陳自泓， 黃可兒

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州白云山星珠藥業(yè)有限公司，廣東廣州 510931）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫的作用。現(xiàn)代藥理研究表明，由單味中藥黃芪研發(fā)的口服制劑黃芪精可以降低乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷小鼠胃黏膜損傷分?jǐn)?shù)，有明顯的保護(hù)胃黏膜的作用[1]；還有研究表明，黃芪水煎液能明顯減輕胃潰瘍大鼠胃黏膜損傷，對(duì)潰瘍的抑制具有一定的量效關(guān)系[2]。黃芪多糖是黃芪的主要成分之一，臨床上研究應(yīng)用較廣泛，大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，黃芪多糖具有調(diào)節(jié)免疫力[3]、抗腫瘤[4]、降脂[5]、抗心力衰竭[6]等作用，但對(duì)其是否具有保護(hù)胃黏膜的作用及相關(guān)機(jī)制，則鮮有報(bào)道。半仿生提取法是張兆旺等[7-8]根據(jù)“化學(xué)成分等值不一定生物等效”提出的一種新興的提取技術(shù)。該技術(shù)既重視單體成分，又注重中藥復(fù)方的整體作用，可盡量多地保留有效成分，縮短生產(chǎn)周期。本課題組前期優(yōu)化了半仿生提取的黃芪多糖的工藝[9]。本研究進(jìn)一步探討半仿生提取的黃芪多糖改善乙醇誘導(dǎo)大鼠胃黏膜損傷的作用及機(jī)制，以期為闡明黃芪防治消化系統(tǒng)疾病的傳統(tǒng)應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)，對(duì)指導(dǎo)臨床治療胃病中藥用藥及開發(fā)新藥提供一定的參考價(jià)值?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量180~220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44005800009586。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證號(hào)：00214897。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20~25℃，相對(duì)濕度40%~70%，晝夜節(jié)律12 h∕12 h，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。

1.2 藥物黃芪藥材購(gòu)自廣州采芝林藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定研究室張丹雁教授鑒定為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根；胃乃安膠囊，由廣州白云山中一藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：Z00003。

1.3 試劑與儀器兔抗鼠B細(xì)胞白血病2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；兔鏈霉親和素（Streptavidin）-辣根過(guò)氧化物酶（HRP）試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；SP-9001生物素標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）、3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋有限公司）。SHA-B恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）；LXJ-IB低速大功率多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LGJ-25C冷凍干燥機(jī)[四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司]；TC-15恒溫電熱套（海寧市華星儀器廠）。

1.4 黃芪多糖的半仿生提取稱取黃芪藥材200 g打粉，溶解于6 L模擬胃液中，在100℃條件下提取1 h，提取液離心取上清，得到模擬胃液提取液。沉淀溶于6 L模擬腸液中，在100℃條件下提取1 h，提取液離心取上清，得到模擬腸液提取液。合并模擬胃液提取液與模擬腸液提取液濃縮至相對(duì)密度約1.09，放冷。加入4倍量的95%乙醇，4℃靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，無(wú)水乙醇、丙酮交替洗滌2次，溶解回收無(wú)水乙醇及丙酮干凈后冷凍干燥即得。

1.5 分組、造模與給藥適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常組，模型組，胃乃安組，黃芪多糖低、高劑量組，每組10只。黃芪多糖低、高劑量組分別給予半仿生黃芪多糖10 g∕kg（生藥量）和20g∕kg（生藥量）灌胃，胃乃安組給予3g∕kg胃乃安膠囊粉灌胃，正常組及模型組給予等體積的純凈水灌胃，1次∕d，連續(xù)2 d。末次給藥前全部大鼠禁食不禁水24 h。末次給藥2 h后，除正常組外，其余各組大鼠分別灌胃無(wú)水乙醇1.4 mL∕只誘導(dǎo)急性胃黏膜損傷。1 h后處死大鼠，開腹取胃。

