夏士濤， 王培宇， 張開(kāi)創(chuàng)， 魏靜

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院外三科，黑龍江哈爾濱 150040）

慢性硬膜下血腫（chronic subdural hematoma，CSDH）是最常見(jiàn)的一種繼發(fā)性顱腦損傷。有報(bào)道，顱腦創(chuàng)傷為CSDH發(fā)生的主要因素，但肝腎功能不全、老年癡呆、代謝性疾病、抗凝藥物應(yīng)用等均亦可引起CSDH[1]。目前，以鉆孔引流為主的手術(shù)憑借其快捷、安全、方便等優(yōu)點(diǎn)成為CSDH的首選療法，但術(shù)后死亡率、致殘率和復(fù)發(fā)率居高不下，且患者術(shù)后容易并發(fā)感染、腦水腫、器官功能不全等，死亡率高。因此，有必要開(kāi)發(fā)安全、有效的CSDH治療新策略，以改善CSDH患者的預(yù)后。海風(fēng)藤是胡椒科胡椒屬植物海風(fēng)藤Piper kadsura（Choisy）Ohwi的干燥藤莖，味辛、苦，性微溫，入肝經(jīng)，有祛風(fēng)、止痛、通絡(luò)等功效，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[2]。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，海風(fēng)藤醇提物對(duì)CSDH有明顯的療效。故本研究以海風(fēng)藤醇提物為研究藥物，以阿托伐他汀鈣為陽(yáng)性對(duì)照藥[3-4]，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析其對(duì)CSDH的治療作用及其可能機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供借鑒，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，7周齡，體質(zhì)量260~270 g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫22~24℃，相對(duì)濕度40%~60%，自然光照，自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)方案滿足一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則，已通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批號(hào)：20190511。

1.2 藥物及制備海風(fēng)藤，由湖北省青山中藥材公司生產(chǎn)提供，批號(hào)：20191204，已經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院陳家春教授鑒定。制備方法：取海風(fēng)藤7 kg，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，混合提取液，獲得乙醇提取物。回收乙醇，浸膏加水混懸，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，蒸干得到正丁醇377.37 g，以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成7.72、15.44、30.88 mg∕kg海風(fēng)藤醇提物溶液。阿托伐他汀鈣片，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：20 mg，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20051408。

1.3 試劑與儀器CMC-Na（濟(jì)寧市貝諾克生物科技有限公司生產(chǎn)）；白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-8酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海臻科生物科技有限公司）；凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶時(shí)間（TT）、纖維蛋白原（FIB）檢測(cè)試劑盒（上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司）；小鼠抗大鼠CD31抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗大鼠缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5、GAPDH等抗體（海雅吉生物科技有限公司）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的免疫球蛋白（IgG）抗體（北京博爾西科技有限公司）。CA-7000全自動(dòng)血凝分析儀（日本Sysmex公司）；M型小動(dòng)物核磁共振成像系統(tǒng)（ASPECT Imaging公司）；680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；BH2顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 造模與分組抽取50只大鼠采用自體血反復(fù)多次顱內(nèi)灌注法建立慢性硬膜下血腫模型[5]：麻醉大鼠，以俯臥位固定在立體定向架上，在額頂葉中心取切口，暴露顱骨，磨出直徑為1 mm的骨窗，在硬腦膜上剪開(kāi)直徑為1 mm的十字切口。用無(wú)菌BD注射器取大鼠尾靜脈血700μL，注入于硬膜下腔，先以30μL∕min速度注血10 min，再以10μL∕min速度注血10 min。首次注血72 h后，再次取500μL自體血，劃開(kāi)愈合的硬腦膜切口，再次注血，先以20μL∕min速度注血10 min，再以10μL∕min注血10 min。造模大鼠首次注血后第24天用MRI掃描大鼠頭部，血腫形成表示造模成功。共40只大鼠造模成功，將其隨機(jī)分為模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組，每組各10只。剩余10只作為假手術(shù)組，其造模方法同上，但不注射自體血。

1.5 干預(yù)方法陽(yáng)性對(duì)照組造模成功后次日灌胃126 mg∕kg阿托伐他汀鈣（以生理鹽水配制成溶液），海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組同一時(shí)間分別灌胃15.44、30.88 mg∕kg海風(fēng)藤醇提物溶液[6]，模型組、假手術(shù)組亦同一時(shí)間灌胃等體積CMC-Na溶液。1次∕d，連續(xù)給藥14 d。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 大鼠腦血腫體積測(cè)定末次給藥后1 h，麻醉大鼠，將其置于MRI掃描專(zhuān)用線圈內(nèi)，進(jìn)行T2WI序列冠狀位掃描，層厚1 mm。選擇體積最大血腫的最大斷層截面，用核磁工作站軟件Volume Viewer 4.3測(cè)量血腫的橫、縱徑，計(jì)算血腫體積（mm3）。

