羅 佳，馬若克，符韻林，韋鵬練

(廣西大學(xué) 林學(xué)院,廣西 南寧 530004)

觀光木(TsoongiodendronodorumChun)又名宿軸木蘭,是隸屬于木蘭科(Magnoliceae)觀光木屬(TsoongiodendronChun)的古老殘遺物種,主要分布在我國熱帶到中亞熱帶南部地區(qū),如廣東、廣西、福建及海南等地[1-2]。觀光木樹干挺直、枝葉茂密、樹形優(yōu)美,常用于城市綠化和園林觀賞[3];其木材紋理美觀、材質(zhì)優(yōu)良,可應(yīng)用于建筑、高檔家具和膠合板[4];除此之外,觀光木的樹皮、枝條和木質(zhì)部的某些化學(xué)成分能用于治療癌癥[5]。近年來,對(duì)于觀光木的研究主要集中于人工繁育[6]、生理生態(tài)[7]以及物理力學(xué)性質(zhì)[2]等方面,這些研究雖然對(duì)保護(hù)和開發(fā)觀光木的資源起到積極作用,但對(duì)生物量相對(duì)豐富的葉片的化學(xué)成分和生物活性尚未進(jìn)行深入研究。

黃酮類的物質(zhì)普遍存在于自然界中,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等作用,清除自由基的能力強(qiáng)[11]。為了解觀光木葉的黃酮類化學(xué)成分及其生物活性,為觀光木葉黃酮類成分的開發(fā)和資源利用提供參考，本研究通過D101大孔樹脂結(jié)合不同乙醇/水洗脫梯度對(duì)觀光木葉的黃酮類成分進(jìn)行純化,以DPPH自由基和ABTS自由基來評(píng)價(jià)不同組分的抗氧化能力,并且采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-EXACTIVE-MS)對(duì)黃酮純度最高組分的黃酮類化合物進(jìn)行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

觀光木葉于2019年11月采自廣西壯族自治區(qū)南寧市良鳳江國家森林公園試驗(yàn)林區(qū),將葉片自然風(fēng)干,用磨粉機(jī)磨碎,備用。

所用試劑有：D-101大孔樹脂、抗壞血酸(成都市科隆化學(xué)品有限公司)；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、氯化鋁(南寧市聚源儀器儀表有限公司)；乙酸乙酯、過硫酸鉀(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；石油醚(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；蘆丁(南京草本源生物科技有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-連氮-2-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(凱瑪生化天津有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S-CW型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、DFT-200型粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)、KQ2200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、N-1200B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(南寧藍(lán)天實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、Q-EXACTIVE超高效液相質(zhì)譜儀(美國熱電公司)。

1.3 用大孔樹脂分離富集觀光木葉中的黃酮類物質(zhì)

1.3.1 大孔樹脂的預(yù)處理 使用95%乙醇浸泡D101大孔吸附樹脂24 h,之后用蒸餾水沖洗,然后用5%的NaOH溶液、5%的HCI溶液各浸泡3 h(每次浸泡完成后需用蒸餾水洗至中性),最后用95%乙醇浸泡樹脂4 h,再用蒸餾水沖洗,直到?jīng)]有醇味;將處理好的樹脂放入蒸餾水中備用。

1.3.2 黃酮的提取與純化 采用80%乙醇回流提取3次,第一次5倍量2 h,第二次4倍量2 h,第三次4倍量2 h；將提取液合并，過濾、濃縮至無醇味,加水稀釋至提取物的3倍,靜置過夜；用400目絨布過濾,向?yàn)V液中加入處理好的D101大孔吸附樹脂,樹脂用量為提取液的3倍。對(duì)分離的黃酮類物質(zhì)先用蒸餾水沖洗至無色,再分別用2倍柱體積的10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇進(jìn)行洗脫,分別收集洗脫液,將其真空濃縮干燥，即得到不同乙醇洗脫的餾分。

