朱洪竹，朱梅菊

井岡山大學(xué)體育學(xué)院，吉安 343009

2型糖尿病患者約有65%均伴有腦認(rèn)知功能障礙，且在其早期就有所體現(xiàn)，隨病程延長加重[1]。糖尿病認(rèn)知功能障礙的臨床主要表現(xiàn)在學(xué)習(xí)和記憶能力，特別是空間定位能力的下降等，甚至發(fā)展成阿爾茨海默病，已成為全球性的醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生問題?，F(xiàn)已知，藥物治療在糖尿病學(xué)習(xí)記憶治療中是必需的，但臨床治療效果并不理想，且不良反應(yīng)多。最近越來越多研究認(rèn)為，使用天然產(chǎn)物防治糖尿病學(xué)習(xí)記憶，可以產(chǎn)生同樣的功效而不良反應(yīng)少[2]。螺旋藻是一種營養(yǎng)全面、均衡的純天然食品，其生物學(xué)功能包括抗疲勞、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等。有關(guān)螺旋藻與糖尿病的相關(guān)研究主要集中在其降低血糖，抑制腎臟炎癥信號(hào)通路抗炎[3]等方面。最新發(fā)現(xiàn)，螺旋藻有抗阿爾茨海默病小鼠記憶損傷作用[4]。而螺旋藻對糖尿病機(jī)體學(xué)習(xí)記憶的影響研究甚少。有氧運(yùn)動(dòng)是防治糖尿病學(xué)習(xí)記憶功能的基礎(chǔ)。Kim等[5]研究表明，傳統(tǒng)有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可改善糖尿病大鼠的短期記憶和空間學(xué)習(xí)能力。但至目前為止，有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合螺旋藻補(bǔ)充對糖尿病機(jī)體學(xué)習(xí)記憶的影響則仍未闡明。

為此，本研究擬采用2型糖尿病大鼠模型，研究有氧運(yùn)動(dòng)和螺旋藻改善糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶和對細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein，CREB)信號(hào)通路蛋白及海馬細(xì)胞凋亡的影響，為尋找新的改善糖尿病機(jī)體學(xué)習(xí)記憶的方法和螺旋藻在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠55只，6周齡，體質(zhì)量180±20 g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002，使用證：SYXK(贛)2017-0003)。動(dòng)物房溫度24±2 ℃，濕度40%～60%，光照時(shí)間12 h，分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器

兔抗鼠多克隆抗體p-ERK、p-CREB(美國Proteintech公司，試劑盒批號(hào)：14060-1-AP、55014-1-AP)；兔抗鼠多克隆抗體ERK、CREB、cleaved Caspase-3(北京博奧森生物公司，試劑盒批號(hào)：bs-0078R、bs-1021R、bs-0081R)；HRP二抗(批號(hào)：AS014，Abclonal公司)；螺旋藻(深綠色粉末，純度99.7%，國藥準(zhǔn)字：Z53020227，云南施普瑞生物公司)；鏈脲佐菌素(批號(hào)：20171004，Sigma公司)；血清胰島素測定試劑盒(批號(hào)：20171030，中生北控生物科技有限公司)；ApopTag@熒光素原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號(hào)：S7104，Millipore公司)；無水葡萄糖、中性樹脂(廣州齊云試劑公司)；血糖檢測試條(批號(hào)：201701020 A1，北京怡成生物電子技術(shù)公司)；葡萄糖測試儀(JPS-5型，北京怡成生物電子技術(shù)公司)；一次性使用無菌采血針(天津華鴻醫(yī)材有限公司)；動(dòng)物跑臺(tái)(ZH-PT型，安徽淮北正華生物儀器設(shè)備公司)；全自動(dòng)生化分析儀(日立-7600)；Morris水迷宮和動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)軟件(ZH0065型，安徽淮北正華生物儀器設(shè)備公司)；BX41型顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)；BIO RAD 凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)。