1.6.2 ELISA法檢測(cè)大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-8含量MRI掃描后，腹主動(dòng)脈采血，低溫離心取血清。參考IL-6、IL-8 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清IL-6、IL-8水平，操作如下：在酶標(biāo)包被板上設(shè)置空白孔、樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔，加樣后稀釋?zhuān)瑴赜?，洗滌，加入酶?biāo)試劑，顯色，終止，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光密度值，計(jì)算各樣本濃度值。

1.6.3 凝固法檢測(cè)血漿凝血功能指標(biāo)取血漿用全自動(dòng)血凝分析儀檢測(cè)，嚴(yán)格參考PT、TT、FIB試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用凝固法檢測(cè)血漿PT、TT、FIB含量，即將血漿樣本試管編號(hào)，根據(jù)儀器操作流程檢驗(yàn)，將結(jié)果自動(dòng)傳輸?shù)接?jì)算機(jī)上，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果。

1.6.4 CD31免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠血腫包膜新生血管麻醉后處死大鼠，快速分離顱骨，獲得腦組織，取注血側(cè)的腦組織液氮冷凍，另一部分腦組織用冰凍組織切片包埋劑包埋腦組織，制作冠狀位連續(xù)切片（厚8μm），進(jìn)行CD31血管免疫組織化學(xué)染色：將冰凍切片用甲醇固定，用小牛血清封閉，滴加小鼠抗大鼠CD31一抗（稀釋1∶100），4℃過(guò)夜，取出滴加HRP標(biāo)記的IgG二抗（稀釋1∶1 200），37℃溫箱孵育20 min。DAB顯色，鏡下觀察顯色情況，蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，鹽水酒精分化，1%氨水返藍(lán)，脫水封片。以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照，其余操作同上。隨機(jī)選取5個(gè)血管密集區(qū)，顯微鏡（400倍）下計(jì)數(shù)單個(gè)條索狀CD31陽(yáng)性血管內(nèi)皮細(xì)胞與彼此分離的血管簇?cái)?shù)目，計(jì)算平均值，轉(zhuǎn)化為包膜血管密度（MVD）。

1.6.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)大鼠腦組織HIF-1α、Claudin-5蛋白表達(dá)水平取液氮冷凍腦組織，放射免疫沉淀分析（RIPA）細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，離心取上清。二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白質(zhì)，沸水浴變性，上樣，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉。分別加入一抗稀釋液HIF-1α（1∶800）、Claudin-5（1∶600）、VEGF（1∶800）、GAPDH（1∶600）孵育過(guò)夜，次日加入HRP標(biāo)記的IgG二抗（1∶2 000）室溫孵育0.5 h。加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑顯色，用Image J軟件分析目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦血腫體積以MRI觀測(cè)結(jié)果計(jì)算血腫體積，假手術(shù)組大鼠無(wú)顱內(nèi)血腫不做統(tǒng)計(jì)。與模型組比較，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血腫體積縮?。≒＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組血腫體積增大（P＜0.05）；與海風(fēng)藤醇提物低劑量組比較，高劑量組大鼠血腫體積較小（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組大鼠腦血腫體積MRI結(jié)果比較Figure 1 Comparion of MRIresults of brain hematoma volume in various groups

表1 各組大鼠腦血腫體積比較Table 1 Comparison of brain hematoma volume of rats in various groups （±s，mm3）

表1 各組大鼠腦血腫體積比較Table 1 Comparison of brain hematoma volume of rats in various groups （±s，mm3）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較；③P＜0.05，與海風(fēng)藤醇提物低劑量組比較

血腫體積604.33±23.78 166.69±18.42①415.59±20.25①②241.79±19.47①②③組別模型組陽(yáng)性對(duì)照組海風(fēng)藤醇提物低劑量組海風(fēng)藤醇提物高劑量組鼠數(shù)（只）10 10 10 10

2.2 大鼠血清炎癥因子與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-8水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組大鼠血清IL-6、IL-8水平降低（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組大鼠血清IL-6、IL-8水平均升高（P＜0.05）；與海風(fēng)藤醇提物低劑量組比較，高劑量組大鼠血清IL-6、IL-8水平均降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清IL-6、IL-8水平比較Table 2 Comparison of serum IL-6 and IL-8 levels of rats in various groups （±s，pg·mL-1）

