侯利杰，張澤，申炳俊，金麗虹

（長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022）

保泰松（Phenylbutazone，PBZ）又名布他酮，化學名為1，2-二苯基-4-正丁基吡唑烷-3，5-二酮，是二十世紀四十年代合成的唑酮類非甾體類抗炎藥物，具有一定的解熱鎮(zhèn)痛和顯著的抗炎作用。在臨床上PBZ被廣泛用于治療炎癥性疾病，如風濕性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、強直性脊椎炎、絲蟲病急性淋巴管炎和急性痛風等[1-3]。作為一種解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥物，PBZ在醫(yī)療上曾發(fā)揮過巨大的作用。然而，PBZ的副作用較大，若長期服用或劑量過大，輕者出現惡心、嘔吐、腹痛、便秘等癥狀，重者可致消化性潰瘍，可抑制骨髓功能引起粒細胞減少，再生障礙性貧血，甚至死亡[4-5]。因此，二十世紀九十年代開始，隨著新的止痛和消炎藥物的發(fā)現，PBZ的使用量逐漸下降，但PBZ在臨床上的優(yōu)勢依舊未減。隨著相關研究人員的不懈努力，近年來PBZ及其衍生物的新生物活性相繼被發(fā)現。研究表明，4-羥基羥基保泰松具有良好的抗炎增強免疫作用和抗HIV活性，挪威Aviral公司正在進行Ⅱ期臨床試驗。由于PBZ在治療結核病、急性血吸蟲病和惡性腫瘤引起的發(fā)燒方面比其他解熱鎮(zhèn)痛藥更有效，這為PBZ提供了新的市場。目前，PBZ臨床用藥安全和劑量設計重新引起了人們的廣泛關注。

人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）約占血漿總蛋白的60%，是人血漿中含量最高的胞外蛋白質。HSA帶有較多的極性基團，能顯著可逆結合內源性和外源性化合物，在體液中承擔多種物質的儲存和運輸功能。藥代動力學研究表明，口服PBZ能迅速吸收進入血液，其血漿蛋白結合率高達98%。Sudlow和Birbett等人[6]研究發(fā)現，HSA有SiteⅠ（位點Ⅰ）、SiteⅡ（位點Ⅱ）和SiteⅢ（位點Ⅲ）三個配體結合位點。其中，SiteⅠ位于ⅡA亞域疏水腔中，該疏水腔相對較大且具有良好的彈性，SiteⅠ結合的化合物多為體積較大的分子，2個不同配體分子亦可同時結合于SiteⅠ；而SiteⅡ和SiteⅢ均位于ⅢA亞結構域。作為SiteⅠ標記探針之一，PBZ被廣泛用于藥物分子與蛋白質結合位點的研究中。目前，PBZ與牛血清白蛋白（BSA）結合研究已有文獻報道[7]，但PBZ與HSA相互作用的系統(tǒng)研究甚少，有關PBZ結合位點處的熱點殘基、作用力類型以及對HSA構象影響尚未明確。本研究利用分子對接技術結合三維、內源和同步多種熒光光譜法，在分子水平上研究了PBZ與HSA間鍵和模式及作用機理，獲得了兩者間結合常數、結合位點及周圍熱點氨基酸殘基信息、結合距離、結合力以及對作用過程中HSA構象變化等信息。研究結果對于闡明PBZ體內儲藏運輸、指導臨床合理用藥提供更多的參考信息。

圖1 PBZ分子結構式

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-280型熒光分光光度計（天津港東科技發(fā)展有限公司）；UV-2550型雙光束紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；DC-4006型高精度低溫恒溫槽（上海菁?？萍加邢薰荆?；DELTA320型pH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

PBZ（純度≥99%，南通飛宇生物科技有限公司）用無水乙醇配制成2.0 mmol/L儲備液，使用前用無水乙醇稀釋成0.1 mmol/L。HSA（純度≥99%，Sigma公司）儲備液用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.40，0.1 mol/L NaCl）配制，濃度為0.1 mmol/L。實驗用水為18 MΩ/cm超純水，所用其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 分子對接模擬