1.3.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考鄢又玉等的方法[12](本研究略有改動(dòng))。準(zhǔn)確稱量10.0 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,用70%的乙醇進(jìn)行溶解,之后定容到100 mL容量瓶中,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取0、1、2、3、4、5 mL的上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中,加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻,靜置6 min；再加入0.3 mL 10%的AlCl3溶液,搖勻,靜置6 min；最后再加入4 mL NaOH溶液,用70%乙醇定容到10 mL,搖勻,靜置15 min,等待顯色,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、10、20、30、40、50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。以70%乙醇作為空白,用比色皿在波長為510 nm處分別測定上述蘆丁各標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度,然后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 純化后黃酮化合物純度的計(jì)算 取經(jīng)大孔樹脂純化后的黃酮粉末各0.050 g于10 mL容量瓶中,用70%的乙醇定容,得到濃度為5 mg/L的黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液;取適量的黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，向其中加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻,靜置6 min；再加入0.3 mL 10%的AlCl3溶液,搖勻,靜置6 min；最后再加入4 mL NaOH溶液,用70%乙醇定容至10 mL,搖勻,靜置15 min；在波長為510 nm處測定上述樣品溶液的吸光度,將所得吸光度帶入1.3.3節(jié)建立的回歸方程中,得到純化后黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量純度。

1.4 黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性分析

1.4.1 用DPPH法測定黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性 參考秦嫚嫚等的方法[13](本文略有改動(dòng))。準(zhǔn)確稱量17.9 mg DPPH粉末,用無水乙醇定容到100 mL容量瓶中,配制成濃度為0.0002 mol/L的DPPH溶液;取3 mL不同濃度的樣品溶液,加入3 mL DPPH 0.0002 mol/L,混合均勻,避光反應(yīng)30 min;以無水乙醇為空白,在517 nm處測吸光度A1;以3 mL不同濃度的樣品溶液和3 mL無水乙醇的吸光度為A2;以3 mL DPPH溶液和3 mL無水乙醇的吸光度為A0。以L-抗壞血酸(VC)做陽性對(duì)照。計(jì)算IC50值,即DPPH清除率達(dá)到50%時(shí)各組分樣品的濃度。DPPH清除率的計(jì)算公式為：DPPH清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

1.4.2 用ABTS法測定黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性 參考葛雙雙等的方法[14](本文略有改動(dòng))。準(zhǔn)確稱取38.4 mg ABTS粉末,先用少量水溶解,再用無水乙醇溶解,定容到10 mL,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7 mmol/L的ABTS溶液;稱取0.0132 g過硫酸鉀粉末，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.9 mmol/L的過硫酸鉀溶液;將上述兩種溶液按1∶1的體積比例混合均勻,在黑暗條件下反應(yīng)12 h；用無水乙醇稀釋,直到吸光度為0.700±0.002,得到ABTS自由基儲(chǔ)備液。在波長734 nm處,用無水乙醇將ABTS自由基儲(chǔ)備液稀釋至吸光度為0.700±0.02,備用。取1 mL不同濃度的樣品溶液,加入4 mL ABTS溶液,混合均勻,避光反應(yīng)15 min；在734 nm波長下,以無水乙醇為空白,吸光度為B1;以1 mL不同濃度的樣品溶液和4 mL無水乙醇的吸光度為B2;以4 mL ABTS溶液和1 mL無水乙醇的吸光度為B0。以L-抗壞血酸做陽性對(duì)照。計(jì)算IC50值,即ABTS清除率達(dá)到50%時(shí)各組分樣品的濃度。ABTS清除率的計(jì)算公式如下：ABTS清除率(%)=[1-(B1-B2)/B0]×100。

1.5 通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定觀光木葉中黃酮類成分

采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-EXACTIVE-MS)對(duì)黃酮化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。超高效液相色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLCBEHC18(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)。流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水,B為甲醇。梯度洗脫：0～2.0 min,5%B;2.0～16.0 min,5%～95%B;16.0～17.1 min,95%B+95%A;17.1～18.0 min,95%～5%B。流速為0.3 mL/min,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣體積為1 μL。

高分辨質(zhì)譜條件:采用ESI離子源;溫度300 ℃;傳輸毛細(xì)管溫度320 ℃;鞘氣206000 Pa;輔助氣流速69 kPa;負(fù)離子模式下噴霧電壓為3.0 kV;掃描模式為Full MS和Full MS/dd-MS2,質(zhì)量范圍100～1000 Da,一級(jí)掃描和二級(jí)掃描的分辨率分別為70000、17500。

