董梁， 張敬， 繆柯

（1.衡水市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河北衡水 053000；2.衡水市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河北衡水 053000；3.義烏市中心醫(yī)院肝膽胰腺外科，浙江義烏 322000）

結(jié)腸癌（colorectal cancer）是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因之一[1]。治療方案主要包括外科手術(shù)和放化療，常伴隨嚴(yán)重的副作用，影響患者的生活質(zhì)量[2-3]。尋找高效低毒的抗腫瘤藥物是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，而從中藥中提取天然活性成分逐漸成為現(xiàn)代抗腫瘤藥物開發(fā)的新趨勢[4]。川芎內(nèi)酯（ligustilide），是中藥當(dāng)歸和川芎的主要提取物成分之一，分子式為C12H14O2。研究表明，川芎內(nèi)酯具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛和抗癌等多種藥理活性[5]。川芎內(nèi)酯對乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑素瘤和前列腺癌均具有明顯的療效[6-9]。本研究選擇2株結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和SW480，探究川芎內(nèi)酯對結(jié)腸癌的抗癌作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器川芎內(nèi)酯（成都阿爾法生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，分子量為190.24，批號：AB0194），溶于二甲基亞砜（DMSO）中，于-20℃保存。DMEM培養(yǎng)基、TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）、放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（上海碧云天公司）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素∕碘化丙啶（Annexin V-FITC∕PI）雙染試劑盒（美國BD Pharmingen公司）；β-肌動蛋白（β-actin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）及裂解的Caspase-3（cleaved Caspase-3）等抗體（英國Abcam公司）；WesternBright電 化 學(xué) 發(fā) 光（ECL）液（美 國GE Healthcare公司）；BD MitoScreen（JC-1）試劑盒（美國BD Biosciences公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（美國Sigma-Aldrich公司）；Aldefluor分析試劑盒（加拿大Stem Cell Technology公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Scientific）公司；SybGreen I（上海捷瑞生物公司）；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（美國R&D公司）。酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；Accuri C6流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司）；PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 體外研究

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和SW620細(xì)胞均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。2種細(xì)胞系均以含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞活力測定將SW480和SW620細(xì)胞分別接種到96孔板中，1×104個(gè)∕孔，以含有10%FBS的100μL DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，貼壁過夜。用不同濃度的川芎內(nèi)酯處理24 h后，加入10μL CCK-8溶液，于37℃下孵育1 h。應(yīng)用酶標(biāo)儀測量波長為450 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3遍。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)將SW480和SW620細(xì)胞以4×103個(gè)∕孔的密度接種在6孔板中，分別以川芎內(nèi)酯0、25、50和100μmol∕L的濃度培養(yǎng)14 d，直到出現(xiàn)可見的菌落，進(jìn)行結(jié)晶紫染色。應(yīng)用ImageJ軟件計(jì)算菌落數(shù)，重復(fù)測試3次。

1.2.4 Annexin-V-FITC∕PI染色將SW480和SW620細(xì)胞以5×104個(gè)∕孔的密度接種在6孔板中過夜，然后分別用川芎內(nèi)酯0、25、50、100μmol∕L濃度處理48 h后，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行Annexin V-FITC∕PI染色。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測p21和活化Caspase-3蛋白表達(dá)將SW480和SW620細(xì)胞以1×106個(gè)∕孔的密度接種到6孔板中培養(yǎng)，分別用川芎內(nèi)酯0、25、50、100μmol∕L濃度處理48 h。加入RIPA裂解緩沖液冰上裂解30 min。將裂解物以12 000×g離心10 min，使用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。取40μg蛋白裂解物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5%牛奶的TBST室溫封閉1 h，再與一抗β-actin（1∶1 000稀釋）、p21（1∶1 000稀釋）、Caspase-3（1∶1 000稀釋）、cleaved Caspase-3（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。洗膜后，將膜與IgG-辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（1∶4 000稀釋）37℃孵育1 h。最后使用WesternBright增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑曝光、顯影，分析免疫反應(yīng)帶。