PBZ的3D結構由有機小分子生物活性數據（Pub Chem數據庫）獲得，其CID編號為4781。HSA的晶體結構取自蛋白質結構數據庫（Protein Data Bank），PDB編號為1H9Z。使用Auto Dock 4.2.5.1軟件對PBZ和HSA進行分子對接模擬，應用 Lamarckian Genetic Algorithm（LGA）遺傳算法得到PBZ與HSA結合構象，用PyMOL2.3.1.0軟件對藥物和蛋白質分子構象進行可視化分析。

1.2.2 三維熒光光譜

室溫下，在兩個Tris-HCl緩沖體系中分別加入 0、240 μL 1.0×10-4mol/L PBZ 溶液以及 40 μL HSA儲備液，獲得HSA∶PBZ（濃度比）為1∶0和1∶6混合液，總體積為4 mL。充分混合后靜置30 min，測量三維熒光光譜。激發(fā)波長（λex）和發(fā)射波長（λem）范圍分別為210～340 nm和250～500 nm，激發(fā)波長和發(fā)射波長間隔均為5 nm。

1.2.3 熒光光譜和同步熒光光譜

配置 HSA∶PBZ（濃度比）分別為 1∶0，1∶1，1∶3，1∶5和 1∶7混合液，總體積為 4 mL，溶液獲得過程同三維熒光光譜。充分混合，在298 K（或310 K）恒溫水浴中靜止30 min，測量熒光光譜或同步熒光光譜。其中，熒光光譜測量條件為：激發(fā)波長（λex）為282 nm或295 nm，發(fā)射波長（λem）范圍為290～410 nm或310～430 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫為10 nm/5 nm；同步熒光光譜測量條件為：發(fā)射和激發(fā)波長間隔（Δλ）為15 nm（或60 nm），發(fā)射波長范圍285～375 nm（或310～410 nm）。

1.2.4 結合距離

1.0 μmol/L HSA 和 PBZ Tris-HCl溶液分別測量熒光光譜和吸收光譜，熒光光譜測量參數同1.2.3節(jié)，吸收光譜波長范圍290～410 nm。

2 結果與分析

2.1 分子對接模擬

分子模擬是研究分子之間特別是生物分子復合物（如藥物與受體）之間相互作用的一種有效方法，它能獲得配體和受體結合構象、位點和作用力等信息[8-10]。圖2（a）為 PBZ 在 HSA 的亞結構區(qū)域ⅡA的對接圖，圖2（b）直觀顯示HSA疏水腔內有足夠的空間容納PBZ，疏水作用力在穩(wěn)定復合物方面應起到了重要作用。PBZ周圍4.0 ?范圍內存在44個對結合作用貢獻較大的活性氨基酸殘基，圖2（c）為PBZ與HSA部分氨基酸結合截圖。44個活性氨基酸殘基涉及，HSAⅡA結構域的氨基酸殘基有，ⅡA-h1的Gln196、Leu198、Lys199和 Ser202，ⅡA-h1和ⅡA-h2間伸展鏈的 Phe206，ⅡA-h2的 Arg209、Ala210、Phe211、Lys212、Ala213、Trp214、Ala215、Val216、Arg218、Leu219和 Arg222，Ⅱ A-h3的Ser232、Val235、Thr236、Leu238和 His242，ⅡA-h4的 Arg257、Leu260和 Ala261，ⅡA-h6的 Ser287、Ile290和Ala291，除ⅡA結構域5個α螺旋中的27個氨基酸殘基外，WF周圍4.0 ?區(qū)域還涉及ⅠB、ⅡB、ⅢA亞結構域17個氨基酸殘基，其在HSA二級結構中的具體分布為：ⅠB-h3的Glu153，ⅠB-h4的 Lys195，ⅡB-h2的Asp324、Leu327、Gly328和 Leu331，ⅡB-h3的 Leu347、Ala350和 Lys351，ⅡB-h3和ⅡB-h4間β-轉角的 Glu354，ⅢA-h4的Glu450、Asp451和 Ser454，ⅢA-h5和ⅢA-h6間伸展 鏈 的 Ser480、Leu481和 Val 482，ⅢA-h6的Asn483。

