何 斐,王 冉,雷雨俊,崔 鳴,魯小東

(安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院,陜西 安康 725000)

魔芋是天南星科多年生草本植物,是目前已知的唯一能大量提供葡甘聚糖的特種經(jīng)濟作物[1]。魔芋葡甘聚糖在醫(yī)藥、食品、化工、紡織及農(nóng)業(yè)等多個行業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2]。我國是魔芋生產(chǎn)大國,魔芋產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的60%[3]。陜南秦巴山區(qū)魔芋適生區(qū)面積約占全國的1/3,魔芋生產(chǎn)已成為安康、漢中等區(qū)域特色經(jīng)濟主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)[3-4],也是秦巴山區(qū)脫貧致富的支柱產(chǎn)業(yè)。然而,隨著種植年限的增加,病害已成為魔芋可持續(xù)生產(chǎn)的主要限制因素。

白絹病是近年來在魔芋種植區(qū)內(nèi)發(fā)生的一種重要土傳性病害,也是繼軟腐病后的第二大殺手[4]。魔芋白絹病菌有性型為羅氏阿太菌(Atheliarolfsii),無性世代為齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii)[5-6]。該病害難以根治的主要原因在于齊整小核菌形成的微菌核對極端環(huán)境適應(yīng)力很強,腐生性也極強[7],可長期潛伏于病殘體、雜草及土壤中,成為該病反復(fù)發(fā)生的初侵染源。當(dāng)外界環(huán)境適宜時,齊整小核菌菌核萌發(fā)形成菌絲,通過雨水等途徑傳播,并分泌細(xì)胞壁降解酶為害魔芋葉柄基部和球莖，導(dǎo)致其發(fā)病[5]。魔芋根際土壤是齊整小核菌微菌核形成與存在的重要介質(zhì),土壤pH、養(yǎng)分狀況與根際分泌物等不僅對魔芋及其根際微生物生長有重要作用,對病原菌微菌核形成也會產(chǎn)生一定的影響。魔芋根際土壤中微菌核的數(shù)量及活性直接影響魔芋白絹病的發(fā)生與危害程度。因此,研究齊整小核菌微菌核形成的影響因素,對從微生態(tài)角度揭示魔芋白絹病發(fā)生及流行原因,以及從土壤微生態(tài)調(diào)控途徑預(yù)防魔芋白絹病的發(fā)生及減輕其危害具有重要意義。目前魔芋白絹病的研究主要集中在分子鑒定和生物學(xué)特性[4,8-9]、白絹病發(fā)生危害和防治[4-6]等方面,尚無寄主植物對魔芋白絹病菌微菌核形成影響的報道。作為我國魔芋主產(chǎn)地,秦巴山區(qū)魔芋人工大田栽培面積和種植年限逐年增加[10],兩者對魔芋白絹病菌微菌核的影響均大于其他零星種植區(qū)域。研究表明,魔芋白絹病的發(fā)生與種植年限和菌量存在一定的相關(guān)性[6]。本研究通過皿內(nèi)模擬試驗探究了不同培養(yǎng)條件、魔芋粉、魔芋球莖及根際土壤浸提液對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響,進而確定了這些影響因素在魔芋白絹病發(fā)生及流行過程中所發(fā)揮的作用,可以為闡明秦巴山區(qū)魔芋白絹病流行機理及制定該病害的綜合防治措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii),從陜西省漢中市南鄭區(qū)三花石村魔芋病害生防試驗田采集的白絹病發(fā)病植株中分離獲得。

齊整小核菌的活化與培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基[11]。

1.2 病原菌菌餅的制備

將齊整小核菌經(jīng)PDA斜面轉(zhuǎn)接活化后,取部分菌絲放置于PDA平板中心,在28 ℃下培養(yǎng)7 d,用打孔器切取直徑7 mm的病原菌菌餅，備用。

1.3 培養(yǎng)條件對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

1.3.1 pH 用0.2 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值,制成pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的供試平板,將菌餅置于平板中央,在28 ℃下培養(yǎng)10 d,每個處理3次重復(fù),下同。

