梁霄， 王盼， 李濤， 牛昭， 陳婧

（1.保定市第二醫(yī)院腎內(nèi)科風(fēng)濕免疫科，河北保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，河北保定 071030；3.保定市第二醫(yī)院檢驗科，河北保定 071000；4.保定市第二中心醫(yī)院腫瘤科，河北保定 071000）

糖尿病腎病是全球范圍內(nèi)終末期腎衰竭發(fā)生的主要原因[1-2]。與糖尿病腎病相關(guān)的特征性功能和結(jié)構(gòu)異常包括蛋白尿、腎小球瘢痕化、腎間質(zhì)纖維化以及腎臟功能持續(xù)下降[3-4]。對抗腎纖維化是減輕糖尿病腎病的內(nèi)在機制[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，大車前苷可以抑制高糖誘導(dǎo)的腎系膜細胞的炎癥、氧化應(yīng)激和細胞外基質(zhì)累積[6]，對鎘處理大鼠的腎臟有保護作用[7]。但體內(nèi)大車前苷對糖尿病腎病的影響及機制尚不清楚。因此，本研究探討了大車前苷對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎功能和病理的影響及機制，以期為糖尿病腎病的臨床治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物新生的SD大鼠36只，雌雄各半，懷孕1周的SPF母鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）2016-0006。SPF實驗動物飼養(yǎng)室溫度控制在21℃左右、濕度控制在55%左右，光照∕黑暗周期為12 h。大鼠在實驗前均予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。該實驗方案已經(jīng)保定市第二醫(yī)院動物倫理委員會審批，符合動物倫理原則。

1.2 藥物與試劑大車前苷[分子式為C29H36O16，分子量：640.59，高效液相色譜（HLPC）≥98.0%]購自上海吉至生化科技有限公司，批號：104777-68-6；二甲雙胍（Melbine，HLPC≥97.0%）購自江順化工科技有限公司，批號：1115-70-4。鏈脲佐菌素（STZ，HLPC≥98.0%）購自北京賽因百奧生物技術(shù)有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑購自索萊寶科技有限公司；丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）等檢測試劑盒均購自上海江萊生物科研試劑有限公司；放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解緩沖液（南京?？藸柹锟萍加邢薰荆?；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（上海易色醫(yī)療科技有限公司）；兔來源的TGF-β、α-SMA、E-cadherin、Smad3、Smad2、Smad7等單克隆抗體和山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）單克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.3 儀器Urtest-500B尿液分析儀，購自桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子銷售有限公司；MuLTI?SKANGO型全自動酶標儀，購自美國Thermo公司；HCC400全自動生化分析儀，購自山東國康生物科技有限公司；FluorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)，購自美國Proteinsimple公司。

1.4 分組、模型構(gòu)建與給藥處理將新生大鼠隨機分為正常組，模型組，大車前苷低、中、高劑量組，二甲雙胍組，每組6只。模型組，大車前苷低、中、高劑量組，二甲雙胍組大鼠出生第2天給予腹膜內(nèi)單次注射STZ 50 mg∕kg復(fù)制糖尿病模型[8]，正常組給予腹腔注射等量0.1 mol∕L檸檬酸鹽緩沖液。第8周后，大鼠斷奶并測定血糖水平，血糖高于250 mg∕dL即可判斷為造模成功[9]。大鼠再飼養(yǎng)4周后，大車前苷低、中、高劑量組大鼠分別對應(yīng)灌胃大車前苷10、20、40 mg·kg-1·d-1[7]，二甲雙胍組灌胃二甲雙胍25 mg·kg-1·d-1[10]，持續(xù)4周，即第12~16周。實驗最后1天，收集24 h尿液，麻醉后收集血液樣本和腎組織。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 血液生化分析經(jīng)大鼠眼眶采集血液，分離血清。應(yīng)用全自動生化分析儀檢測大鼠血糖含量及總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、胰島素、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）水平。

1.5.2 尿液生化分析第16周實驗結(jié)束最后1天，收集24 h尿液，應(yīng)用尿液分析儀檢測尿蛋白（PRO）、尿潛血（BLO）和尿膽紅素（BIL）的含量。

1.5.3 HE染色法觀察腎臟病理變化將腎組織用40 g∕L多聚甲醛溶液固定后，常規(guī)脫水制成石蠟切片。然后進行脫蠟、蘇木素染色、1%鹽酸酒精分化、0.6%氨水返藍、0.5%伊紅染色、常規(guī)脫水、二甲苯透明等步驟，最后以中性樹膠封片。于400倍顯微鏡下觀察腎損傷情況。