1.3 動(dòng)物造模、分組與藥物灌胃處理

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)抽取10只用作對照組(control group，C)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)；其余45只用作制備2型糖尿病模型。模型的建立參照Reed et al[6]方法進(jìn)行。造模組(modeling group，M)改為高糖高脂飼料喂養(yǎng)，高糖高脂飼料配方按照文獻(xiàn)方法[3]，由63.5%普通飼料、20%蔗糖、10%豬油、5%蛋黃粉、1%膽固醇、0.5%膽酸鹽組成。5周后，行葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素敏感性實(shí)驗(yàn)后，確定存在胰島素抵抗的大鼠經(jīng)單次腹腔注射鏈脲佐菌素(strepozocin，STZ，35 mg/kg.bw)，以誘發(fā)2型糖尿病大鼠模型。注射STZ 1周后尾靜脈采血測試血糖，以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，出現(xiàn)“三多一少”癥狀者為成模大鼠。共有40只大鼠成模。隨機(jī)分為4組：糖尿病組(diabetes model group，DM)、運(yùn)動(dòng)組(diabetes exercise group，DE)、螺旋藻組(diabetes spirulina group，DS)、運(yùn)動(dòng)+螺旋藻組(diabetes exercise spirulina group，DES)，每組10只。螺旋藻臨用前用生理鹽水溶解制成混懸液。灌胃組(DS、DES)按每天300 mg/kg體重給藥[3]，給藥體積2 mL/只，每天灌胃螺旋藻，其余組以等體積的生理鹽水灌胃。每次灌胃時(shí)間在運(yùn)動(dòng)前2 h內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)時(shí)間連續(xù)8周。

1.4 運(yùn)動(dòng)方案

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案參照文獻(xiàn)[7]結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行。運(yùn)動(dòng)組(DE、DES)大鼠進(jìn)行為期8周(每周5次，0坡度)的有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。訓(xùn)練前1周先讓大鼠進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(5～10 m/min，10 min，5天/周，0坡度)。正式訓(xùn)練時(shí)間為第1周跑臺(tái)速度從5 m/min逐漸增加到15 m/min；第2周從16 m/min增加到22 m/min，以后每周跑速增加2 m/min，每次運(yùn)動(dòng)時(shí)間持續(xù)40 min，持續(xù)訓(xùn)練8周。同時(shí)，C組、DM組和DS組不運(yùn)動(dòng)，正常環(huán)境飼養(yǎng)8周。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

采用Morris水迷宮(ZH0065型，淮北正華生物儀器設(shè)備公司)測定各組的逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)，檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮為圓形水池(直徑150 cm、高60 cm、水深32 cm，水溫22±2 ℃)。分別于造模成功干預(yù)前、干預(yù)后進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試。①定位航行實(shí)驗(yàn)：將大鼠面向池壁，分別隨機(jī)從東、西、南、北4個(gè)象限池的中點(diǎn)入水開始計(jì)時(shí)，以大鼠找到平臺(tái)2 s 終止記錄，此時(shí)間為逃避潛伏期。每只大鼠每天訓(xùn)練2次，連續(xù)訓(xùn)練5天，第6天進(jìn)行定位航行測驗(yàn)，取3次潛伏期的平均值作為逃避潛伏期。②空間探索實(shí)驗(yàn)：在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第2天撤去平臺(tái)，隨機(jī)選取一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池中，攝像系統(tǒng)自動(dòng)記錄大鼠120 s內(nèi)的游泳軌跡，記錄穿越平臺(tái)的次數(shù)，評價(jià)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。

1.6 實(shí)驗(yàn)取材與指標(biāo)檢測

1.6.1 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)