1.2.6 線粒體膜電位（ΔΨm）使用BDMitoScreen（JC-1）試劑盒評估ΔΨm的變化。將細(xì)胞以1×105個(gè)∕孔的密度接種在6孔板中，分別用川芎內(nèi)酯25、50和100μmol∕L的濃度處理48 h后，將細(xì)胞懸浮在500μLJC-1工作溶液中，并在37℃孵育30 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.7 SOD和MDA測定將SW480和SW620細(xì)胞以7.5×103個(gè)∕孔的密度接種到96孔板中，分別用川芎內(nèi)酯0、25、50和100μmol∕L的濃度處理48 h。按照試劑盒說明書方法進(jìn)行SOD和MDA含量的測定。

1.2.8 干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)將SW480和SW620細(xì)胞2×103個(gè)∕孔接種于超低附著的24孔板中，分別用加入含川芎內(nèi)酯0、25、50和100μmol∕L濃度的DMEM∕F-12培養(yǎng)基（含有10 ng∕mL EGF，10 ng∕mL bFGF，1%B27）培養(yǎng)10 d后，顯微鏡下拍照，并使用ImageJ軟件手動計(jì)算球體直徑大小。

1.2.9 Aldefluor分析法檢測ALDH活性將SW480和SW620細(xì)胞以1×106個(gè)∕孔的密度接種到6孔板中培養(yǎng)，分別以0、25、50、100μmol∕L濃度的川芎內(nèi)酯培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞重懸于1 mL Aldefluor緩沖液中，加入5μL BAAA并短暫混合后，立即將300μL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至裝有5μL DEAB的離心管中，用移液器均勻混合。然后將2個(gè)離心管放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，于37℃孵育40 min。將細(xì)胞用Aldefluor緩沖液洗滌2次，并最終重懸于500μL補(bǔ)充有DAPI的Aldefluor緩沖液中以染色死細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.10 qRT-PCR檢測Nanog、OCT4和SOX2mRNA表達(dá)將SW480和SW620細(xì)胞以1×106個(gè)∕孔細(xì)胞的密度接種到6孔板中培養(yǎng)，分別用0、25、50和100μmol∕L濃度的川芎內(nèi)酯培養(yǎng)基處理48 h后，用TRIzol溶液提取總RNA，用Nanodrop 2000測量RNA濃度和質(zhì)量，使用ReverAid First Stand cDNA在20μL反應(yīng)系統(tǒng)中將1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)SybGreen I的說明使用7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行以下程序：95℃變性5 min，95℃15 s、60℃60 s退火，72℃30 s延伸，進(jìn)行40次循環(huán)。重復(fù)3次。應(yīng)用2-ΔΔCT方法計(jì)算目的基因的mRNA的相對定量表達(dá)。Nanog（97 bp）上游引物序列為5’-CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA-3’，下游引物序列為5’-CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC-3’；OCT4（164 bp）上游引物序列為5’-CTTGAATCCCGAAT GGAAAGGG-3’；下游引物序列為5’-GTGTATAT CCCAGGGTGATCCTC-3’；SOX2（110 bp）上游引物序列為5’-TACAGCATGTCCTACTCGCAG-3’，下游引物序列為5’-GAGGAAGAGGTAACCACAG GG-3’。

1.3 體內(nèi)研究

1.3.1 動物20只5周齡BALB∕c nu∕nu裸鼠，雌雄各半，體質(zhì)量16~20 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）2016-0011。將裸鼠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，房間溫度控制在22~25℃，濕度維持在50%~60%，光∕暗時(shí)間各為12 h，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 分組、造模與給藥將20只裸鼠隨機(jī)分為對照組和川芎內(nèi)酯組，每組10只。2組裸鼠皮下接種100μL含1×107個(gè)SW480細(xì)胞的PBS構(gòu)建荷瘤模型。約10 d，腫瘤體積達(dá)到50 mm3，裸鼠腹腔注射5 mg∕kg川芎內(nèi)酯[10]。每隔5 d測量并計(jì)算一次裸鼠的腫瘤體積（V），V=0.5×l×b2（l、b分別為腫瘤長度、寬度）。移植30 d后，處死動物并取出腫瘤稱質(zhì)量后保存于40 g∕L多聚甲醛溶液以用于后續(xù)研究。

