關(guān) 峰,張景云,石 博,萬(wàn)新建,黃長(zhǎng)林

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所,江西 南昌 330200)

苦瓜(MomordicacharantiaL.)為葫蘆科苦瓜屬(Momordica)蔓性植物,起源于熱帶亞熱帶地區(qū),廣泛分布于南美亞馬遜地區(qū)、非洲、亞洲等地[1]。苦瓜因碧玉剔透、口感爽脆且營(yíng)養(yǎng)豐富而深受大眾的喜愛。但苦瓜連作導(dǎo)致種植土壤環(huán)境惡化,連作障礙日益嚴(yán)重,土傳病害發(fā)生隨之加重。苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜?；?FusariumoxysporumSchl.f.sp.momordicae)引起的一種典型的真菌土傳病害[2],在中國(guó)各苦瓜種植區(qū)均有發(fā)生,可造成苦瓜干枯萎蔫,最后導(dǎo)致全株死亡[3]。江西樂平作為苦瓜生產(chǎn)的重要基地,近幾年來(lái)苦瓜種植面積逐年擴(kuò)大,但該市位于長(zhǎng)江以南,其雨水較多、高溫高濕的氣候條件適于苦瓜枯萎病的發(fā)生和流行,導(dǎo)致部分種植大戶年損失在10萬(wàn)元以上。在苦瓜生產(chǎn)上,枯萎病一般發(fā)病率為15%～25%,在連作障礙嚴(yán)重的地塊發(fā)病率可達(dá)60%,當(dāng)此病流行時(shí)田間出現(xiàn)大量的枯黃死株,最終導(dǎo)致苦瓜的產(chǎn)量降低,從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

迄今為止,尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)苦瓜枯萎病免疫的苦瓜品種。采用化學(xué)藥劑仍然是防治苦瓜枯萎病最有效的手段[5]。目前,在苦瓜生產(chǎn)上主要使用的化學(xué)藥劑有異菌脲、甲基硫菌靈、噁霉靈、五氯硝基苯、多菌靈、百菌清、戊唑醇等。由于苦瓜枯萎病菌生長(zhǎng)快、適宜度高,連續(xù)使用同一種化學(xué)藥劑極易使該病菌對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性[6、7]?？喙峡菸〉牟≡b定對(duì)抗性品種篩選與創(chuàng)制、藥劑防治及生物防治策略的制定等多方面均有重要價(jià)值。為了進(jìn)一步探明樂平市苦瓜枯萎病的病原菌以及化學(xué)藥劑對(duì)其的抑制作用,本研究從江西省樂平市苦瓜主產(chǎn)區(qū)采集苦瓜枯萎病病株樣本,對(duì)其致病菌進(jìn)行了分離、純化、鑒定、致病力檢測(cè)及ITS序列分析,并針對(duì)生產(chǎn)上常用的7種化學(xué)藥劑開展了篩選試驗(yàn),以期為制定苦瓜枯萎病防控新策略,以及指導(dǎo)苦瓜生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別于2017、2018、2019年從江西省樂平市袁綠種養(yǎng)專業(yè)合作社苦瓜種植大棚內(nèi)共采集發(fā)病植株72株,用報(bào)紙包裹后及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 供試殺菌劑及來(lái)源

供試殺菌劑的名稱及來(lái)源詳見表1。

表1 供試殺菌劑的名稱及來(lái)源

1.3 病原菌的分離、鑒定

取苦瓜發(fā)病植株的莖基部,清洗去泥,切去兩端,先用0.1%升汞消毒30 s,再用75%酒精消毒30 s,共進(jìn)行3次；隨后用無(wú)菌水洗滌3～4次,再用滅菌濾紙吸干植株莖基部組織表面的水分,最后將其置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基上在28 ℃條件下培養(yǎng)；待長(zhǎng)出菌絲后,挑取部分菌餅接種在PDA平板上；經(jīng)3次純化后,采用稀釋法進(jìn)行單孢分離和培養(yǎng),在顯微鏡條件下進(jìn)行形態(tài)特征描述。將致病菌再次回接于苦瓜幼苗，對(duì)發(fā)病苦瓜幼苗進(jìn)行病原物的再分離,與原接種菌株比較,進(jìn)行Koch’s法則驗(yàn)證。