1.6 大鼠胃黏膜損傷（肉眼）情況的測(cè)定胃黏膜損傷評(píng)分：沿胃大彎剪開，浸洗后，展開置于預(yù)冷的濾紙上，肉眼觀察胃黏膜損傷情況并拍照，并用卡尺對(duì)損傷部位進(jìn)行測(cè)量。參考Guth標(biāo)準(zhǔn)[10]，進(jìn)行胃黏膜大體評(píng)分：未出現(xiàn)明顯損傷，計(jì)0分；斑點(diǎn)糜爛，計(jì)1分；糜爛長(zhǎng)度1 mm，計(jì)2分；糜爛長(zhǎng)度1~2 mm，計(jì)3分；糜爛長(zhǎng)度2~3 mm，計(jì)4分；糜爛長(zhǎng)度3 mm，計(jì)5分。寬度＞1 mm時(shí)分值乘以2。各分值累計(jì)相加為該只大鼠胃黏膜損傷總分值。

1.7 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察胃黏膜的病理學(xué)變化及評(píng)分剪取1 cm×0.3 cm條狀胃組織，置于中性福爾馬林緩沖液中固定24~26 h。經(jīng)包埋、過(guò)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，切片，調(diào)整切片厚度為4μm。HE染色，封片。在光鏡下觀察及評(píng)分：通過(guò)黏膜損傷的深度與損傷占黏膜的面積評(píng)分，比較大鼠胃黏膜損傷程度的差異。損傷深度≤1∕3，計(jì)1分；1∕3＜損傷深度＜2∕3，計(jì)2分；損傷深度≥2∕3，計(jì)3分。1%≤損傷面積＜30%，計(jì)1分；30%≤損傷面積＜60%，計(jì)2分；60%≤損傷面積＜90%，計(jì)3分；損傷面積≥90%，計(jì)4分。光鏡下胃黏膜損傷指數(shù)=損傷深度評(píng)分×損傷面積評(píng)分。

1.8 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃黏膜組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)將切片分別經(jīng)二甲苯、乙醇洗脫，再經(jīng)抗原修復(fù)后，用正常羊血清工作液封閉10 min，然后將配好的Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗工作液（1∶50稀釋）滴加在組織上，37℃恒溫箱中孵育2 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌。在切片組織上滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔的二抗后，滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合的二抗，PBS洗滌3次，滴加DAB顯色液，PBS漂洗3次，滴加蘇木素，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。應(yīng)用Image-Pro?Plus 6.0系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)定平均光密度（IOD）值。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。若數(shù)據(jù)方差齊，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法；若方差不齊，采用Dunnett’s檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃黏膜損傷（肉眼）分?jǐn)?shù)比較圖1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組的肉眼胃黏膜損傷分?jǐn)?shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，胃乃安組，黃芪多糖低、高劑量組及胃乃安組肉眼觀察的胃黏膜損傷分?jǐn)?shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；黃芪多糖低、高劑量組肉眼觀察的胃黏膜損傷分?jǐn)?shù)與胃乃安組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠胃黏膜損傷（肉眼）情況比較Figure 1 Comparison of gastric mucosal injury（by the naked eye）of rats in various groups

2.2 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)形態(tài)比較圖2-A~E結(jié)果顯示：正常組大鼠胃黏膜組織細(xì)胞排列緊密、有序，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，腺體完整；模型組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞脫落、壞死，腺體排列紊亂，黏膜下層水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體擴(kuò)張，有紅細(xì)胞外滲；胃乃安組可見少量上皮細(xì)胞脫落，損傷情況較模型組輕，黃芪多糖低、高劑量組損傷情況較輕。

圖2-F結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組光鏡下胃黏膜損傷指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪多糖低、高劑量組及胃乃安組光鏡下胃黏膜損傷指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；黃芪多糖低、高劑量組光鏡下胃黏膜損傷指數(shù)與胃乃安組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure 2 Comparison of pathological morphological features of gastric mucosa tissues of rats in various groups（by HE staining，×200）

2.3 各組大鼠胃黏膜組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)比較圖3~5結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低（P＜0.05），促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪多糖低、高劑量組及胃乃安組大鼠胃黏膜組織中抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平升高（P＜0.05或P＜0.01），促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)水平降低（P＜0.05或P＜0.01）；黃芪多糖低、高劑量組胃黏膜組織Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)水平與胃乃安組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠胃黏膜組織Bcl-2蛋白表達(dá)比較（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 3 Comparison of Bcl-2 protein expression in gastric mucosa of rats in various groups（by immuohistochemical method，×200）