表2 各組大鼠血清IL-6、IL-8水平比較Table 2 Comparison of serum IL-6 and IL-8 levels of rats in various groups （±s，pg·mL-1）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較；④P＜0.05，與海風(fēng)藤醇提物低劑量組比較

IL-8 49.87±3.41 255.15±14.46①92.16±4.66①②211.42±10.58①②③143.15±8.42①②③④組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組海風(fēng)藤醇提物低劑量組海風(fēng)藤醇提物高劑量組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 IL-6 51.66±3.14 249.44±15.69①97.42±5.91①②198.63±10.36①②③147.84±7.59①②③④

2.3 大鼠血漿凝血功能與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿PT、FIB含量降低，TT含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組大鼠血漿PT、FIB含量降低，TT含量升高（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組大鼠血漿PT、FIB含量降低，TT含量升高（P＜0.05）；與海風(fēng)藤醇提物低劑量組比較，高劑量組大鼠血漿PT、FIB含量升高，TT含量降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血漿PT、TT、FIB含量比較Table 3 Comparison of plasma PT，TT，F(xiàn)IB levels of rats in various groups （±s）

表3 各組大鼠血漿PT、TT、FIB含量比較Table 3 Comparison of plasma PT，TT，F(xiàn)IB levels of rats in various groups （±s）

FIB（μg·mL-1）1.34±0.17 0.71±0.11①1.20±0.12①②0.98±0.12①②③1.07±0.13①②③④組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組海風(fēng)藤醇提物低劑量組海風(fēng)藤醇提物高劑量組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 PT（pg·mL-1）99.15±5.42 60.31±2.34①87.66±2.48①②71.32±1.45①②③80.63±2.16①②③④TT（pg·mL-1）62.66±7.61 87.41±6.28①68.41±2.54①②80.69±4.12①②③74.36±3.69①②③④

2.4 大鼠血腫包膜MVDCD31為血管內(nèi)皮標(biāo)記，可作為血腫包膜MVD觀察指標(biāo)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組血腫包膜MVD增大（P＜0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組血腫包膜MVD數(shù)減?。≒＜0.05）；與海風(fēng)藤醇提物低劑量組比較，高劑量組血腫包膜MVD較高（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4、圖2。

圖2 各組大鼠腦組織CD31陽(yáng)性細(xì)胞分布比較（免疫組化染色法，×400）Figure 2 Comparison of distribution of CD31 positive cells in brain tissue of rats in various groups（by immunohistochemical staining，×400）

表4 各組大鼠腦血腫包膜MVD比較Table 4 Comparison of the MVD in the brain hematoma capsule of rats in various groups （±s，條）

表4 各組大鼠腦血腫包膜MVD比較Table 4 Comparison of the MVD in the brain hematoma capsule of rats in various groups （±s，條）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較；③P＜0.05，與海風(fēng)藤醇提物低劑量組比較

MVD 9.31±0.78 69.61±5.14①15.69±1.91①②50.85±2.75①②③組別模型組陽(yáng)性對(duì)照組海風(fēng)藤醇提物低劑量組海風(fēng)藤醇提物高劑量組鼠數(shù)（只）10 10 10 10

2.5 大鼠腦組織HIF-1α信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織HIF-1α蛋白表達(dá)水平升高、Claudin-5蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組HIF-1α蛋白表達(dá)水平降低、Claudin-5蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與海風(fēng)藤醇提物低劑量組比較，高劑量組HIF-1α蛋白表達(dá)水平降低、Claudin-5蛋白表達(dá)水平較高（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表5、圖3。

圖3 各組大鼠腦組織HIF-1α信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Figure 3 Electrophoretic diagram of HIF-1αsignaling pathway related proteins in rat brain tissue of various groups

表5 各組大鼠腦組織HIF-1α信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較Table 5 Comparison of HIF-1αsignaling pathway related proteins in brain tissue of rats in variou groups （±s）

表5 各組大鼠腦組織HIF-1α信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較Table 5 Comparison of HIF-1αsignaling pathway related proteins in brain tissue of rats in variou groups （±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與海風(fēng)藤醇提物低劑量組比較

Claudin-5 0.99±0.09 0.12±0.03①0.39±0.08①②0.75±0.09①②③組別假手術(shù)組模型組海風(fēng)藤醇提物低劑量組海風(fēng)藤醇提物高劑量組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 HIF-1α 0.52±0.11 1.25±0.18①0.84±0.13①②0.65±0.12①②③

