李偉藝， 劉紅松， 高山瑛， 蘇志強

（漢中市人民醫(yī)院中醫(yī)康復科，陜西漢中 723000）

急性心肌梗死（AMI）是臨床常見的心血管疾病，通常會危及患者生命，已成為全球嚴重的公共衛(wèi)生問題[1-2]。AMI的病因復雜，與患者的生活方式、飲食習慣、遺傳因素、后天生存環(huán)境及機體病理生理狀態(tài)均密切相關(guān)[3]。發(fā)生AMI后，及時采用溶栓治療或經(jīng)皮冠脈介入治療是縮小心梗面積并改善臨床結(jié)果的最佳、也是最有效的策略；然而，當前的臨床數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)皮冠脈介入治療及二級預防性治療后，患者的發(fā)病率和死亡率依然較高，且在恢復缺血心肌血流的同時極可能帶來再灌注損傷，導致心肌細胞死亡。因此，尋找有效的AMI治療及預防方法和藥物至關(guān)重要[4-5]。AMI屬于中醫(yī)學“胸痹”的范疇，為本虛（氣虛、陽虛）標實（痰濁、血瘀）病癥。益氣活血療法常被用于中醫(yī)臨床治療冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病[6-7]。本研究中的益氣活血方由黃芪、當歸、川芎、丹參4味藥材組成，具有補氣活血功效。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血方治療AMI患者，能夠降低心肌損傷指標乳酸脫氫酶（LDH）、磷酸肌酸激酶（CK）、CK同工酶（CK-MB）的含量，提高左室射血分數(shù)。有研究表明，Wnt∕β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，該信號通路的表達情況影響著心肌細胞的增殖、凋亡及炎癥水平，抑制該信號轉(zhuǎn)導途徑的表達往往可取得較好的治療效果[8-9]。因此，本研究以Wnt∕β-catenin信號通路為切入點，觀察益氣活血方對AMI大鼠心功能和結(jié)構(gòu)的影響，探究其對AMI相關(guān)心肌損傷的修復作用及機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2016-0006]。實驗單位：陜西中醫(yī)藥大學實驗動物中心[SYXK（陜）2021-001]。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20~25℃，濕度50%~65%，光照∕黑暗12 h交替。

1.2 藥物、試劑與儀器益氣活血方（黃芪30 g、當歸12 g、川芎15 g、丹參15 g，中藥飲片購自漢中市人民醫(yī)院），由漢中市人民醫(yī)院藥劑科制備成1.6 g∕mL的濃縮水煎液，4℃冰箱保存。Wnt-C59[Wnt∕β-catenin信號通路抑制劑，阿拉丁試劑（上海）有限公司產(chǎn)品，貨號：SJ015EF497158]；蘇木素-伊紅（HE）、Masson及脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導的核苷酸（dUTP）缺口末端標記法（TUNEL）染色試劑盒（博士德生物有限公司）；LDH、CK、CK-MB試劑盒（南京建成生物工程研究所）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（RT-qPCR）預混液（美國Thermo Scientific公司）；引物（日本Takara公司合成）；Wnt3a、β-catenin、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、C-myc兔單抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。電泳儀，購自北京六一儀器廠；多普勒超聲儀，購自美國Beckman公司；IX53型顯微鏡，購自日本奧林巴斯；多功能凝膠成像系統(tǒng)，購自美國Syngene公司；酶標儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 分組與造模將60只大鼠按照隨機數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、中藥組、Wnt-C59組，每組15只。模型組、中藥組、Wnt-C59組大鼠按照文獻[10]方法，采用結(jié)扎冠狀動脈前降支法建立AMI模型，若心電圖可見Ⅱ?qū)?lián)ST段較手術(shù)前抬高0.2 mV以上即可認為造模成功。經(jīng)術(shù)后觀察，模型組、中藥組、Wnt-C59組大鼠各有14只、15只和14只造模成功。假手術(shù)組大鼠僅打開胸腔后縫合。各組大鼠均在造模后肌注4萬U青霉素預防感染。每日1次，共3 d。

