余雷， 楊云霜， 曹慧敏， 李延暉， 鄒夢(mèng)穎， 劉曉辰， 張蓉

（1.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心中醫(yī)與康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 100088；2.蘇州大學(xué)，江蘇蘇州 215000；3.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心醫(yī)研部，北京 100088）

隨著放射技術(shù)的高速發(fā)展，人們?cè)谙硎芩鼛?lái)豐富受益的同時(shí)也面臨著放射性損傷。長(zhǎng)期的放射暴露容易造成免疫損傷，引起炎癥反應(yīng)，炎性因子對(duì)臨近細(xì)胞造成影響，進(jìn)而又加劇機(jī)體組織損傷。白細(xì)胞介素（IL）6是重要的促炎因子，IL-10為多效抗炎細(xì)胞因子，它們的動(dòng)態(tài)變化反映了機(jī)體的炎癥水平及免疫狀態(tài)[1]。補(bǔ)腎解毒方為火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心醫(yī)研部張蓉博士自擬方劑，旨在研發(fā)出一種新型、低毒的放射防護(hù)劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該方能減輕放射后胸腺、脾等免疫器官損傷[2-3]。細(xì)胞因子是重要的炎癥介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子，因此，本研究觀察補(bǔ)腎解毒方對(duì)放射后小鼠血清IL-6、IL-10分泌水平的調(diào)控作用，同時(shí)觀察其對(duì)受損白細(xì)胞的保護(hù)作用，探討放射后補(bǔ)腎解毒方的抗炎抗損傷作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物72只SPF級(jí)C57BL∕10J小鼠，7~8周齡，體質(zhì)量（23±3）g，由南京大學(xué)生物醫(yī)藥研究院培育，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：[SCXK（蘇）2018-0008]。于北京師范大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，溫度25℃，濕度50%，提供正常光照條件，所有動(dòng)物均可自由進(jìn)水?dāng)z食。

1.2 藥物補(bǔ)腎解毒方，方劑組成：熟地黃10 g，牡丹皮10 g，山萸肉12 g，茯苓10 g，山藥10 g，冬蟲(chóng)夏草3 g，澤瀉10 g，白花蛇舌草10 g。由康仁堂藥業(yè)有限公司配制成中藥顆粒制劑。將顆粒制劑與生理鹽水混合后加熱，配制出濃度為1.38g∕mL的混懸液，以備灌胃。

1.3 輻射源60Coγ-輻射裝置，由北京師范大學(xué)提供，北京伽瑪高新有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：GM-11-03-A。

1.4 主要試劑與儀器IL-6酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（規(guī)格型號(hào)：96T，購(gòu)自北京瑞格博科技發(fā)展有限公司）；IL-10 ELISA試劑盒（規(guī)格型號(hào)：96T，購(gòu)自北京瑞格博科技發(fā)展有限公司）。Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）；CT15RT高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理方法將72只小鼠按隨機(jī)數(shù)表分為3組，即空白對(duì)照組、單純放射組、放射+中藥組，每組24只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開(kāi)始給藥。參照人體給藥劑量（13.5 g∕kg），按公式轉(zhuǎn)換為小鼠給藥劑量[4]。放射+中藥組每日予以補(bǔ)腎解毒方湯劑1.54 g∕mL灌胃0.2 mL，1次∕日，空白對(duì)照組和單純放射組給予等體積（0.2 mL）生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃第11天，除空白對(duì)照組外，其余小鼠全部接受與照射源同等距離的一次性4 Gy60Coγ-射線全身照射。照射后各組每日繼續(xù)灌胃至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，方法同前。共灌胃25 d。并于照射后第1、7、14天取材，每組隨機(jī)抽取8只，稱其體質(zhì)量，并眼球取血處死，分離血清。

1.6 血清IL-6、IL-10水平測(cè)定收集血液上清，采用ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算出小鼠血清IL-6、IL-10水平。

1.7 血清白細(xì)胞數(shù)應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism 5.0軟件，數(shù)據(jù)描述使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），3組間比較采用兩因素方差分析，兩兩比較使用Tukey法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較小鼠在照射后一般情況均較照射前差，具體表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕、活躍度下降、精神狀態(tài)不佳、皮毛光澤度下降，尤其單純放射組程度更甚，5只小鼠出現(xiàn)毛發(fā)塊狀脫落的癥狀。