圖2 PBZ與HSA的分子對接結構模型圖

2.2 HSA與PBZ體系的三維熒光

三維熒光具有高選擇性，它能夠獲得化合物的完整熒光信息，可用于HSA構象及微環(huán)境的分析。1.0 μmol/L HSA與PBZ作用前、后的三維熒光光譜如圖3和圖4所示?？梢钥闯觯琀SA有兩個熒光譜峰（峰1和峰2）和一級瑞利散射（峰a，λex=λem）[11]。其中，峰1（λex/λem/Intensity，230 nm/340 nm/153.0）反映的是蛋白質多肽鏈結構等信息，峰 2（λex/λem/Intensity，285 nm/340 nm/1 329.8）則反映了HSA色氨酸和酪氨酸殘基的光譜行為。隨著PBZ的加入，峰a強度較HSA有所增加，這應是由于溶液中溶質粒徑增大所致；峰1和峰2熒光峰強度均顯著降低，其值分別為106.1和968.8，兩者比值1∶9.13，有別于HSA的1∶8.69；最大發(fā)射波長都藍移了1.0 nm。說明PBZ與HSA發(fā)生相互作用，導致HSA構象略微改變，使HSA中熒光基團微環(huán)境非極性有所增加，蛋白質粒徑變大。

圖3 HSA的三維熒光光譜

圖4 HSA與PBZ作用后的三維熒光光譜

2.3 PBZ與HSA的熒光猝滅光譜及作用機制確定

HSA含有色氨酸（1個）、酪氨酸（18個）和苯丙氨酸（30個），這些具有芳香結構氨基酸令其具有內源熒光[12]。由于苯丙氨酸熒光量子效率（φ=0.04）遠低于酪氨酸（φ=0.1）和色氨酸（φ=0.2），而酪氨酸離子化時其熒光幾乎被猝滅，HSA內源熒光主要來源于ⅡA亞域疏水腔的色氨酸（Trp214）。不同濃度PBZ對HSA熒光光譜影響結果如圖5（a-e）所示，而PBZ則無明顯內源熒光（見圖5曲線f）。由圖5可知，λex=282 nm時，HSA在340 nm處內源熒光強度隨PBZ濃度增加呈現有規(guī)律的下降，峰形雖沒有明顯變化，但熒光發(fā)射峰位藍移4.8 nm（激發(fā)波長為295 nm時，PBZ-HSA體系的熒光光譜與其類似），表明PBZ使HSA生色團微環(huán)境極性降低，PBZ與HSA間發(fā)生了作用。

圖5 PBZ對HSA熒光發(fā)射譜的影響（298 K）

PBZ誘導HSA內源熒光猝滅機理可以根據Stern-Volmer方程進行描述[13-14]：

式中，F0和F分別為PBZ加入前、后HSA內源熒光強度；Kq為雙分子碰撞過程速率常數；τ0為HSA熒光壽命，約為1×10-8s；[Q]為 PBZ平衡濃度（μmol/L）；KSV為Stern-Volmer猝滅常數。

282 nm和295 nm兩激發(fā)波長下，由PBZ-HSA體系F0/F對[Q]的Stern-Volmer曲線圖可計算獲得猝滅常數（KSV），其結果如表1所示。