高糖高脂飼料5周后，從C組和M組隨機(jī)分別選出大鼠6只，隔夜禁食12 h，尾靜脈采血，擦掉第一滴血后測定空腹血糖和胰島素水平，隨后以2 g/kg.bw的葡萄糖劑量對兩組大鼠進(jìn)行灌胃處理。在灌胃后的30、60、120 min[8]尾靜脈采血測定血糖和血胰島素的水平。

1.6.2 血糖和血胰島素水平的測定

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠夜間禁食(不禁水)12 h，尾靜脈采血?？崭寡菧y定采用葡萄糖氧化酶法。血清胰島素檢測采用膠乳免疫比濁法，檢測方法嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.3 TUNEL染色

大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，暴露心臟，灌流針經(jīng)心從左心室插管至主動(dòng)脈弓，同時(shí)剪開右心耳，放靜脈血。常規(guī)方法灌注(先灌注生理鹽水，待肝臟變白時(shí)改灌注4%多聚甲醛100 mL)完畢后，斷頭，取全腦，放入多聚甲醛溶液(4%)中固定24 h以上，石蠟包埋。嚴(yán)格按照ApopTag@熒光素原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作步驟進(jìn)行海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測。行DAPI染色，出現(xiàn)藍(lán)色熒光的代表神經(jīng)細(xì)胞核，綠色熒光代表凋亡細(xì)胞。熒光顯微鏡下拍照采集圖像，每張圖片選取5個(gè)視野，將所得結(jié)果用Image.J圖像處理軟件計(jì)數(shù)分析。細(xì)胞凋亡率=(綠色熒光的凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6.4 Western blot法

大鼠麻醉，斷頭取全腦，冰浴上分離海馬組織，分裝標(biāo)記，置-80 ℃冰箱保存。凍存的海馬組織取出，稱量后放入勻漿器，加入重量為組織9倍的細(xì)胞裂解液。在冰上研磨約12 min，充分研磨破碎，搜集樣品于離心管中，離心(4 ℃，12 000 rpm，10 min)，取上清液。用BCA法將樣品進(jìn)行蛋白定量，常規(guī)方法聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下封閉(用5%的脫脂奶)2.0 h，加一抗(ERK、p-ERK、CREB、p-CREB、cleaved caspase-3抗體工作濃度分別為1∶500、1∶1 500、1∶500、1∶2 000、1∶300)，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，洗膜、顯影、定影、曝光，洗片，采用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)分析。以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算p-ERK/ERK、p-CREB/CREB的比值，反映ERK、CREB的活化程度和cleaved caspase-3蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，將DM、DE、DS、DES組大鼠的cleaved caspase-3、p-ERK/ERK、p-CREB/CREB、細(xì)胞凋亡率、體重、血糖、血胰島素和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)指標(biāo)等數(shù)據(jù)納入分析。P<0.05為差異具有顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 造模期間大鼠OGTT后血糖、血胰島素水平、分組時(shí)血糖及一般情況的變化

如表1和表2所示，與C組對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，高糖高脂飼料喂養(yǎng)5周的M組模型大鼠OGTT試驗(yàn)后的30、60、120 min的血糖濃度和血胰島素水平均明顯升高，差異有顯著性(P<0.01)。如圖1所示，動(dòng)物分組時(shí)C組和M組模型大鼠血糖檢測值分別為6.01±0.64和19.98±2.15，組間比較差異呈極顯著性(P<0.01)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)期間模型大鼠多食、多尿、多飲和體重減輕癥狀日趨明顯；出現(xiàn)毛發(fā)稀疏色澤黃枯無光澤，大便稀溏，行動(dòng)遲緩等狀態(tài)；且墊料易濕，每天更換至少2～3次。

表1 兩組大鼠OGTT后血糖濃度的變化Table 1 Changes of blood glucose after OGTT in the groups of

表2 兩組大鼠OGTT后血胰島素水平的變化Table 2 Changes of serum insulin after OGTT in the groups of

圖1 分組時(shí)兩組大鼠血糖濃度的變化(C組：n=10，M組：n=40)Fig.1 Changes of blood glucose of rats in the two groups(group C:n=10,group M:n=40)注：與C組比較，**P<0.01。Note:Compare with group C,**P<0.01.