2.2 各組小鼠照射后體質(zhì)量變化比較表1結(jié)果顯示：照射后第1天，小鼠體質(zhì)量各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；照射后第7天，單純放射組小鼠體質(zhì)量低于空白對(duì)照組和放射+中藥組（P<0.05或P<0.01）；照射后第14天，單純放射組小鼠體質(zhì)量低于空白對(duì)照組（P<0.01），放射+中藥組小鼠體質(zhì)量與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化比較Table 1 Comparison of body mass changes of mice in various groups （±s，g）

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化比較Table 1 Comparison of body mass changes of mice in various groups （±s，g）

①P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較；②P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)單純放射組比較

組別空白對(duì)照組單純放射組放射+中藥組照射后第14天26.07±1.27 23.19±1.52①24.67±1.65鼠數(shù)（只）888照射后第1天24.29±1.96 23.58±1.26 23.91±1.44照射后第7天25.32±2.24 21.98±1.75①24.09±1.73②

2.3 各組小鼠照射后血清IL-6水平比較表2結(jié)果顯示：照射后第1天，單純放射組血清IL-6水平高于空白對(duì)照組（P<0.01），放射+中藥組血清IL-6水平低于單純放射組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；照射后第7、14天，單純放射組血清IL-6水平高于空白對(duì)照組和放射+中藥組（P<0.01），而放射+中藥組血清IL-6水平與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各組小鼠血清IL-6水平比較Table 2 Comparison of serum IL-6 Level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

表2 各組小鼠血清IL-6水平比較Table 2 Comparison of serum IL-6 Level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

①P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較；②P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)單純放射組比較

組別空白對(duì)照組單純放射組放射+中藥組照射后第14天21.68±1.77 32.14±3.92①22.15±3.02②鼠數(shù)（只）888照射后第1天21.95±2.63 28.21±4.53①24.94±2.98照射后第7天22.14±2.8 32.22±4.33①24.71±2.88②

2.4 各組小鼠照射后血清IL-10水平比較表3結(jié)果顯示：照射后第1、14天，3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；照射后第7天，放射+中藥組IL-10水平高于空白對(duì)照組（P<0.01）。

表3 各組小鼠血清IL-10水平比較Table 3 Comparison of serum IL-10 level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

表3 各組小鼠血清IL-10水平比較Table 3 Comparison of serum IL-10 level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

①P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較

組別空白對(duì)照組單純放射組放射+中藥組照射后第14天101.33±6.59 110.37±8.47 111.68±9.71鼠數(shù)（只）888照射后第1天101.53±9.33 107.93±5.77 110.19±10.28照射后第7天102.11±7.97 108.37±9.28 113.55±9.87①

2.5 各組小鼠照射后外周血白細(xì)胞水平比較表4結(jié)果顯示：照射后第1、7天，單純放射組和放射+中藥組白細(xì)胞水平低于空白對(duì)照組（P<0.01），放射+中藥組白細(xì)胞水平高于單純放射組（P<0.05或P<0.01），與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；照射后第14天，單純放射組白細(xì)胞水平低于空白對(duì)照組（P<0.01），放射+中藥組白細(xì)胞水平高于單純放射組，與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表4 各組小鼠外周血白細(xì)胞水平比較Table 4 Comparison of serum leukocyte level of mice in various groups（±s，×109個(gè)·L-1）

表4 各組小鼠外周血白細(xì)胞水平比較Table 4 Comparison of serum leukocyte level of mice in various groups（±s，×109個(gè)·L-1）

①P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較；②P<0.05，③P<0.01，與同時(shí)間點(diǎn)單純放射組比較

組別空白對(duì)照組單純放射組放射+中藥組照射后第14天10.01±0.89 8.73±0.65①9.42±0.83鼠數(shù)（只）888照射后第1天10.07±0.87 6.52±0.75①7.67±0.72①②照射后第7天9.94±0.87 7.24±0.71①8.61±0.70①③

3 討論

長(zhǎng)期暴露于中低劑量射線中引起的健康問(wèn)題一直備受關(guān)注。在醫(yī)療領(lǐng)域，中西醫(yī)結(jié)合治療疾病的手段越來(lái)越多地在臨床中應(yīng)用，尤其在腫瘤治療方面，化療患者都經(jīng)受著不同程度的放射后遺癥。中藥能有效降低化療后副作用，減輕炎癥反應(yīng)[5]，彌補(bǔ)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不足。目前，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用中藥治療放射損傷越來(lái)越受到重視，而控制感染成為抗放射損傷的首要環(huán)節(jié)。