1.4 致病菌的rDNA-ITS序列分析

采用CTAB法[8]進(jìn)行菌體基因組DNA的提取。用真菌rDNA的通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用MEGA version 4.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析；采用鄰位相連法(neighbor-joining, NJ)進(jìn)行進(jìn)化距離分析；系統(tǒng)樹的檢驗(yàn)用Bootstrap 1000次重復(fù)。將菌株的rDNA-ITS序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行BLASTN比對(duì)。

1.5 致病性測(cè)定

取在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛的枯萎病菌菌餅邊緣，接種于液體培養(yǎng)基中,并置于26 ℃恒溫?fù)u床內(nèi)震蕩培養(yǎng)3～5 d。待菌絲長(zhǎng)出后,用雙層紗布過濾，去掉菌絲。用血球計(jì)數(shù)器計(jì)算病菌孢子的濃度并調(diào)至1×106cfu/L。采用浸移法進(jìn)行苦瓜枯萎病菌的回接試驗(yàn)；對(duì)照組采用無(wú)菌水進(jìn)行處理；待枯萎病發(fā)生后,再次從發(fā)病幼苗的莖基部分離病原菌,觀察分離菌株與原接種菌株在形態(tài)上的差別。

1.6 室內(nèi)毒力試驗(yàn)

采用生長(zhǎng)速率抑制法[9，10],將供試的7種化學(xué)藥劑各配制成一定質(zhì)量濃度的母液,再根據(jù)各藥劑說(shuō)明書推薦的濃度設(shè)置中間濃度,配制成系列質(zhì)量濃度的各種藥液：40%五氯硝基苯、50%異菌脲、50%多菌靈(120、60、30、15、7.5 mg/L)；25%戊唑醇(200、100、50、25、12.5 mg/L)；75%百菌清、70%甲基硫菌靈(116、58、29、14.5、7.25 mg/L)；99%噁霉靈(12、6、3、1.5、0.75 mg/L)。最后制作含有不同質(zhì)量濃度各種藥液的培養(yǎng)基平板。每個(gè)處理3次重復(fù)。在接種后,將培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，然后采用十字交叉法測(cè)量各化學(xué)藥劑濃度處理的菌落直徑,計(jì)算各化學(xué)藥劑濃度處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。取濃度的對(duì)數(shù)值,將生長(zhǎng)抑制率轉(zhuǎn)換成幾率值,建立毒力回歸方程,并計(jì)算各化學(xué)藥劑的有效抑制中濃度(EC50)和相關(guān)系數(shù)。抑制率(%)的計(jì)算公式為：抑制率=[(對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑)-(處理組菌落直徑-菌餅直徑)]/(對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑)×100。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2017和DPS 7.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜枯萎病菌的鑒定結(jié)果

對(duì)采集的病樣進(jìn)行分離純化，得到5個(gè)菌株(編號(hào)LP1、LP3、LP4、LP8、LP10)。用肉眼觀察這些菌株的菌落和形態(tài)學(xué)特征，沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異；菌絲濃密絮狀,呈地毯狀平鋪,菌落圓形,白色或淡紫色(圖1)。在顯微鏡下，其分生孢子呈鐮刀狀,3～5隔。依據(jù)Booth’s鐮刀菌分類鑒定標(biāo)準(zhǔn)初步鑒定這些菌株為尖孢鐮刀菌。選擇代表性菌株LP1進(jìn)行Koch’s準(zhǔn)則的驗(yàn)證。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,將序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索。根據(jù)真菌的分子分類原則[11],發(fā)現(xiàn)其與尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)序列的相似度較高,同源性達(dá)到99%(圖2),因此初步鑒定從苦瓜病株中分離出的病原菌均為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)。