1.5.4 腎組織MDA、GSH、GPx、GST、SOD檢測將腎組織勻漿，收集上清液。按照試劑盒說明書檢測MDA、GSH、GPx、GST、SOD水平。

1.5.5 免疫組織化學(xué)法檢測腎組織TGF-β表達將腎組織石蠟切片常規(guī)脫蠟，用過氧化物酶阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，再加入TGF-β抗體（1∶800稀釋）4℃孵育過夜，然后滴加生物素標記的二抗，以3，3’-二氨基聯(lián)苯胺DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后封片觀察。實驗均采用刪除第一抗體作陰性對照。TGF-β表達陽性則呈棕色顆粒狀，應(yīng)用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)軟件計算陽性指數(shù)（PI）。

1.5.6 蛋白免疫印跡法檢測腎組織α-SMA、E-cadherin、TGF-β、Smad2、Smad3和Smad7蛋白表達將腎組織剪碎，用RIPA裂解液勻漿提取總蛋白，然后用BCA試劑盒定量蛋白的濃度。將蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，再用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，室溫下于脫脂牛奶中封閉蛋白2 h。分別加入一抗稀釋液α-SMA（1∶1 000）、E-cadherin（1∶800）、TGF-β（1∶1 000）、Smad2（1∶1 500）、Smad3（1∶1 500）、Smad7（1∶1 500）4℃封閉過夜。再加入對應(yīng)辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆IgG二抗稀釋液（1∶2 000）室溫封閉1 h，最后滴增強化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑曝光、顯影。以GAPDH為內(nèi)參，使用ImagePro Plus 6.0軟件分析蛋白條帶積分吸光度值，結(jié)果以目標蛋白積分吸光度值∕內(nèi)參蛋白積分吸光度值表示。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗發(fā)現(xiàn)符合呈正態(tài)分布，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血液生化指標比較與正常組比較，模型組大鼠血糖含量及TC、TG、BUN、SCr水平均顯著升高（P<0.01），而胰島素、TP和ALB水平均顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，大車前苷低劑量組大鼠血糖含量及TC、TG、胰島素、TP、ALB、BUN、SCr水平均無明顯變化，大車前苷中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠血糖含量及TC、TG、BUN、SCr水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），而胰島素、TP和ALB水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。具體結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠血液生化指標比較Figure 1 Comparison of blood biochemical parameters in rats of various groups

2.2 各組大鼠尿液中PRO、BLO和BIL含量的比較與正常組比較，模型組大鼠尿液中PRO、BLO和BIL含量均顯著增多（P<0.01）；與模型組比較，大車前苷低劑量組大鼠尿液中PRO、BLO和BIL含量均無明顯變化，大車前苷中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠尿液中PRO、BLO和BIL含量均顯著減少（P<0.05或P<0.01）。具體結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠尿液中PRO、BLO和BIL含量的比較Figure 2 Comparison of PRO，BLO and BIL levels in urine of rats in various groups

2.3 各組大鼠腎組織病理變化的比較正常組大鼠腎小管和腎小球形狀規(guī)則，未觀察到增生性腎小球基底膜。模型組腎小球系膜增生明顯，腎小球基底膜增厚，腎小球包膜收縮，毛細血管堵塞，腎纖維化明顯。大車前苷中、高劑量和二甲雙胍組大鼠腎組織病理損傷明顯減輕，大車前苷低劑量組改善不明顯。具體結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠腎組織病理變化比較（HE染色法，×400）Figure 3 Comparison of pathological changes of renal tissue of rats in various groups（by HE staining method，×400）

2.4 各組大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平的比較與正常組比較，模型組大鼠腎組織MDA水平顯著升高（P<0.01），GSH、GPx、GST和SOD水平均顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，大車前苷低劑量組大鼠腎組織MDA、GSH、GPx、GST和SOD水平均無明顯變化，大車前苷中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織MDA水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），GSH、GPx、GST和SOD水平均顯著升高（P<0.05，P<0.01）。具體結(jié)果見圖4。

圖4 各組大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平的比較Figure 4 Comparison of oxidative stress levels in renal tissue of rats in various groups

2.5 各組大鼠腎組織TGF-β、E-cadherin和α-SMA表達比較與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β的PI值顯著升高（P<0.01），E-cadherin表達水平顯著下調(diào)（P<0.01），α-SMA表達水平均顯著上調(diào)（P<0.01）；與模型組比較，大車前苷低劑量組大鼠腎組織TGF-β的PI值、E-cadherin和α-SMA表達水平均無明顯變化，大車前苷中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織TGF-β的PI值顯著降低（P<0.05或P<0.01），E-cadherin表達水平顯著上調(diào)（P<0.05或P<0.01），α-SMA表達水平均顯著下調(diào)（P<0.05或P<0.01）。具體結(jié)果見圖5。

圖5 各組大鼠腎組織TGF-β、E-cadherin和α-SMA表達比較Figure 5 Comparison of expression of TGF-β，E-cadherin andα-SMA in renal tissue of rats in various groups