2.2 運(yùn)動(dòng)及螺旋藻對大鼠體重、血糖濃度和胰島素水平的影響

由表3所示，與C組相比，DM組血糖和胰島素水平均顯著升高，而其體重明顯下降(P<0.01)；與DM組相比，DE、DS、DES組的血糖和胰島素檢測值均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，其體重雖有增加趨勢，但顯著性差異不明顯(P>0.05)。與DE、DS組相比，DES組的血糖和胰島素水平明顯降低(P<0.05)，但其血糖值仍顯著高于C組(P<0.01)；其血胰島素水平則稍高于C組(P>0.05)；其體重雖有增加，但增加亦不明顯(P>0.05)。

表3 大鼠空腹體重、血糖和血胰島素水平的變化Table 3 Changes of fasting weight,blood glucose and serum insulin of rats among

2.3 運(yùn)動(dòng)及螺旋藻對大鼠行為學(xué)的影響

由表4和圖2所示，實(shí)驗(yàn)前5組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)后，與C組相比，DM組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.01)；且DM組的行為學(xué)軌跡比C組更紊亂，更難找到目標(biāo)平臺(tái)，主要以邊緣式為主。與DM組相比，DE、DS、DES組的逃避潛伏期均縮短(P<0.05或P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)均增加(P<0.05或P<0.01)；其行為學(xué)軌跡比DM組簡單，較容易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)平臺(tái)，主要以直線式和趨向式為主。與DE、DS組相比，DES組的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多(P<0.05)。各組大鼠呈現(xiàn)不同特點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)軌跡，C組以直線式為主，DM組以邊緣式為主，其余各組主要以直線式和趨向式為主。

表4 大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)的變化Table 4 Changes of learning and memory functions among groups before and after

圖2 各組大鼠水迷宮軌跡圖Fig.2 The typical swimming track of rats in the groups注：藍(lán)色圓為隱蔽平臺(tái);藍(lán)方塊為游泳軌跡起點(diǎn);紅方塊為游泳軌跡終點(diǎn)。Note:The blue circles are the hidden platforms;The blue squares are the starting points;The red squares are the end points.

2.4 運(yùn)動(dòng)及螺旋藻對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率的影響

圖3中，綠色熒光代表斷裂或凋亡的DNA，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核。與C組相比，DM組和DE、DS、DES各干預(yù)組海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率均明顯增加(P<0.01)；與DM組相比，干預(yù)各組細(xì)胞凋亡率均明顯降低(P<0.01)；其中以DES組降低尤為明顯，均低于DE組和DS組(P<0.05，見圖4)。

圖4 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率的變化Fig.4 Changes of cell apoptosis rate of rats in

2.5 運(yùn)動(dòng)及螺旋藻對大鼠海馬組織相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

由圖5、表5可見，各組大鼠海馬組織中ERK和CREB總量沒有明顯差異。與C組相比，DM組大鼠海馬組織p-ERK/ERK、p-CREB/CREB水平均明顯下降(P<0.05或P<0.01)，cleaved caspase-3表達(dá)則明顯增加(P<0.01)。與DM組相比，DE、DS、DES組p-ERK/ERK、p-CREB/CREB均明顯增加(P<0.01)，cleaved caspase-3表達(dá)則顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與DE、DS組相比，DES組的p-ERK/ERK、p-CREB/CREB水平均顯著增加(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白明顯減少(P<0.01)。

表5 大鼠海馬組織相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)量Table 5 Expressions of related signaling pathway proteins in hippocampal of rats among