1.3.3 TUNEL染色取40 g∕L多聚甲醛溶液固定的腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋、切片和脫水，然后與TUNEL反應(yīng)混合物37℃孵育1 h后，再滴加DAB顯色液進(jìn)行顯色。最后在光學(xué)顯微鏡（200倍）下觀察并計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織p21和SOX2的表達(dá)取40 g∕L多聚甲醛溶液固定的腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋、切片。石蠟切片脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液修復(fù)。一抗4℃孵育過夜。二抗37℃孵育1 h。洗滌后避光顯色并用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。封片后使用光學(xué)顯微鏡觀察p21、SOX2陽性表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的川芎內(nèi)酯對結(jié)腸癌細(xì)胞活力的影響圖1結(jié)果顯示，川芎內(nèi)酯劑量依賴性降低SW620和SW480細(xì)胞的存活率，可有效抑制細(xì)胞增殖。SW620細(xì)胞的IC50在50~100μmol∕L之間，SW480細(xì)胞的IC50在25~50μmol∕L之間，因此選擇25、50、100μmol∕L的川芎內(nèi)酯濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度的川芎內(nèi)酯對結(jié)腸癌細(xì)胞活力的影響Figure 1 Effect of different concentrations of ligustilide on viability of colon cancer cells

2.2 川芎內(nèi)酯對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響圖2-A1~A3結(jié)果顯示，與川芎內(nèi)酯0μmol∕L組比較，SW620細(xì)胞的川芎內(nèi)酯50、100μmol∕L組克隆形成率明顯降低（P<0.05），SW480細(xì)胞的川芎內(nèi)酯25、50、100μmol∕L組 克 隆 形 成 率 降 低（P<0.05），均呈劑量依賴的方式。

圖2-B1~B3結(jié)果顯示，與川芎內(nèi)酯0μmol∕L組比較，SW620細(xì)胞的川芎內(nèi)酯50、100μmol∕L組凋亡率顯著升高（P<0.05），SW480細(xì)胞的川芎內(nèi)酯25、50、100μmol∕L組凋亡率顯著升高（P<0.05），均呈劑量依賴的方式。

圖2-C1~C2、圖2-D1~D2結(jié)果顯示，SW620細(xì)胞的川芎內(nèi)酯50、100μmol∕L組中p21、cleaved Caspase-3∕Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），SW480細(xì)胞的川芎內(nèi)酯25、50、100μmol∕L組中p21、cleaved Caspase-3∕Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），均呈劑量依賴的方式。

圖2 川芎內(nèi)酯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡Figure 2 Ligustilide inhibiting proliferation of colon cancer cells to promote apoptosis

2.3 川芎內(nèi)酯對結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體膜電位及抗氧化能力的影響圖3-A1~A3結(jié)果顯示，川芎內(nèi)酯處理的SW620、SW480結(jié)腸癌細(xì)胞中綠色熒光JC-1單體增加，紅色熒光J聚集體減少，表明川芎內(nèi)酯引起線粒體膜電位的降低。

圖3-B、-C結(jié)果顯示，與川芎內(nèi)酯0μmol∕L組比較，SW620細(xì)胞的川芎內(nèi)酯50、100μmol∕L組SOD水平明顯降低（P<0.05），MDA水平明顯升高（P<0.05），SW480細(xì)胞的川芎內(nèi)酯25、50、100μmol∕L組中SOD水平明顯降低（P<0.05），MDA水平明顯升高（P<0.05），且均呈劑量依賴的方式。

圖3 川芎內(nèi)酯對結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體功能的影響Figure 3 Effect of ligustilide on mitochondrial function of colon cancer cells

2.4 川芎內(nèi)酯對結(jié)腸癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響圖4-A1~A3結(jié)果顯示，與川芎內(nèi)酯0μmol∕L組比較，SW620細(xì)胞的川芎內(nèi)酯50、100μmol∕L組成球直徑均明顯減?。≒<0.05），SW480細(xì)胞的川芎內(nèi)酯25、50、100μmol∕L組成球直徑均明顯減?。≒<0.05）。

圖4-B1~B3結(jié)果顯示，與川芎內(nèi)酯0μmol∕L組比較，SW620細(xì)胞的川芎內(nèi)酯50、100μmol∕L組ALDH活性均降低（P<0.05），SW480細(xì)胞的川芎內(nèi)酯25、50、100μmol∕L組ALDH活性均降低（P<0.05）。

圖4-C1~C2結(jié)果顯示，與川芎內(nèi)酯0μmol∕L組比較，SW620細(xì)胞的川芎內(nèi)酯50、100μmol∕L組中Nanog、OCT4和SOX2表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05），SW480細(xì)胞的川芎內(nèi)酯25、50、100μmol∕L組Nanog、OCT4和SOX2表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05）。