IL-6由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生[6]，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，是機(jī)體發(fā)生感染的重要指標(biāo)[7]。本研究結(jié)果顯示，照射后第1天，單純放射組IL-6水平高于空白對(duì)照組，而放射+中藥與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異，表明照射初期，補(bǔ)腎解毒方即發(fā)揮了放射防護(hù)效應(yīng)，通過(guò)抑制IL-6水平的升高減輕了機(jī)體炎性反應(yīng)。Geginat和Jiang等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)，急性炎癥期血清IL-6水平比CRP上升更早，是判斷炎癥程度及預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，單純放射組IL-6水平在照射后第1天顯著升高，與這一發(fā)現(xiàn)相符。照射后第7、14天，單純放射組高于空白對(duì)照組和放射+中藥組，表明照射后服用中藥，機(jī)體能繼續(xù)發(fā)揮抗感染作用，而單純放射組IL-6水平無(wú)降低趨勢(shì)，說(shuō)明照射中后期，機(jī)體仍處于較活躍的炎癥狀態(tài)，自身修復(fù)機(jī)能難以遏制感染的發(fā)展，因此，放射后出現(xiàn)感染狀態(tài)需人為進(jìn)行藥物干預(yù)，防止促炎因子過(guò)度表達(dá)爆發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]，同時(shí)這一現(xiàn)象也證實(shí)了研發(fā)高效中藥防護(hù)劑的重要性。

IL-10主要由輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）2細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)調(diào)節(jié)Th1∕Th2細(xì)胞平衡[11]，抑制促炎因子合成釋放，促炎因子與抑炎因子相互作用，維持體內(nèi)炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)平衡[12]。本研究結(jié)果顯示，照射后第7天，放射+中藥組IL-10水平高于空白對(duì)照組和單純放射組，表明補(bǔ)腎解毒方通過(guò)上調(diào)IL-10水平，抑制促炎因子釋放而發(fā)揮抗炎作用，照射后單純放射組IL-10水平升高，但與空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮到放射后炎性因子增加，IL-10作為主要的抑炎因子必然隨之增加。白細(xì)胞通常也被稱為免疫細(xì)胞，是外周血非常重要的一類細(xì)胞，在機(jī)體中擔(dān)負(fù)許多重任，包括吞噬異物并產(chǎn)生抗體，抵御病原體入侵等，它對(duì)射線敏感，接受輻射后白細(xì)胞水平會(huì)迅速下降。本研究結(jié)果顯示，放射+中藥組白細(xì)胞水平高于單純放射組，表明中藥有效減輕了放射所致白細(xì)胞減少，從而發(fā)揮免疫防護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)是照射后最常見(jiàn)的癥狀[13]，炎性因子對(duì)臨近細(xì)胞造成影響，進(jìn)而又加劇機(jī)體組織損傷，中醫(yī)藥在治療感染方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。放射從中醫(yī)學(xué)角度可稱之為“火毒之邪”，易耗津傷陰，最損腎中真陰[14]。補(bǔ)腎解毒方由滋補(bǔ)腎陰基礎(chǔ)方六味地黃丸化裁而來(lái)。現(xiàn)代研究已證實(shí)，六味地黃丸具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤的作用[15]。加入白花蛇舌草以清熱解毒，可發(fā)揮抗感染免疫功能[16]。加入冬蟲(chóng)夏草以補(bǔ)肺益腎，Jing Y等[17-18]發(fā)現(xiàn)它的有效成分蟲(chóng)草多糖能激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，增強(qiáng)非特異性免疫。針對(duì)放射的“火熱”之性，諸藥合用擬成的補(bǔ)腎解毒方，可共奏扶正祛邪之功。

綜上所述，補(bǔ)腎解毒方通過(guò)抑制放射后IL-6分泌水平，提升IL-10水平，并減輕放射所致白細(xì)胞數(shù)減少，發(fā)揮抗炎抗損傷作用。促炎因子與抑炎因子的動(dòng)態(tài)水平變化發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)作用[19]，其中IL-6和IL-10是它們的典型代表，補(bǔ)腎解毒方是否還能通過(guò)其他細(xì)胞因子發(fā)揮放射防護(hù)作用，需進(jìn)一步探討。