3 討論與結(jié)論

口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)是目前評價(jià)糖代謝狀況的金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也是臨床評估胰島β細(xì)胞功能及胰島素敏感性的常用方法。本研究參照Hou等[9]的方法，對5周高脂喂養(yǎng)的大鼠行OGTT試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)空腹高血糖和高胰島素血癥，表明大鼠出現(xiàn)糖耐量受損和胰島素抵抗。再配合注射STZ選擇性破壞胰島β細(xì)胞，1周后，模型大鼠多飲、多食、多尿癥狀日趨明顯，同時(shí)實(shí)驗(yàn)期間大鼠出現(xiàn)體重減輕，毛發(fā)稀疏色澤黃枯無光澤，大便稀溏，行動(dòng)遲緩等狀態(tài)。經(jīng)8周的實(shí)驗(yàn)周期，2型糖尿病模型鼠仍出現(xiàn)高血糖、高胰島素血癥的主要臨床特征，表明2型糖尿病大鼠模型已誘導(dǎo)成功[9]。而實(shí)驗(yàn)期間模型鼠胰島素水平較高的原因可能與其靶細(xì)胞膜上的胰島素受體含量減少，胰島素作用效率降低，機(jī)體代償分泌過多胰島素等有關(guān)。8周有氧運(yùn)動(dòng)能夠降低大鼠血糖和胰島素水平，但對體重影響不明顯，原因可能與規(guī)律運(yùn)動(dòng)能增加糖尿病大鼠骨骼肌胰島素受體敏感性、促進(jìn)骨骼肌對葡萄糖的直接攝取，降低血糖有關(guān)；而這種作用并不依賴體重的下降。

研究證實(shí)，高脂飲食和STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠存在學(xué)習(xí)記憶障礙[10]。Morris水迷宮檢測結(jié)果同樣表明，本研究誘發(fā)的高血糖2型糖尿病大鼠出現(xiàn)了空間學(xué)習(xí)記憶能力的明顯下降，與前人研究相一致[10]。動(dòng)物研究證實(shí)，高血糖可引起細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高血糖模型大鼠海馬細(xì)胞凋亡率明顯增多，說明糖尿病高糖狀態(tài)導(dǎo)致海馬細(xì)胞凋亡增加更為顯著[11]，與前人一致。同時(shí)大鼠逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，表明糖尿病學(xué)習(xí)記憶能力的下降與海馬神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)。有氧運(yùn)動(dòng)有抗海馬細(xì)胞凋亡損傷作用[11]。8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，模型鼠海馬細(xì)胞凋亡率明顯減少，學(xué)習(xí)記憶功能得到改善，表明長時(shí)間有氧運(yùn)動(dòng)有抗海馬細(xì)胞凋亡損傷，增強(qiáng)糖尿病學(xué)習(xí)記憶的作用，這可能與其降血糖作用有關(guān)[11]。