1.3.2 營養(yǎng)條件 分別制備全營養(yǎng)PDA(常規(guī)PDA培養(yǎng)基)平板、半營養(yǎng)PDA平板(含無菌水1 L、馬鈴薯100 g、葡萄糖10 g、瓊脂15 g)和水瓊脂平板(無菌水1 L、瓊脂15 g)。將病原菌菌餅分別置于平板中央,于28 ℃培養(yǎng)10 d。

1.3.3 光照 將病原菌菌餅置于PDA平板中央,分別置于連續(xù)光照、連續(xù)黑暗及光暗交替(12 h黑暗+12 h光照)條件下,在28 ℃下培養(yǎng)10 d。

1.4 寄主對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

魔芋粉:新鮮魔芋球莖用自來水清洗干凈,去表皮,切成0.5 cm2小塊,在80 ℃下烘干,用粉碎機粉碎后過0.18 mm篩。在PDA培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為0(CK)、0.5、1、2、5、10 g/L的魔芋粉,制備成含有不同質(zhì)量濃度魔芋粉的供試平板。

魔芋球莖浸提液:稱取去表皮、清洗晾干的魔芋球莖10 g,充分研磨后加入100 mL去離子水，混勻；將混合物置于25 ℃搖床上，以120 r/min振蕩1 h,以6000 r/min離心15 min；然后取上清液，用定性濾紙過濾。為保證魔芋球莖浸提液中的活性成分不被破壞,濾出液用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌后，將其置于4 ℃冰箱保藏備用[12]。取一定體積的魔芋球莖浸提液，分別配制含稀釋0、5、10和50倍魔芋球莖浸提液的PDA培養(yǎng)基(編號依次為C0、C5、C10和C50),以不添加浸提液的PDA培養(yǎng)基為對照(CK)；滅菌后冷卻至60 ℃左右的PDA培養(yǎng)基與過濾除菌的魔芋球莖浸提液混勻，倒平板。

1.5 魔芋根際土壤浸提液對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

2019年6月22日在陜西省漢中市南鄭區(qū)三花石村魔芋病害生防試驗田中,采用五點取樣法和抖根法[13]分別采集同一田塊未種植作物的閑置農(nóng)田土壤、第1年和連作2年的魔芋根際土壤各5份,在自然風(fēng)干、去雜后，研磨過0.25 mm土壤篩。各處理分別稱取混合土樣100 g，加入到100 mL蒸餾水中，浸泡48 h,然后以5000 r/min離心3 min，棄沉淀,重復(fù)2次；將上清液定容至100 mL,得到1 g/mL母液；母液用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，然后于4 ℃冰箱保藏備用[14]。取不同處理的土壤浸提液母液，添加至滅菌后冷卻至60 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中,分別配制含稀釋5、10、50和100倍土壤浸提液的PDA培養(yǎng)基,以不添加土壤浸提液的PDA培養(yǎng)基為對照(CK)；PDA培養(yǎng)基與土壤浸提液混勻后倒平板。

在1.4和1.5節(jié)中的各處理供試平板制備完成后,將1.2節(jié)制備的病原菌菌餅置于平板中央,在28 ℃下培養(yǎng)10 d,各處理重復(fù)3次。

1.6 齊整小核菌生長狀況觀察及菌落與微菌核區(qū)面積測定

上述各處理病原菌平板自第3天起，每24 h觀察記錄生長狀況1次;采用十字交叉法[15]測量病原菌菌落直徑W,根據(jù)公式(1)和(2)分別計算病原菌菌絲的相對生長速率(mm/d)和絕對生長速率(mm/d)[16]:

相對生長速率=(lnWt+1-lnWt)/?t

(1)

絕對生長速率=(Wt+1-Wt)/?t

(2)

上式中:Wt+1表示第t+1天測量的菌落直徑(mm);Wt表示第t天測量的菌落直徑(mm);Δt表示兩次測量菌落直徑的時間差(d)。

采用Image Pro Plus 6.0軟件進行圖片分析,分別測定菌落總面積像素值(colony area pixels, CAP)及微菌核區(qū)面積像素值(microselerotia area pixels, MSAP)。根據(jù)菌落直徑測量值計算菌落總面積(Colony Area, CA)、微菌核區(qū)面積占菌落總面積的比例(Microselerotia Proportion, MSP)及微菌核區(qū)面積(Microselerotia Area, MSA)[15]，其計算公式分別為:

CA=π×(D10/2)2

(3)

MSP=MSAP/CAP×100%

(4)

MSA=CA×MSP10

(5)

式中:D10為病原菌在第10天時培養(yǎng)皿反面菌落直徑;MSAP、CAP分別為微菌核區(qū)面積、菌落總面積的像素值;MSP10為病原菌在第10天時微菌核區(qū)面積占菌落總面積的比例。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0軟件進行方差分析,處理間用Duncan’s法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

2.1.1 pH 由表1和圖1A可知,齊整小核菌在pH 5.0～9.0范圍內(nèi)均可生長,當(dāng)pH值為7.0時菌絲相對生長速率和絕對生長速率均達到最大,分別為0.274和17.72 mm/d。當(dāng)pH值升高或降低時菌絲生長有所減慢,表明偏酸性或堿性會影響齊整小核菌菌絲的生長速率,但不同pH值對菌落和微菌核面積的影響不顯著。

2.1.2 營養(yǎng)條件 齊整小核菌在全營養(yǎng)PDA培養(yǎng)基上的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積、微菌核區(qū)面積及微菌核區(qū)占菌落總面積比例均達到最大,其次為半營養(yǎng)培養(yǎng)基,而在水瓊脂平板上生長最慢且不能形成微菌核,說明營養(yǎng)豐富更有利于齊整小核菌菌絲的生長和微菌核的形成(表1和圖1B)。

2.1.3 光照 由表1和圖1C可以看出,不同光照條件下齊整小核菌菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積、微菌核區(qū)面積及微菌核區(qū)占菌落總面積比例均表現(xiàn)為:連續(xù)黑暗>光暗交替>連續(xù)光照。其中,在連續(xù)黑暗條件下,齊整小核菌微菌核區(qū)面積分別較連續(xù)光照和光暗交替條件下顯著增加了99.7%和7.1%,表明連續(xù)黑暗更有利于齊整小核菌產(chǎn)生微菌核。

A: pH值。B：營養(yǎng)。C：光照。

表1 培養(yǎng)條件對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

2.2 寄主對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

2.2.1 魔芋粉 由表2可知,PDA培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為0.5～10 g/L的魔芋粉時,齊整小核菌菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積及微菌核區(qū)面積隨著魔芋粉質(zhì)量濃度的升高而逐漸增加；當(dāng)魔芋粉質(zhì)量濃度為10 g/L時,齊整小核菌菌落的生長狀況最佳。

2.2.2 魔芋球莖浸提液 由表2可知,在添加稀釋0～50倍魔芋球莖浸提液的PDA培養(yǎng)基中齊整小核菌均可生長,其菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積及微菌核區(qū)面積隨著魔芋球莖浸提液稀釋倍數(shù)的增加而逐漸降低。

表2 魔芋粉及魔芋球莖浸提液對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

2.2.3 魔芋根際土壤浸提液 由表3可知,齊整小核菌在添加稀釋5～100倍不同連作年限魔芋根際土壤浸提液的PDA培養(yǎng)基中均可生長。在相同種植年限條件下,隨著土壤浸提液稀釋倍數(shù)的增加,齊整小核菌菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積及微菌核區(qū)面積逐漸降低。在相同稀釋倍數(shù)條件下,隨著種植年限的增加,齊整小核菌菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、菌落總面積及微菌核區(qū)面積逐漸增加。土壤連作年限、土壤浸提液稀釋倍數(shù)及兩者的交互作用顯著影響齊整小核菌菌絲的相對生長速率、絕對生長速率、微菌核區(qū)面積及微菌核區(qū)占菌落總面積的比例。