3 討論

慢性硬膜下血腫（CSDH）作為一種慢性出血性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，往往因創(chuàng)傷性顱腦損傷，致硬腦膜與硬膜下腔處橋靜脈被撕裂，出血聚集在硬膜下腔，形成血腫。當(dāng)前，CSDH發(fā)病機(jī)制的研究尚在起始階段。Fan等[7]研究表明，炎癥、血管生成在CSDH發(fā)病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。故探索與CSDH發(fā)作相關(guān)的炎癥反應(yīng)、血管生成病理生理機(jī)制，開(kāi)發(fā)可改善CSDH預(yù)后的新藥有一定的臨床意義。既往張柯媛等[8]研究表明，海風(fēng)藤醇提物有抗炎作用，王偉等[9]報(bào)道其具有抗血小板聚集的作用。因此，本研究擬觀察海風(fēng)藤醇提物治療慢性硬膜下血腫的效果及其作用機(jī)制。本研究通過(guò)腦MRI觀察發(fā)現(xiàn)：與模型組比較，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組大鼠腦血腫體積減小，提示海風(fēng)藤醇提物可促進(jìn)腦血腫吸收，效果僅次于經(jīng)典西藥阿托伐他汀。PT是凝血機(jī)制中心環(huán)節(jié)，活化后可形成TT，TT為蛋白水解酶，可水解多種凝血因子，并直接作用于血液中FIB，誘發(fā)凝血、血腫生成。一般情況下，PT、TT、FIB處于動(dòng)態(tài)平衡中，CSDH發(fā)生后血漿PT活化生成TT，TT釋放大量毒性物質(zhì)、細(xì)胞因子，損傷血腦屏障，降低其通透性，導(dǎo)致凝血因子進(jìn)入血液循環(huán)，表現(xiàn)為T(mén)T升高、PT下降。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組大鼠血漿PT、FIB含量升高，TT含量降低。結(jié)合免疫組化染色結(jié)果顯示：與模型組比較，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組大鼠血腫包膜MVD增大。提示海風(fēng)藤醇提物可調(diào)節(jié)凝血指標(biāo)，促使血管形成，這可能是其促進(jìn)血腫吸收的原因之一。

Zhao等[10]報(bào)道，炎癥與CSDH密切相關(guān)。IL-6是一種生物學(xué)功能較多的內(nèi)源性促炎因子，可增加血管通透性，促進(jìn)血液滲出，是CSDH形成過(guò)程中關(guān)鍵的炎性反應(yīng)因子。IL-8不僅是炎癥反應(yīng)因子，還可作為趨化因子，促進(jìn)黏附因子吸引中性粒細(xì)胞并將其激活，強(qiáng)化血管內(nèi)皮細(xì)胞等遷移功能，與血管生成密切相關(guān)。CSDH持續(xù)擴(kuò)大的炎癥反應(yīng)是IL-6、IL-8等共同作用的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組大鼠IL-6、IL-8水平持續(xù)降低，提示海風(fēng)藤醇提物具有抗炎的功效。

CSDH發(fā)生后，凝聚在硬膜下腔的血塊壓迫皮質(zhì)，形成局部缺血缺氧環(huán)境，導(dǎo)致HIF-1α不斷累積。HIF-1α是多種信號(hào)通路的上游調(diào)控因子，也是哺乳動(dòng)物機(jī)體缺氧狀態(tài)下的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]。Lin等[12]研究表明，HIF-1α被激活后，可促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，并激活下游許多經(jīng)典靶基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）轉(zhuǎn)錄，上調(diào)VEGF表達(dá)。Horecka等[13]報(bào)道VEGF與基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）正相關(guān)。HIF-1α活化后上調(diào)VEGF，導(dǎo)致MMP-9表達(dá)升高，降解內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白Claudin-5，從而破壞血腦屏障。Berndt等[14]報(bào)道Claudin-5是形成血腦屏障緊密連接的主要分子元件，是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密鏈接中特異性蛋白，其表達(dá)下調(diào)可影響血腦屏障結(jié)構(gòu)完整性。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織HIF-1α表達(dá)上調(diào)，Claudin-5表達(dá)下調(diào)；與模型組比較，海風(fēng)藤醇提物低、高劑量組大鼠腦組織HIF-1α表達(dá)下調(diào)，Claudin-5表達(dá)上調(diào)，提示海風(fēng)藤醇提物可能通過(guò)降低血腫周?chē)M織缺氧生成的HIF-1α表達(dá)，降低下游產(chǎn)物MMP-9，從而上調(diào)Claudin-5表達(dá)，保持CSDH血腦屏障的完整性。

綜上所述，海風(fēng)藤醇提物可促進(jìn)CSDH吸收，調(diào)節(jié)凝血功能，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)HIF-1α信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。