近年來，神經(jīng)系統(tǒng)中信號(hào)傳導(dǎo)通路的變化與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系的研究已成為新的研究熱點(diǎn)。ERK廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在海馬、紋狀體、前額葉皮質(zhì)等區(qū)域都有顯著表達(dá)，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。CREB是一種具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄功能的核內(nèi)蛋白質(zhì)，CREB是ERK最重要的下游信號(hào)分子之一，活化的ERK通過激活下游CREB的表達(dá)，調(diào)節(jié)突觸可塑性，改善大腦學(xué)習(xí)記憶能力[12]。細(xì)胞內(nèi)ERK/CREB信號(hào)通路在調(diào)控大腦學(xué)習(xí)記憶能力和突觸可塑性的過程中起著“開關(guān)”作用[13]。信號(hào)分子磷酸化是信號(hào)通路激活的方式。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型大鼠p-ERK/ERK、p-CREB/CREB水平均明顯降低，提示，糖尿病高血糖狀態(tài)可引起ERK/CREB信號(hào)下調(diào)。有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，模型大鼠p-ERK/ERK、p-CREB/CREB水平明顯增加，提示適量運(yùn)動(dòng)可影響ERK/CREB信號(hào)蛋白表達(dá)，修復(fù)海馬神經(jīng)元損傷[14]，改善學(xué)習(xí)記憶。有氧運(yùn)動(dòng)是一種對海馬和神經(jīng)突觸有直接影響的非藥理學(xué)方法。長時(shí)間的有氧運(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)ERK、CREB等海馬記憶相關(guān)蛋白表達(dá)，達(dá)到修復(fù)海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷[14]，改善學(xué)習(xí)記憶的效果。研究又表明，CREB表達(dá)沉默可促進(jìn)氧糖剝奪/復(fù)氧皮層神經(jīng)元的凋亡[15]。ERK、CREB信號(hào)通路蛋白表達(dá)上調(diào)均有抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)[15,16]，通過此途徑而達(dá)到腦保護(hù)作用。ERK信號(hào)途徑可能是多種海馬突觸可塑性誘導(dǎo)的共同機(jī)制[16,17]。半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)是細(xì)胞凋亡的驅(qū)動(dòng)器和關(guān)鍵執(zhí)行分子，其活化是細(xì)胞程序性死亡中細(xì)胞蛋白裂解的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本研究顯示的有氧運(yùn)動(dòng)有上調(diào)ERK/CREB信號(hào)，減少活化凋亡酶(cleaved caspase-3)表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用。由此推測本實(shí)驗(yàn)條件下的有氧運(yùn)動(dòng)可能通過降低血糖，上調(diào)ERK/CREB信號(hào)通路，減少cleaved caspase-3表達(dá)，增強(qiáng)海馬抗細(xì)胞凋亡能力，促進(jìn)海馬神經(jīng)元修復(fù)，從而防止與糖尿病有關(guān)的空間學(xué)習(xí)與記憶能力的減退。目前有關(guān)ERK/CREB信號(hào)與有氧運(yùn)動(dòng)抗糖尿病學(xué)習(xí)記憶的研究甚少。ERK/CREB信號(hào)介導(dǎo)的抗海馬細(xì)胞凋亡效應(yīng)可能是運(yùn)動(dòng)改善糖尿病學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一。

螺旋藻具有降血糖、抗氧化等多種功能，被稱為21世紀(jì)人類蛋白質(zhì)的來源，目前許多國家將螺旋藻制成營養(yǎng)保健食品，用于補(bǔ)充人體營養(yǎng)需要及各種疾病(如糖尿病、高血壓等)的防治。近來研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻有增強(qiáng)記憶力、抗記憶損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制與其增加nNOS的表達(dá)，抑制GSK-3β蛋白的表達(dá)，改善由Aβ1-42蛋白沉積引起的大鼠腦認(rèn)知功能障礙等有關(guān)[18,19]。而有關(guān)螺旋藻改善糖尿病機(jī)體學(xué)習(xí)記憶方面的報(bào)道尚無。螺旋藻能否通過降血糖影響ERK/CREB信號(hào)通路來改善或提高糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶,目前研究尚不清楚。

本研究顯示，螺旋藻補(bǔ)充后，糖尿病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶明顯提高，同時(shí)血糖和胰島素含量下降，海馬ERK/CREB信號(hào)均明顯上調(diào)，cleaved caspase-3和細(xì)胞凋亡率顯著減少，提示，螺旋藻改善學(xué)習(xí)記憶可能與其降血糖、修復(fù)受損胰島細(xì)胞功能的生物學(xué)作用有關(guān)，其機(jī)理可能是通過增強(qiáng)海馬ERK/CREB信號(hào)，抑制海馬細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。前期研究發(fā)現(xiàn)[3]，螺旋藻有上調(diào)海馬(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)信號(hào)，改善運(yùn)動(dòng)疲勞模型大鼠海馬損傷的作用。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)與其受體(tyrosine kinase receptor B，TrkB)結(jié)合，可以通過激活ERK來誘導(dǎo)CREB的激活并產(chǎn)生持續(xù)的CREB信號(hào)；增強(qiáng)BDNF/TrkB的ERK/CREB信號(hào)有利于海馬學(xué)習(xí)記憶的改善[20]。在app/ps1小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，β淀粉樣蛋白水平的增加下調(diào)了CREB的磷酸化，導(dǎo)致海馬BDNF誘導(dǎo)的TrkB自磷酸化下調(diào)，由ERK激活的CREB表達(dá)降低[21]，會(huì)引起學(xué)習(xí)、記憶能力的減退。螺旋藻能明顯上調(diào)ERK、CREB等海馬神經(jīng)元學(xué)習(xí)記憶關(guān)鍵信號(hào)分子，一定程度抑制細(xì)胞凋亡，這可能是其新的抗糖尿病學(xué)習(xí)記憶損傷的腦保護(hù)作用機(jī)制之一。