3 討論

無(wú)水乙醇或高濃度乙醇作為一種高刺激性攻擊因子，當(dāng)乙醇的濃度或攝入量超過(guò)胃黏膜可承受的范圍，將對(duì)胃黏膜正常的生理代謝環(huán)境產(chǎn)生一系列的影響，如促使胃黏膜屏障發(fā)生失衡、胃酸分泌失調(diào)、激發(fā)炎癥因子及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和釋放、改變胃黏膜微循環(huán)狀態(tài)以及影響胃腸激素如一氧化氮（NO）與前列腺素（PGE2）的釋放、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，從而引起一系列胃黏膜的損害。而介導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞凋亡可能是乙醇誘導(dǎo)胃黏膜生物性損傷的關(guān)鍵病理機(jī)制之一[11-14]。

胃黏膜細(xì)胞的凋亡及增殖是胃黏膜保護(hù)機(jī)制的重要方面。有關(guān)研究顯示，細(xì)胞凋亡與急性胃黏膜損傷的發(fā)生有密切關(guān)系[15]，細(xì)胞凋亡過(guò)度而細(xì)胞增殖受抑必將破壞胃黏膜的完整性，最終造成胃黏膜損傷。Bax和Bcl-2是目前已知的一對(duì)重要的正負(fù)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因[16]。Bcl-2在有關(guān)凋亡的機(jī)制中被廣泛研究，Bcl-2定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，Bcl-2能通過(guò)控制線粒體膜通透性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡，其能通過(guò)阻止細(xì)胞色素c從線粒體中釋放或者通過(guò)與凋亡激活因子結(jié)合來(lái)抑制Caspase活性及Bcl-2的過(guò)表達(dá)，減少活性氧簇（ROS）的產(chǎn)生，進(jìn)一步減輕因ROS損傷而引起的細(xì)胞調(diào)亡[17]。

圖4 各組大鼠胃黏膜組織Bax蛋白表達(dá)比較（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 4 Comparison of Bax protein expression in gastric mucosa of rats in various groups（by immuohistochemical method，×200）

圖5 各組大鼠胃黏膜組織Caspase-3蛋白表達(dá)比較（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 5 Comparison of Caspase-3 protein expression in gastric mucosa of rats in various groups（by immuohistochemical method，×200）

Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，而Bax能與Bcl-2形成二聚體蛋白酶促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bax位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，Bcl-2和Bax蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白酶Caspase的激活來(lái)影響細(xì)胞存活。Caspase的激活最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵步驟是激活Caspase-3，在生理狀態(tài)下，Caspase-3以無(wú)活性pro-Caspase-3存在，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，它會(huì)切割多種底物，如DNA修復(fù)酶、聚合酶[18]?？梢?，Bax、Bcl-2、Caspase-3的異常表達(dá)與胃黏膜細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：乙醇誘導(dǎo)大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞脫落、壞死，腺體排列紊亂，黏膜下層水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體擴(kuò)張，有紅細(xì)胞外滲，胃黏膜損傷（肉眼與光鏡觀察）分?jǐn)?shù)升高。進(jìn)一步通過(guò)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組胃黏膜組織Bcl-2表達(dá)降低，Bax和Caspase-3的表達(dá)升高。表明乙醇誘導(dǎo)成功致大鼠胃黏膜組織出現(xiàn)損傷與凋亡。

用半仿生法提取的黃芪多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，半仿生提取黃芪多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷具有防治作用，病理學(xué)表現(xiàn)為上皮細(xì)胞脫落減少、胃黏膜損傷減輕，并發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)升高抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、降低促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)胃黏膜的作用。另外，查閱文獻(xiàn)研究[19]也發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能通過(guò)降低ROS、丙二醛（MDA）和Bax的水平，抑制Caspase-3的活性，提高超氧化物歧化酶（SOD）等的表達(dá)保護(hù)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞受到的缺氧損傷。故推測(cè)黃芪多糖可能是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)胃黏膜的作用。

綜上所述，半仿生提取黃芪多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷具有明顯的修復(fù)作用，可通過(guò)升高抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。