表3 魔芋根際土壤浸提液對齊整小核菌菌絲生長及微菌核形成的影響

3 討論與結(jié)論

白絹病又稱菌核根腐病、南方枯萎病、菌核性苗枯病和油菜籽病。1991年,魔芋白絹病首先在江西省宜黃縣地區(qū)發(fā)生,隨后陸續(xù)在全國魔芋主產(chǎn)區(qū)傳播[4]。魔芋白絹病的發(fā)生、流行與環(huán)境條件密切相關(guān),環(huán)境中的光照、土壤營養(yǎng)及pH值等都是關(guān)鍵的影響因子。邢夢玉等[18]研究發(fā)現(xiàn),龍血樹白絹病菌齊整小核菌在有無光照條件下都能生長,說明該病菌對環(huán)境適應(yīng)范圍較廣,這與本研究的結(jié)果基本一致。通過分析光照對齊整小核菌微菌核形成的影響,發(fā)現(xiàn)連續(xù)黑暗更有利于其產(chǎn)生微菌核,在連續(xù)光照下只能產(chǎn)生少量微菌核,這可能與白光抑制或延遲病原真菌微菌核的形成有關(guān)[19]。

崔鳴等[6]研究發(fā)現(xiàn),隨著種植年限的增加,魔芋白絹病逐年加重。即種植年限與魔芋白絹病的發(fā)生存在一定的相關(guān)性,但目前尚無種植年限對魔芋白絹病菌齊整小核菌微菌核形成影響的報道。土壤作為病原菌侵染植物的主要介質(zhì)之一,植物根系分泌到土壤中的酚酸等化感物質(zhì)是很多病原菌的主要能源物質(zhì),對病原菌微菌核的形成與活性有重要影響[15,20]。本研究發(fā)現(xiàn),連作年限及魔芋根際土壤浸提液濃度顯著影響齊整小核菌菌絲的生長及微菌核的形成。不同連作年限魔芋根際土壤浸提液稀釋5～100倍時,齊整小核菌均可生長,且隨著土壤浸提液稀釋倍數(shù)的增加、連作年限的減少,齊整小核菌菌絲的生長速率、菌落總面積和微菌核區(qū)面積亦相應(yīng)降低。大量研究表明,作物根系分泌物在土壤中殘留并隨著種植年限增加而富集[21-22]。由此推測連作魔芋根際土壤中的根系分泌物,尤其是酚酸等化感物質(zhì)可能與齊整小核菌微菌核的形成有關(guān),這與其他作物根系分泌物促進其病原菌生長繁殖的結(jié)論[22]相似。在逆境生長條件下,微菌核是魔芋白絹病菌主要的存在方式,在無寄主的情況下也能在土壤中維持?jǐn)?shù)年。連作致使魔芋根系分泌物的數(shù)量和種類發(fā)生了一定程度的變化,這可能導(dǎo)致魔芋根際土壤微生物的種類和數(shù)量也發(fā)生改變。不同連作年限的魔芋根系分泌物及由分泌物誘導(dǎo)而改變了的根際微生物又會作用于土壤,對土壤營養(yǎng)元素的平衡產(chǎn)生影響,這又會加劇由魔芋對土壤營養(yǎng)元素偏好吸收而造成的營養(yǎng)不平衡,導(dǎo)致魔芋生長發(fā)育不良及抗病能力下降,因而造成連作條件下魔芋白絹病發(fā)生的風(fēng)險更大、概率更高,難以防治。因此,在生產(chǎn)實踐中,應(yīng)盡量采用合理輪作、間作及混種等技術(shù)，以便有效減少白絹病菌在魔芋植株殘體和根際土壤中的殘留,使病原菌失去寄主或生活環(huán)境惡化,從而有效降低魔芋白絹病的發(fā)生率[23]。

夏紅飛等[12]研究表明,寄主根系提取物能誘導(dǎo)棉花黃萎病菌大麗輪枝菌微菌核形成相關(guān)基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn),一定質(zhì)量濃度的魔芋粉及球莖浸提液刺激齊整小核菌菌絲生長及微菌核的形成,推測魔芋球莖中的某些成分也可能誘導(dǎo)病原菌菌絲和微菌核形成相關(guān)基因的表達。但魔芋球莖營養(yǎng)豐富,包含葡甘聚糖、粗蛋白、游離氨基酸、淀粉、可溶性糖、還原糖、生物堿、多酚氧化酶及神經(jīng)酰胺等[25]多種成分,魔芋粉和球莖浸提液中具體何種活性成分在發(fā)揮作用尚不清楚,其作用機制是誘導(dǎo)齊整小核菌孢子萌發(fā)或芽管伸長,還是作用于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)等,均有待于通過進一步研究來明確。