1.4 給藥方法造模后第2天，中藥組大鼠灌胃6.48 g∕kg益氣活血方藥液，給藥劑量按照人和動物體表面積折算的等效劑量比率關(guān)系換算，Wnt-C59組大鼠灌胃30 mg∕kg Wnt-C59，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃20 mL∕kg 0.9%氯化鈉（NaCl）溶液，1次∕d，共4周。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 心功能指標檢測末次給藥后2 h，采用多普勒超聲儀檢測各組大鼠左室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）和左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）。連續(xù)檢測3個心動周期，取其平均值。

1.5.2 標本制備完成心電圖檢查后，各組大鼠尾靜脈取血，于4℃冰箱靜置2 h，以3 000 r∕min（離心半徑為12.5 cm）離心10 min后取血清，用于酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測。處死大鼠，分離心臟，一部分心臟組織以40 g∕L多聚甲醛溶液固定，用于切片染色，余下的組織置于-80℃凍存，用于蛋白免疫印跡（Western Blot）和RT-qPCR檢測。

1.5.3 HE染色檢測心臟組織在40 g∕L多聚甲醛溶液中固定48 h后，蒸餾水清洗、梯度乙醇脫水后制作病理切片，切片厚度為4μm，脫蠟、復水后行HE染色，光鏡下觀察大鼠心肌組織病變。

1.5.4 Masson染色檢測組織固定、病理切片制作、脫蠟和復水過程同“1.5.3”項。按照Masson染色試劑盒的操作步驟進行染色，光鏡下觀察心臟組織纖維化情況。

1.5.5 TUNEL染色檢測組織固定、病理切片制作、脫蠟和復水過程同“1.5.3”項。嚴格按照TUNEL試劑盒的步驟對病理切片進行染色處理，并置于熒光顯微鏡下拍照記錄，計算凋亡指數(shù)（AI）。AI（%）=陽性細胞數(shù)∕總細胞數(shù)×100%。

1.5.6 RT-qPCR法檢測取大鼠心肌組織，研磨勻漿后加入TRIzol裂解液提取總RNA，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物序列見表1。反應條件：95℃5 min，95℃30 s、62℃30 s、72℃30 s，擴增40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應。實驗重復3次。根據(jù)2-△△CT法計算目的基因mRNA相對表達量。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.7 ELISA法檢測取大鼠血清，嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測血清LDH、CK-MB、CK的含量。

1.5.8 Western Blot法檢測取大鼠心臟組織，研磨勻漿后提取組織蛋白并測定蛋白濃度（BCA法），加入loading buffer混勻、煮沸使蛋白變性。取適量蛋白上樣行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜后封閉2 h。然后將聚偏氟乙烯（PVDF）膜置于4℃環(huán)境下在Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、C-myc一抗稀釋液（1∶1 000）孵育12 h，TBST緩沖液清洗。再把PVDF膜置于羊抗兔IgG二抗稀釋液（1∶2 000）中37℃孵育2 h，TBST洗膜，均勻滴加適量發(fā)光液，放置于凝膠成像儀中顯影拍攝。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白的灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析（One way ANOVA），兩樣本比較采用LSD-t檢測方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標比較表2結(jié)果顯示，模型組大鼠心功能指標LVEF和LVFS均低于假手術(shù)組，LVESD和LVEDD均高于假手術(shù)組（P＜0.05），而中藥組、Wnt-C59組LVEF和LVFS值均高于模型組，LVESD和LVEDD值均低于模型組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠心功能指標比較Table 2 Comparison of cardiac function indexes of rats in various groups （±s）

表2 各組大鼠心功能指標比較Table 2 Comparison of cardiac function indexes of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組中藥組Wnt-C59組LVFS（%）42.55±3.39 16.68±2.25①24.32±2.48①②24.79±2.26①②鼠數(shù)（只）15 14 15 14 LVESD（mm）4.53±0.79 9.20±1.37①7.09±1.14①②7.16±1.20①②LVEDD（mm）6.90±0.95 10.49±1.39①8.55±1.19①②8.64±1.21①②LVEF（%）78.69±4.72 38.57±2.09①55.10±3.13①②56.67±3.01①②