圖1 江西省樂平市苦瓜枯萎病菌的形態(tài)特征

圖2 LP1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 致病性鑒定

將本試驗(yàn)分離的病原菌采用傷根法接種無(wú)病苦瓜幼苗,苦瓜幼苗于接種后7 d開始出現(xiàn)子葉萎蔫下垂或葉脈黃化等癥狀,11 d后幼苗葉片發(fā)黃、卷曲、變脆,植株逐漸枯萎,15 d后基部無(wú)新增發(fā)病植株。在樂平的潮濕天氣下,后期常能看到苦瓜藤蔓莖基部出現(xiàn)紅褐色縱裂,切開病株莖基部可發(fā)現(xiàn)其維管束變成褐色(圖B1、圖B2)。對(duì)照苦瓜植株無(wú)發(fā)病癥狀,生長(zhǎng)發(fā)育正常(圖A1、圖A2)。

從表2可以看出：在接種后，菌株LP1、LP3、LP4的致病性較強(qiáng)；菌株LP9和LP10的致病性較弱。

表2 不同菌株接種后苦瓜的發(fā)病結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 不同殺菌劑對(duì)枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同殺菌劑對(duì)苦瓜枯萎病菌的抑菌作用測(cè)定結(jié)果(表3)表明,7種殺菌劑對(duì)尖孢鐮刀菌苦瓜?；偷囊种菩Ч町惷黠@,在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著質(zhì)量濃度的增加,藥劑的抑菌效果呈現(xiàn)明顯增強(qiáng)的趨勢(shì),除50%異菌脲外,其余6種殺菌劑在最高濃度下的抑制率均達(dá)到了50%。

表3 7種殺菌劑對(duì)苦瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

由表4可見：99%噁霉靈對(duì)苦瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性最強(qiáng),有效抑制中濃度EC50值為0.0352 mg/L;50%多菌靈和25%戊唑醇次之, EC50值分別為0.3037和8.2324 mg/L;75%百菌清、70%甲基硫菌靈、40%五氯硝基苯的EC50值分別為31.3541、64.5849、71.0890 mg/L;50%異菌脲的抑菌效果最差, EC50值為419.0041 mg/L。

表4 7種藥劑對(duì)苦瓜枯萎病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

A:健康的苦瓜植株和葉片(對(duì)照)。B:感病的苦瓜植株和葉片。

3 結(jié)論與討論

枯萎病是嚴(yán)重影響苦瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的一種較難防控的土傳病害,近幾年苦瓜種植戶深受其害,尤其是在多年種植苦瓜的老菜地。樂平市苦瓜種植面積已有660 hm2以上,是當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)蔬菜品種,苦瓜枯萎病已嚴(yán)重影響到蔬菜種植大戶的經(jīng)濟(jì)效益。因此,確定苦瓜枯萎病的致病菌種類,對(duì)癥下藥篩選防治藥劑對(duì)田間防治苦瓜枯萎病具有重要意義。根據(jù)樂平市苦瓜病樣的組織分離結(jié)果,結(jié)合rDNA-ITS序列分析,對(duì)苦瓜枯萎病的病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明,本研究所分離的病原菌為尖孢鐮刀菌苦瓜專化型(FusariumoxysporumSchl.f.sp.momordicae)。

在苦瓜生產(chǎn)中，由于不了解致病菌和殺菌劑的特性,種植戶往往盲目用藥,造成大量浪費(fèi)且防治效果降低,并且影響生態(tài)環(huán)境[12]。因此,需開展苦瓜病害的合理防治研究。本文采用菌絲生長(zhǎng)速率法,篩選市場(chǎng)上常見且低毒的7種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)苦瓜枯萎病致病菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定,其中99%噁霉靈具有顯著的抑制作用,其EC50值為0.0352 mg/L,因此該殺菌劑是田間防治苦瓜枯萎病的較為理想的農(nóng)藥。噁霉靈屬于內(nèi)吸性殺菌劑,可用于土壤殺菌與種子消毒,可以促進(jìn)作物生長(zhǎng)[13]。50%多菌靈也具有較好的抑菌作用。在苦瓜生產(chǎn)上建議多種農(nóng)藥交替使用,避免產(chǎn)生抗藥性。