2(C-6)，129.2(C-3)，127.9(C-4)，127.9(C-5)，41.6(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對(duì)照基本一致，故確定化合物8為苯乙酸。

化合物9白色結(jié)晶(EtOAc)；ESI-MS：m/z267 [2M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：9.88(1H，s，CHO)，7.83(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2，6)，6.96(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3，5)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：191.1(CHO)，167.8(C-4)，132.5(C-2)，132.5(C-6)，130.2(C-1)，115.9(C-5)，115.6(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]對(duì)照基本一致，故確定化合物9為對(duì)羥基苯甲醛。

化合物10無(wú)色晶體(EtOAc)；ESI-MS：m/z151[M-H]-；1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：7.52(2H，m，H-2，6)，6.78(2H，s，H-3，5)，3.48(2H，s，H-7)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：172.0(C-8)，153.4(C-4)，136.5(C-1)，129.2(C-2)，128.2(C-6)，126.4(C-3)，126.4(C-5)，42.5(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]對(duì)照基本一致，故確定化合物10為4-羥基苯乙酸。

2.2 體外細(xì)胞毒活性篩選

對(duì)忍冬木層孔菌液體培養(yǎng)物中分離得到化合物1～10進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞HGC-27、HeLa、MCF-7、RL95-2的體外細(xì)胞毒活性測(cè)試。結(jié)果顯示化合物1～4對(duì)HGC-27和RL95-2細(xì)胞株有不同程度的抑制活性(見(jiàn)表1)，其余化合物濃度為100 μM時(shí)對(duì)以上四種腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒活性，表中未列出。其中化合物3抑制活性最強(qiáng)，進(jìn)一步復(fù)篩結(jié)果顯示，陽(yáng)性藥順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞HGC-27、HeLa、MCF-7、RL95-2的IC50分別為15.36、38.36、36.16和1.53 μM；化合物3對(duì)HGC-27和RL95-2的IC50分別為6.69、12.81 μM，該化合物對(duì)HGC-27的抑制活性優(yōu)于陽(yáng)性藥。

表1 化合物1～4對(duì)HGC-27、Hela、MCF-7及RL95-2的細(xì)胞毒活性Table 1 Cytotoxicity of compounds 1-4 on HGC-27,Hela,MCF-7 and RL95-2 cell

3 結(jié)論

本研究從忍冬木層孔菌液體培養(yǎng)物中分離得到10個(gè)化合物，除化合物5、6和7外，其余7個(gè)化合物均為首次從該種真菌中分離得到。化合物5～7為麥角甾醇類化合物，忍冬木層孔菌子實(shí)體中也存在大量的麥角甾醇類化合物[15]，說(shuō)明桑黃類真菌菌絲體在甾醇類化合物方面具有代替子實(shí)體的可能。化合物1～4為環(huán)二肽類成分，有研究報(bào)道在桑黃類真菌火木層孔菌的發(fā)酵液和菌絲體中分離鑒定了14個(gè)該類化合物[16]，但在忍冬木層孔菌子實(shí)體中只報(bào)道過(guò)環(huán)(亮-纈)二肽成分[15]，提示環(huán)二肽類成分同時(shí)存在于忍冬木層孔菌子實(shí)體及發(fā)酵培養(yǎng)物中。同時(shí)，體外細(xì)胞毒活性顯示化合物1～4對(duì)HGC-27和RL95-2細(xì)胞株有不同程度的抑制活性，其中化合物3抑制活性最強(qiáng)，對(duì)HGC-27和RL95-2細(xì)胞株的IC50分別為6.69 μM和12.81 μM。上述研究說(shuō)明桑黃基源真菌培養(yǎng)物中代謝產(chǎn)物與子實(shí)體具有一些共同的化學(xué)成分和藥理作用，因此，加大對(duì)桑黃基源真菌培養(yǎng)物中有效成分和藥理活性的研究，可為桑黃類真菌活性成分的工業(yè)化生產(chǎn)及可持續(xù)利用提供一個(gè)新的解決途徑。