2.2 各組大鼠心肌組織病理學變化比較圖1結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)正常、完整，心肌細胞分布均勻、有序，輪廓清晰可見，胞核與胞質(zhì)邊緣分明，血管管腔完整，部分血管周圍有少量呈藍色的膠原組織。與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織HE染色著色較淺，有細胞輪廓不清晰和細胞破碎現(xiàn)象，組織的排列呈異常紊亂、無序狀，并伴有炎癥細胞浸潤，Masson染色顯示紫紅色的心肌組織明顯減少，存在大量呈藍色的膠原纖維，血管破碎，部分血管呈管腔狹窄和閉合。與模型組比較，HE染色顯示中藥組和Wnt-C59組心肌組織排列較為整齊，著色相對更均勻，有少量炎癥細胞浸潤，血管管腔完整度較好，Masson染色顯示中藥組和Wnt-C59組以紫紅色心肌組織為主，藍色膠原纖維沉積現(xiàn)象顯著減輕。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化比較（HE染色法，×400；Masson染色法，×400）Figure 1 Comparison of pathological changes of myocardial tissue of rats in various groups（by HE staining，×400；by Masson staining，×400）

2.3 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較圖2結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細胞幾乎無凋亡，偶見胞核呈棕褐色的陽性染色細胞，而模型組大鼠心肌細胞AI值及陽性染色細胞數(shù)量均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），中藥組、Wnt-C59組大鼠心肌細胞AI值及陽性染色細胞數(shù)量均顯著低于模型組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較（TUNEL法，×400）Figure 2 Comparison of apoptosis of rat myocardial cells in various groups（by TUNEL，×400）

2.4 各組大鼠心肌凋亡相關(guān)基因mRNA表達水平比較圖3結(jié)果顯示：模型組大鼠心肌Caspase-3、Bax mRNA表達水平顯著高于假手術(shù)組，Bcl-2 mRNA表達水平顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和Wnt-C59組Caspase-3、Bax mRNA表達水平降低，Bcl-2 mRNA表達水平升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠心肌凋亡相關(guān)基因mRNA表達水平比較Figure 3 Comparison of mRNA expression levels of rat myocardial apoptosis-related genes in various groups

2.5 各組大鼠血清LDH、CK、CK-MB含量比較圖4結(jié)果顯示，模型組大鼠血清LDH、CK、CK-MB的含量均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），中藥組和Wnt-C59組血清LDH、CK-MB、CK含量均顯著低于模型組（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠血清心肌損傷指標比較Figure 4 Comparison of serum myocardial injury indexes of rats in various groups

2.6 各組大鼠心肌組織Wnt∕β-catenin通路相關(guān)蛋白表達比較圖5結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、C-myc蛋白表達水平均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），中藥組和Wnt-C59組Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、C-myc蛋白表達水平均顯著低于模型組（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠心肌組織Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達比較Figure 5 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathway-related protein expression in myocardial tissue of rats in various groups

3 討論

急性心肌梗死（AMI）屬于中醫(yī)學“胸痹”的范疇。年老體衰、飲食不節(jié)、寒邪內(nèi)侵等均為其病因，基本病機為心脈阻閉不通，心失所養(yǎng)。本病病性為本虛標實，本虛指氣虛、陽虛、陰虛，以心氣虛為主；標實為痰濁、血瘀、氣滯、寒凝，以血瘀為主[11]。氣虛血瘀為該病的主要病機，因氣虛而導致氣血運行不順，血停則瘀，抑或氣血生化不足，氣血運行中斷，觸發(fā)本病，因此，“益氣”是治療AMI的主要原則。臨床研究表明，具有活血化瘀、行氣開郁的中藥方劑在治療AMI時常能取得顯著療效，聯(lián)合西醫(yī)治療也成為當前AMI治療的常用方案[12-13]。本研究所用的益氣活血方中，黃芪為君藥，溫陽補氣，當歸為臣藥，可“破惡血、養(yǎng)新血”，川芎和丹參活血、行氣、祛瘀，能祛風、通經(jīng)、止痛，諸藥相互為用，共奏補氣活血之功效[14]。

LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD是臨床治療中用于評價心臟功能的常用指標。AMI發(fā)生后，心臟的收縮力和舒張力顯著降低，這些改變歸因于心室壁局部缺血[15]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心臟功能顯著降低，有明顯心室擴張和重構(gòu)，益氣活血方可改善大鼠心臟功能，減輕心室擴張。與細胞損傷和功能完整性喪失有關(guān)的LDH、CK、CK-MB等指標是評估心肌損傷和充血性心力衰竭的重要心肌酶，已被應用于臨床診斷心肌梗死性疾病[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組LDH、CK、CK-MB含量均顯著增加，益氣活血方降低血清LDH、CK、CK-MB含量，可改善模型大鼠心肌損傷，減輕心肌組織膠原纖維沉積。另外，模型組大鼠心肌細胞凋亡顯著，而益氣活血方能夠減輕細胞凋亡，且這一現(xiàn)象在Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達的檢測中得到驗證。Bcl-2家族高度嚴格調(diào)控人體正常細胞和惡性細胞的死亡過程，其中包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡的效應蛋白Bax，Bcl-2和Bax可共同激活促凋亡蛋白Caspase-3及Caspase家族的其他因子，引起衰老和凋亡的發(fā)生[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組心肌Caspase-3、Bax mRNA表達水平升高，Bcl-2 mRNA表達水平降低，益氣活血方可下調(diào)Caspase-3、Bax mRNA水平，上調(diào)Bcl-2 mRNA水平，提示益氣活血方可減輕AMI導致的心肌損傷和細胞凋亡。

Wnt信號通路最初在癌癥過程中被發(fā)現(xiàn)，其可調(diào)控人類和動物的多種病理生理過程，激活不同信號轉(zhuǎn)導途徑[18]。經(jīng)典Wnt信號通路的功能異常與心臟疾病相關(guān)，如AMI、肥厚、心力衰竭、心律不齊及動脈粥樣硬化等[19]。β-catenin是一種調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)錄和基因表達的蛋白，該因子的過度表達可加劇心臟損害，并惡化左心室收縮功能，抑制該通路可抑制心臟損傷后的纖維化過程，預防心力衰竭，因此，針對該信號通路的抑制措施被認為是具有心臟保護作用的[20-21]。本研究結(jié)果顯示，模型組心肌Wnt3a、β-catenin的表達被顯著上調(diào)，β-catenin靶基因Cyclin D1、C-myc蛋白表達也隨之上升，益氣活血方則抑制了Wnt3a、β-catenin表達，β-catenin的靶基因Cyclin D1、C-myc蛋白表達也隨之減少。為了進一步探究益氣活血方的作用機制，本課題組在實驗中同時設(shè)立了Wnt-C59對照組。Wnt-C59是一種特異性針對Wnt信號通路的小分子化合物，可逆轉(zhuǎn)激活的Wnt∕β-catenin信號通路，在腫瘤及心臟疾病中有顯著作用，且治療劑量下無明顯毒性[22]。結(jié)果顯示，Wnt-C59不僅抑制了Wnt∕β-catenin信號通路的活化，同樣也改善了大鼠心臟功能，減輕心肌損傷和心肌細胞凋亡，降低血清心肌損傷指標LDH、CK、CK-MB的含量，益氣活血方的作用效果與Wnt-C59相似，進一步提示益氣活血方可能通過調(diào)控Wnt∕βcatenin途徑發(fā)揮對AMI大鼠心肌損傷的修復和改善作用。

綜上所述，益氣活血方可改善AMI后引起的大鼠心肌損傷，其機制可能與調(diào)控Wnt∕β-catenin途徑有關(guān)，而該調(diào)控過程中是否有其他相關(guān)信號通路的參與，仍需要進一步的研究。