2.6 各組大鼠腎組織TGF-β、Smad2、Smad3和Smad7表達比較與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β、Smad2和Smad3表達水平顯著上調(diào)（P<0.01），Smad7表達水平均顯著下調(diào)（P<0.01）；與模型組比較，大車前苷低劑量組大鼠腎組織TGF-β、Smad2、Smad3和Smad7表達水平均無明顯變化，大車前苷中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織TGF-β、Smad2和Smad3表達水平顯著下調(diào)（P<0.05或P<0.01），Smad7表達水平均顯著上調(diào)（P<0.05或P<0.01）。具體結(jié)果見圖6。

圖6 各組大鼠腎組織TGF-β、Smad2、Smad3和Smad7表達比較Figure 6 Comparison of expressions of TGF-β，Smad2，Smad3 and Smad7 in renal tissue of rats in various groups

3 討論

常用中藥車前草為車前科植物車前Plantago asiaticaL.或平車前Plantago depressaWilld.的干燥全草。味甘，性寒。歸肝、脾經(jīng)，具有清熱利尿、祛痰、涼血、解毒等功效，用于治療水腫、熱淋澀痛、暑濕瀉痢、吐血衄血、癰腫瘡毒等病癥。大車前苷為車前草的專屬成分。本研究結(jié)果顯示，大車前苷可顯著降低糖尿病大鼠血糖含量及TC、TG、BUN、SCr水平，升高胰島素、TP和ALB水平，減少尿液中PRO、BLO和BIL含量，減輕腎組織病理損傷。表明大車前苷可以改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠病情，減輕糖尿病相關(guān)腎損傷，與二甲雙胍療效相當(dāng)。

細胞外基質(zhì)的異常累積，正是腎纖維化的主要特點[11]。α-SMA被認為是肌成纖維細胞的標志，與腎纖維化程度及腎臟疾病的進展呈正相關(guān)[12]。E-cadherin是腎小管上皮細胞的標記物，在細胞連接和極化中發(fā)揮重要作用，也是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標志蛋白，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致細胞外基質(zhì)生成的重要環(huán)節(jié)[13]。本研究結(jié)果顯示，大車前苷可上調(diào)糖尿病大鼠腎組織E-cadherin表達水平，下調(diào)α-SMA表達水平，表明大車前苷可減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化程度。

TGF-β可啟動經(jīng)典和非經(jīng)典途徑發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。TGF-β被確定為腎纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)，它是一種纖維原性細胞因子，通過激活其下游介體Smad2和Smad3活性介導(dǎo)腎纖維化[14]。其中，Smad信號被公認為是TGF-β信號在進行性腎纖維化中的主要通路[15]。TGF-β1在結(jié)合其受體后通過磷酸化激活其下游介質(zhì)Smad2和Smad3發(fā)揮其生物學(xué)作用。此外，活化的Smad2∕3與常見的Smad4形成異源復(fù)合物，并易位進入細胞核以結(jié)合并調(diào)節(jié)靶基因的表達[16]。在纖維形成的過程中，Smad3被高度激活，這與通過泛素E3連接酶依賴性降解機制下調(diào)抑制性Smad7有關(guān)[17]。Smad3和Smad7之間的平衡偏移導(dǎo)致肌成纖維細胞蓄積和活化，使細胞外基質(zhì)過度生成，加劇腎纖維化[18]。另外，持續(xù)性糖尿病相關(guān)代謝和血液動力學(xué)擾動引起的腎臟炎癥及相關(guān)修復(fù)反應(yīng)，激活諸如Smad3等纖維化促進蛋白，可最終導(dǎo)致腎纖維化[15]。本研究結(jié)果顯示，大車前苷能夠上調(diào)STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎組織Smad7，下調(diào)TGF-β、Smad2和Smad3表達，與腎纖維化減輕趨勢一致。因此，我們推測大車前苷可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β∕Smad信號通路來減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化。

糖尿病腎病是由高血糖狀態(tài)和晚期糖基化終末產(chǎn)物在腎臟的積累引起的，氧化應(yīng)激是糖尿病腎病的觸發(fā)因素。有研究發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖刺激的腎小管上皮細胞，產(chǎn)生活性氧簇（ROS），促進TGF-β1表達增強，最終導(dǎo)致腎纖維化[13]。發(fā)生糖尿病時，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，可誘導(dǎo)腎組織細胞凋亡損傷，使其成為糖尿病腎病進展的主要潛在機制[19]。本研究結(jié)果顯示，大車前苷可降低糖尿病大鼠腎組織脂質(zhì)過氧化物MDA水平，升高抗氧化酶GSH、GPx、GST和SOD水平，表明大車前苷可抑制糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕腎纖維化程度。

綜上所述，大車前苷可減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟損傷和纖維化，其機制可能與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)和TGF-β∕Smad信號通路有關(guān)。