吳忠秀，陸定艷，楊暢，何彬，李勇軍，王永林，劉亭**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 &省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心 &省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004)

隨著人們生活水平的改變以及不均衡膳食營養(yǎng)的攝入，心血管系統(tǒng)疾病如高血壓、高血脂、冠心病、心絞痛及動脈粥樣硬化等發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響人們的健康以及生活質(zhì)量，同時這也是導(dǎo)致中老年人死亡的原因之一[1-2]。因此，心血管系統(tǒng)疾病的預(yù)防、治療和診斷至關(guān)重要。有研究表明，氧化應(yīng)激會導(dǎo)致動脈粥樣硬化、心絞痛、急性心肌梗死等一系列心血管疾病[3]，而心肌細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞氧化損傷的重要表現(xiàn)形式之一，所以預(yù)防或治療心血管疾病的關(guān)鍵是抗細(xì)胞凋亡[4-5]。參芎葡萄糖注射液(shenxiong glucose injection，SGI)是由丹參提取物和鹽酸川芎嗪組成的注射液，收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[6]，其具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用[7-8]，主要含有丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、鹽酸川芎嗪、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸I/H、紫草酸、丹酚酸C以及Genipin 12種已知成分，及一種未知成分[9]，在臨床上，SGI對冠心病、心絞痛、腦梗死等閉塞性腦血管病及其它缺血性心血管疾病的防治具有確切療效，且無明顯毒副作用[9-10]。但迄今為止，SGI抗細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制仍不清楚。本文擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測SGI抗細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡模型驗(yàn)證SGI拮抗H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制，為SGI的進(jìn)一步深入開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)試劑 H9c2大鼠心肌細(xì)胞株由中科院上海細(xì)胞庫提供。參芎葡萄糖注射液(批號H52020703，500 mL/瓶)購自貴州景峰注射劑有限公司，H2O2(批號20140803，GR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(批號8128032)、胎牛血清(FBS，批號1237698)、胰蛋白酶(批號J130089)均購自Gibco公司，青霉素-鏈霉素(批號15140-122)、RIPA細(xì)胞裂解液(含PMSF蛋白酶抑制劑，批號20141219)、磷酸鹽緩沖液(PBS粉末，自配)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號20140722)均購自Solarbio公司，JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(批號20150314)購自美國Sigma公司，兔抗Cyt-c多抗(批號AC63325)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (批號AB01151)購自巴傲得生物科技有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo scientific公司),TS100倒置顯微鏡(Nikon公司)、Allegra 64R冷凍高速離心機(jī)(美國Beckman),Model 680酶標(biāo)儀、BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀(美國BD公司),ChemiDoc XRS+凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SGI作用靶點(diǎn)信息獲取 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology platform，TCMSP)，選擇CAS搜索框，輸入SGI的丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸C、Genipin的CAS號檢索相關(guān)靶點(diǎn)；在SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫的檢索框中輸入鹽酸川芎嗪、丹酚酸B、紫草酸和丹酚酸I/H的SMILES格式檢索靶點(diǎn)。見表1。

1.2.2京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集和基因本體(gene ontology，GO)功能注釋 運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(database for annotation,visualizationand integrated discovery,DAVID)平臺進(jìn)行GO功能注釋和KEGG的通路富集分析，再通過Hiplot科研數(shù)據(jù)可視化平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)柱狀圖可視化。見表1。

表1 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)庫(軟件)及對應(yīng)的網(wǎng)址Tab.1 Data analysis database/software and corresponding websites

1.2.3SGI預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的影響 取對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞，用含完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為10×104個/mL于100 mm培養(yǎng)皿中，每皿10 mL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h。將細(xì)胞分為Con組、H2O2組以及SGI(低、中、高)濃度組(以主要成分鹽酸川芎嗪為濃度計(jì)量，濃度分別為100、200、400 μmol/L)，先用PBS 4 mL洗兩次，Con組和H2O2組加入完全培養(yǎng)基，SGI低、中、高濃度組分別加入含有100、200、400 μmol/L SGI的完全培養(yǎng)基，各組于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，吸出藥液，用DMEM無血清培養(yǎng)基4 mL洗滌細(xì)胞2次。Con組加入10 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，SGI組和H2O2組和中每孔加入H2O2濃度為300 μmol/L的無血清培養(yǎng)基，孵育0.5 h，PBS 4 mL 洗2次，胰蛋白酶消化液1 mL消化1 min，再加入完全培養(yǎng)基5 mL重懸細(xì)胞，收集細(xì)胞待用；按照線粒體膜電位檢測試劑盒說明書標(biāo)記細(xì)胞，處理后待機(jī)上樣，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)MMP的變化。

1.2.4SGI預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt-c)的含量影響 取對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞，用含完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為10×104個/mL于100 mm培養(yǎng)皿中，每皿10 mL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h。依據(jù)“1.2.3”給藥方法處理細(xì)胞，吸出液體，取PBS 4 mL 緩沖液潤洗2遍，加入RIPA細(xì)胞裂解液200 μL(含1%PMSF)，冰上裂解至黏稠狀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，渦混30 s，冰上靜止5 min，重復(fù)該步驟1～2次，將裂解液在4 ℃離心機(jī)離心10 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min得到總蛋白，取少量用于測定蛋白質(zhì)濃度，剩余的加入6×Buffer煮沸變性，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測Cyt-c表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，組間差異比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，兩組間比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SGI作用靶點(diǎn)信息獲取