圖4 川芎內(nèi)酯對結(jié)腸癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響Figure 4 Effect of ligustilide on the stem cell characteristics of colon cancer cells

2.5 川芎內(nèi)酯抑制裸鼠移植瘤生長及干細(xì)胞特性圖5結(jié)果顯示，與對照組比較，川芎內(nèi)酯5 mg∕kg組裸鼠腫瘤質(zhì)量和體積顯著減?。≒<0.05），瘤組織細(xì)胞凋亡率和p21陽性細(xì)胞比例明顯增加（P<0.05），SOX2陽性細(xì)胞比例明顯減?。≒<0.05），SOD活性顯著降低（P<0.05），MDA含量顯著升高（P<0.05）。

圖5 川芎內(nèi)酯對裸鼠移植瘤生長的影響Figure 5 Effect of ligustilide on growth of xenograft tumor in nude mice

3 討論

本研究選擇2株結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和SW480細(xì)胞株，探討川芎內(nèi)酯對其增殖、凋亡、線粒體功能和腫瘤干細(xì)胞的作用。

本研究使用不同劑量的川芎內(nèi)酯分別處理結(jié)腸癌SW620和SW480細(xì)胞，結(jié)果顯示，2種細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率均升高，且具有劑量依賴性。表明川芎內(nèi)酯具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用。

細(xì)胞凋亡是受諸多因子調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，亦是判斷藥物是否具有抗癌作用的主要指標(biāo)。線粒體是細(xì)胞生命活動的控制中心，細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。線粒體跨膜電位下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，一旦線粒體跨膜電位劇變，則細(xì)胞凋亡將不可逆[11]。本研究結(jié)果顯示，川芎內(nèi)酯分別處理結(jié)腸癌SW620和SW480細(xì)胞后，線粒體膜電位均明顯降低，表明川芎內(nèi)酯可使線粒體膜的通透性增加，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

p21為細(xì)胞周期蛋白抑制劑，可與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物結(jié)合，從而抑制它們的激酶活性并阻止細(xì)胞周期進(jìn)程，并通過p53途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。另外，線粒體外膜通透性是凋亡細(xì)胞死亡的關(guān)鍵事件，可使細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，以川芎內(nèi)酯分別處理結(jié)腸癌SW620和SW480細(xì)胞后，p21和cleaved Caspase-3表達(dá)均上調(diào)，表明川芎內(nèi)酯可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激引起的氧化損傷在凋亡中也起著至關(guān)重要的作用，可介導(dǎo)線粒體膜電位的改變[13]。脂質(zhì)過氧化最常研究的標(biāo)志物是MDA，抗氧化酶標(biāo)志物為SOD[14]。本研究結(jié)果顯示，川芎內(nèi)酯分別處理結(jié)腸癌SW620和SW480細(xì)胞后，MDA含量均降低，SOD含量均升高，表明川芎內(nèi)酯可明顯降低結(jié)腸癌細(xì)胞的抗氧化能力，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

大量研究表明，分化不良的癌細(xì)胞即癌癥干細(xì)胞（CSC）負(fù)責(zé)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[15]。ALDH的高酶活性是CSC標(biāo)志之一[16]。多種癌癥的體外和臨床證據(jù)支持了高ALDH表達(dá)與各種癌癥的CSC樣性質(zhì)之間的聯(lián)系[17]。干細(xì)胞基因OCT4、SOX2和Nanog為結(jié)直腸癌自我更新和成瘤能力的標(biāo)志物[18]。本研究結(jié)果顯示，川芎內(nèi)酯分別處理結(jié)腸癌SW620和SW480細(xì)胞后，結(jié)腸癌干細(xì)胞成球直徑大小均明顯減小，ALDH酶活性均降低，OCT4、SOX2和Nanog等多能性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)均下調(diào)。表明川芎內(nèi)酯通過抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖以防止癌癥惡化。

裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了川芎內(nèi)酯體內(nèi)抑制腫瘤生長的作用。

綜上所述，川芎內(nèi)酯在體內(nèi)、體外均可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長，主要通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、破壞線粒體功能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞特性阻止結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。上述研究表明，川芎內(nèi)酯有可能成為治療結(jié)腸癌的一種新藥物。