1.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),采用IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算IC50值,采用Origin繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀光木葉提取物各餾分的黃酮純度

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0095x+0.0041,R2=0.9997。觀光木葉片的提取物經(jīng)D101大孔樹脂洗脫后得到4個(gè)不同濃度的乙醇/水洗脫組分。從圖1可知,從觀光木葉提取的黃酮純度從高到低依次為30%組分>10%組分>50%組分>70%組分,其中當(dāng)乙醇洗脫濃度為30%時(shí)黃酮純度最高,初步判斷30%乙醇對(duì)觀光木葉黃酮類物質(zhì)具有較強(qiáng)的富集效果。

2.2 觀光木葉提取物各組分對(duì)DPPH的清除能力

DPPH是一種常見的自由基,常用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性[11]。由圖2可知,4個(gè)組分對(duì)DPPH自由基的清除能力均隨著樣品濃度的增加而不斷增加,兩者具有密切的關(guān)聯(lián)性。樣品濃度在16.67～200.00 mg/L這一區(qū)段的DPPH自由基清除率變化明顯,清除率從7.78%迅速增加到86.41%；當(dāng)樣品溶液濃度為233.33 mg/L時(shí),清除率達(dá)87.22%,而抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除率為94.96%。通過計(jì)算可知,各組分的IC50從小到大為VC<30%組分<10%組分<50%組分<70%組分(表1)；IC50值越小表示清除能力越強(qiáng),因此30%乙醇/水洗脫組分對(duì)DPPH的清除能力最強(qiáng)。結(jié)果表明,觀光木葉提取物經(jīng)D101大孔樹脂純化后,4個(gè)乙醇/水洗脫組分的總黃酮提取物對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除能力,其中,30%乙醇/水洗脫組分的清除效果最好。

圖2 觀光木葉各個(gè)組分的黃酮和VC對(duì)DPPH的清除率

表1 各個(gè)組分的總抗氧化活性(IC50值) mg/L

2.3 觀光木葉提取物各餾分對(duì)ABTS的清除能力

ABTS被廣泛用于天然產(chǎn)物的總抗氧化活性的測定[15]。從圖3可知,對(duì)ABTS自由基的清除能力隨著樣品濃度的增加而不斷增加,其中在樣品濃度為16～208 mg/L這一區(qū)段清除率變化明顯,清除率從10.77%迅速增加到99.65%；但在樣品濃度208～232 mg/L這一區(qū)段清除率變化相對(duì)平緩,與VC接近。在各餾分中，30%乙醇/水洗脫組分的IC50最低,對(duì)ABTS自由基的清除能力最強(qiáng)；而70%組分清除ABTS的能力最弱。結(jié)果表明,4個(gè)組分的總黃酮提取物和VC對(duì)ABTS自由基均具有一定的清除能力,其中,30%乙醇/水洗脫組分的清除效果最好；當(dāng)樣品溶液濃度為184 mg/L時(shí),對(duì)ABTS的清除能力略高于抗壞血酸,說明觀光木葉黃酮類物質(zhì)對(duì)ABTS自由基的清除效果十分顯著。

圖3 觀光木葉各個(gè)組分的黃酮和VC對(duì)ABTS的清除率

2.4 用UPLC-MS-MS法鑒定黃酮類物質(zhì)的成分

為了進(jìn)一步明確觀光木葉抗氧化活性的主要黃酮類成分和結(jié)構(gòu),采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)對(duì)黃酮含量較高、抗氧化活性較強(qiáng)的30%組分進(jìn)行成分檢測,在正離子模式下總離子流圖見圖4。通過分析其質(zhì)譜圖的碎片斷裂模式(圖5)、軟件(Compound discoverer 3.1)的對(duì)比分析以及參考相關(guān)文獻(xiàn)資料,推斷出7種黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu),結(jié)果見表2。