研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)聯(lián)合螺旋藻8周后，糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶改善的效果也優(yōu)于單一的有氧運(yùn)動(dòng)與螺旋藻組，表明運(yùn)動(dòng)螺旋藻聯(lián)用具有協(xié)同增效作用。運(yùn)動(dòng)療法作為藥物治療的補(bǔ)充具有良好的應(yīng)用前景。有氧運(yùn)動(dòng)螺旋藻聯(lián)用的增強(qiáng)效果與有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合白藜蘆醇給藥在2型糖尿病模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用相一致[11]。機(jī)制研究表明，運(yùn)動(dòng)螺旋藻聯(lián)合組的p-ERK/ERK、p-CREB/CREB水平顯著高于單一的有氧運(yùn)動(dòng)與螺旋藻組，cleaved caspase-3表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡率明顯減少，提示，運(yùn)動(dòng)聯(lián)合螺旋藻補(bǔ)充可能通過進(jìn)一步激活ERK/CREB信號(hào)途徑，促進(jìn)海馬記憶關(guān)鍵蛋白 ERK和CREB的活化，有效抑制海馬細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮降血糖，改善糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)保護(hù)作用。這有可能是運(yùn)動(dòng)聯(lián)合螺旋藻提高糖尿病學(xué)習(xí)記憶的重要原因。運(yùn)動(dòng)聯(lián)合營養(yǎng)補(bǔ)充有可能成為改善糖尿病相關(guān)神經(jīng)退行性疾病學(xué)習(xí)記憶的新途徑。

值得說明的是，本研究中的DES組的胰島素水平在干預(yù)后期(第8周)已基本恢復(fù)至正常水平，而其血糖濃度雖有明顯的改善，但仍顯著高于正常水平，提示，糖尿病是一種持續(xù)進(jìn)展性疾病，運(yùn)動(dòng)和螺旋藻不能在有限的時(shí)間內(nèi)把血糖恢復(fù)到正常狀態(tài)，但可以修復(fù)受損的胰島細(xì)胞功能，使胰島素分泌趨于正常。建議2型糖尿病患者需長期堅(jiān)持規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)，同時(shí)注意膳食中螺旋藻的適當(dāng)補(bǔ)充。

由此可見，在本實(shí)驗(yàn)條件下，有氧運(yùn)動(dòng)和螺旋藻能有效降血糖，改善2型糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶，且運(yùn)動(dòng)聯(lián)合螺旋藻方案有更明顯的應(yīng)用效果，優(yōu)于單純的有氧運(yùn)動(dòng)和螺旋藻，其機(jī)制與其上調(diào)海馬ERK/CREB信號(hào)，減少cleaved caspase-3表達(dá)，一定程度抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮海馬神經(jīng)元保護(hù)作用有關(guān)。ERK/CREB信號(hào)途徑有可能成為有氧運(yùn)動(dòng)和螺旋藻改善糖尿病機(jī)體海馬學(xué)習(xí)記憶的潛在靶點(diǎn)。