以SGI的12個成分為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索得到相關(guān)靶點(diǎn)142個，其中丹參素20個、原兒茶醛9個、咖啡酸9個、丹酚酸D 2個、丹酚酸A 34個、丹酚酸C 1個、Genipin 9個、鹽酸川芎嗪13個、丹酚酸B 15個、紫草酸15個和丹酚酸I/H 15個，主要包含絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3)、蛋白激酶1 (protein kinase 1,Akt1)等。

2.2 KEGG通路富集

運(yùn)用DAVID平臺進(jìn)行KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，KEGG通路富集到90條信號通路，其中MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路和p53信號通路與Cyt-c的釋放密切相關(guān)。

2.3 GO功能注釋

運(yùn)用DAVID平臺進(jìn)行GO功能注釋結(jié)果顯示，富集到生物過程(biological process，BP)409條、細(xì)胞組分(cellular component，CC)59條以及分子功能(molecular function，MF)67條，其中主要富集的線粒體、線粒體外膜以及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated protein kinase1/2，ERK1/2)信號通路的激活等，均與MMP調(diào)節(jié)和Cyt-c釋放緊密相關(guān)。

圖1 SGI相關(guān)靶點(diǎn)KEGG通路富集Fig.1 Enrichment of KEGG pathway related targets of SGI

圖2 SGI相關(guān)靶點(diǎn)GO功能分析Fig.2 GO function analysis of related targets of SGI

2.4 SGI預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)H9c2 MMP的影響

與Con組MMP熒光強(qiáng)度(21 059±1 237)比較，H2O2組H9c2細(xì)胞內(nèi)MMP熒光強(qiáng)度為(5 298±457)，明顯降低(P<0.001)；與H2O2組比較，SGI組低、中、高濃度組H9c2細(xì)胞MMP的熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.001)，熒光強(qiáng)度分別為10 087±957、14 962±1 420、18 680±1 045。由此可見，H2O2損傷H9c2細(xì)胞MMP熒光強(qiáng)度顯著降低，而SGI低、中、高組均能夠明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞MMP的降低。見圖3。

2.5 SGI預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中Cyt-c的影響

與Con組比較，H2O2組H9c2細(xì)胞中Cyt-c蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.001)；與H2O2組比較，SGI低、中、高濃度組Cyt-c蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.001)。見圖4。

注：(1)與Con組比較，P<0.001；(2)與H2O2組比較，P<0.001。圖4 SGI對H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞Cyt-c蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of SGI on Cyt-c protein expression in H9c2 cells induced by H2O2

注：A為Con組，B為H2O2組，C為SGI低濃度組，D為SGI中濃度組，E為SGI高濃度組，F(xiàn)為結(jié)果統(tǒng)計(jì)；(1)與Con組比較，P<0.001；(2)與H2O2組比較，P<0.001。圖3 SGI對H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞MMP的影響Fig.3 The effect of SGI on MMP in H9c2 cells induced by H2O2

3 討論

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞自主的程序性死亡，受基因的調(diào)控，在細(xì)胞和機(jī)體的生長、繁殖和發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，同時也與人類的重大疾病相關(guān)[5]。有研究表明心肌梗死、缺血性心臟病、再灌注損傷等各種心血管系統(tǒng)疾病與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[11]，其中氧化應(yīng)激在心肌細(xì)胞凋亡中起重要作用。當(dāng)氧化與抗氧化平衡傾向氧化作用時，會產(chǎn)生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，如H2O2會刺激線粒體釋放Cyt-c，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[12-13]。因此抗心肌細(xì)胞凋亡是治療心血管系統(tǒng)疾病主要途徑之一。

心肌細(xì)胞凋亡途徑主要包括死亡受體途徑、線粒體途徑[5,14]和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[15]。有研究發(fā)現(xiàn)在病理狀態(tài)下，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)大量開放，而MPTP與MMP的穩(wěn)定、凋亡蛋白的釋放等密切相關(guān)[16-17]，它的非特異性開放會導(dǎo)致線粒體受損以及Cyt-c釋放，從而激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和促凋亡因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[18-19]。MAPK信號通路主要由3條并行信號通路組成，分別是線粒體外膜以及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated protein kinase，ERK)通路、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK)通路和p38通路[20]。JNK和p38在各種細(xì)胞應(yīng)激因子的刺激下被磷酸化激活，在誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax表達(dá)的同時抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，從而導(dǎo)致Bax介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑；而ERK1/2的激活不但可以上調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)[21]，還能減少Cyt-c從線粒體釋放到胞質(zhì)從而抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[22-24]。PI3K-AKT信號通路在細(xì)胞的增殖和凋亡中起著重要作用，AKT磷酸化后可調(diào)控Bcl-2、Bax以及Cyt-c等的表達(dá)，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用[25-26]。本研究對SGI的12個成分進(jìn)行KEGG通路富集后，發(fā)現(xiàn)SGI與MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路密切相關(guān)；GO功能注釋結(jié)果顯示，SGI主要富集在線粒體、線粒體膜電位調(diào)節(jié)等，與MMP調(diào)節(jié)和Cyt-c的釋放密切相關(guān)[3,11]，同時SGI的靶點(diǎn)MAPK1、Caspase-3、Akt1等也與線粒體有關(guān)[27-29]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，SGI低、中、高濃度組均能顯著升高H9c2細(xì)胞的MMP和明顯下調(diào)Cyt-c的表達(dá)，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析一致，提示SGI可能是通過線粒體途徑抑制心肌細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮治療疾病的作用。

綜上所述，SGI可通過上調(diào)MMP和降低Cyt-c的釋放調(diào)控線粒體途徑，從而產(chǎn)生抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。