表2 觀光木葉30%大孔樹脂洗脫組分黃酮類化合物的鑒定分析結(jié)果

圖4 觀光木葉黃酮物質(zhì)的總離子流圖

a、b、c、d、e、f、g分別為3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮、酮洛芬、白麻苷、三葉豆苷、假荊芥屬苷、射干苷、川陳皮素。

化合物1的[M+H]+峰為433.1435,推測可能分子式為C22H24O9。二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 403.1376和373.1830；m/z 433.1435通過脫去2個(gè)CH3得到碎片離子C20H18O9(m/z 403.1376)；再失去2個(gè)CH3形成碎片離子C18H12O9(m/z 373.1830)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[16],化合物1被鑒定為3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黃酮。

化合物2的[M+H]+峰為255.1007,推測可能分子式為C16H14O3。二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 179.0703、161.0597、135.0440和121.0286；m/z 255.1007通過失去C6H5得到碎片離子C10H10O3(m/z 179.0703)；再脫去1個(gè)OH得到碎片離子C10H8O2(m/z 161.0597)；再脫去1個(gè)CO得到碎片離子C9H10O(m/z 135.0440)；繼續(xù)丟掉1個(gè)CH3得到碎片離子C8H8O(m/z 121.0286)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[17],化合物2被鑒定為酮洛芬。

化合物3的[M+H]+峰為627.1501,推測可能分子式為C27H30O17。二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 303.0494;同時(shí),m/z 627.1501去掉1個(gè)C12H22O10得到碎片離子C15H10O7(m/z 303.0494)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[18-19],化合物3被鑒定為白麻苷。

化合物4的[M+H]+峰為449.1993,推測可能分子式為C21H20O11。二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 287.0546和137.0597；m/z 499.1993丟掉1個(gè)六碳糖結(jié)構(gòu)單元后形成C15H10O6(m/z 287.0546)的碎片離子,經(jīng)過RDA裂解得到碎片離子C7H4O3(m/z 137.0597)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[20-21],化合物4被鑒定為三葉豆苷。

化合物5的[M+H]+峰為479.1049,推測可能分子式為C22H22O13。二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 317.0650；m/z 479.1049失去1個(gè)六碳糖結(jié)構(gòu)單元后形成C16H12O7(m/z 317.0650)的碎片離子。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[22],化合物5被鑒定為假荊芥屬苷。

化合物6的[M+H]+峰為463.2255,推測可能分子式為C22H22O11。二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 301.0701；m/z 479.1049失去1個(gè)六碳糖結(jié)構(gòu)單元后形成C16H12O6(m/z 301.0701)的碎片離子。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[23],化合物6被鑒定為射干苷。

化合物7的[M+H]+峰為m/z 403.1380,推測可能分子式為C21H22O8。其二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 388.1151、374.0953、373.0914和357.0971；通過脫去1個(gè)CH3得到碎片離子C20H19O8(m/z 388.1151)；m/z 403.1380還可能脫去1個(gè)OCH3得到C20H20O7(m/z 373.0914)的碎片；再失去1分子H2O得到離子C20H20O6(m/z 357.0971),或者m/z 403.1380失去2個(gè)CH3獲得碎片離子C19H17O8(m/z 374.0953)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[24],化合物7被鑒定為川陳皮素。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)利用D101大孔樹脂結(jié)合不同濃度乙醇/水進(jìn)行洗脫,對(duì)4個(gè)組分進(jìn)行抗氧化活性研究,不同組分的黃酮純度和抗氧化活性具有一定的差異。結(jié)果表明,30%乙醇/水洗脫組分的黃酮富集效果、黃酮純度以及對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除率均高于10%組分、50%組分、70%組分。此外,總黃酮含量與抗氧化活性之間具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性,推測黃酮類物質(zhì)是具有DPPH和ABTS清除活性的主要物質(zhì)。為了進(jìn)一步研究具有抗氧化活性的黃酮類成分,對(duì)30%乙醇/水洗脫組分中的黃酮類成分進(jìn)行鑒定,鑒定了7個(gè)黃酮類化合物結(jié)構(gòu),分別為3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黃酮、酮洛芬、白麻苷、三葉豆苷、假荊芥屬苷、射干苷、川陳皮素,為今后觀光木葉提取分離活性成分和資源利用提供了一定的理論依據(jù)。