表1 PBZ與HSA作用的猝滅常數

可以看出，隨著溫度升高，PBZ-HSA體系的熒光猝滅常數KSV減少；文中實驗條件下，雙分子猝滅速率常數（Kq）數量級在1012，該值大于2×1010L/（mol·s）（各類猝滅劑對生物大分子的Kq）。由此推斷，PBZ對HSA內源熒光猝滅過程為靜態(tài)猝滅，兩者間形成了復合物。

根據F?rster理論，熒光物質與受體間發(fā)生非輻射能量轉移亦可能導致HSA內源熒光猝滅原因之一[15]。圖6為 1 μmol/L HSA 和 PBZ的熒光發(fā)射譜、吸收光譜的重疊圖，采用矩形分割法可求得298 K時兩光譜重疊區(qū)的重疊積分為J=2.06×10-16（cm3·L）/mol，臨界距離R0=1.046 nm，能量轉移效率E=0.105，結合距離r=0.65 nm。由于r<7 nm，且0.5R0

圖6 HSA的熒光發(fā)射譜和PBZ的吸收光譜

2.4 PBZ與HSA作用的結合常數和結合位點數

熒光物質與猝滅體之間形成非熒光復合物時 ，可利用Lineweacr-Burk雙對數方程[16]（lg[（F0-F）/F]=lgKA+nlg[Q]）得到結合常數KA和結合位點數n（如表2所示）。298 K和310 K下，結合常數KA數量級均在104，說明PBZ與HSA之間作用力適中，兩者形成了較為穩(wěn)定的復合物。結合位點n近似為1，表明PBZ和HSA間結合類型為1∶1。

表2 PBZ與HSA作用的結合常數及結合位點數

2.5 熱力學參數及作用力

藥物分子與HSA間可逆結合化學鍵主要涉及：靜電作用、氫鍵、范德華力和疏水鍵[17]。由范特霍夫方程[18]（lnKA=-ΔH/RT+ ΔS/R，ΔG=ΔH-TΔS）計算PBZ和HSA作用的熱力學參數焓（ΔH）、熵（ΔS）和吉布斯自由能（ΔG），結果如表 3所示。由表 3可知，ΔG<0，ΔH<0，ΔS>0，說明PBZ與HSA間相互作用是一個自發(fā)吸熱的過程，亦是一個熵增加的過程，二者作用的主要驅動力為疏水作用力，這與分子對接以及文獻[7]結果一致。

表3 PBZ與HSA作用的熱力學參數

2.6 PBZ對HSA二級結構的影響

同步熒光光譜被廣泛用于多組分物質分析，它可以提供關于色氨酸（Trp214，Δλ=60 nm）和酪氨酸（Tyr，Δλ=15 nm）殘基的熒光團微環(huán)境變化的有用信息，而這些熒光團與蛋白質的構象變化密切相關[19-20]。圖7和圖8為PBZ和HSA作用的同步熒光光譜，兩步長（60 nm和15 nm）熒光強度均隨PBZ濃度的增加而被明顯猝滅。代表色氨酸殘基的熒光猝滅程度（36.8%）明顯大于酪氨酸殘基（13.2%），表明HSA與PBZ結合部位更靠近色氨酸，這與PBZ為位點I的標記藥物結論相符。此外，色氨酸、酪氨酸殘基最大發(fā)射波長分別藍移1.2 nm和0.3 nm，表明與PBZ作用在一定程度上影響了HSA構象，主要引起兩熒光生色團微環(huán)境極性增加。

圖7 PBZ對HSAΔλ=15 nm同步熒光的影響（298 K）

圖8 PBZ對HSAΔλ=60 nm同步熒光的影響（298 K）

3 結論

綜上所述，通過多光譜技術與分子對接，研究了PBZ與HSA間的相互作用。結果表明，兩者間的疏水作用力推動了PBZ-HSA復合物的形成。結合過程使HSA構象改變，色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境極性均有所增加，兩者間結合距離為0.65 nm。此外，分子對接進一步解釋并驗證了光譜分析正確性，表明除ⅡA結構域28個氨基酸殘基外，PBZ周圍4.0 ?區(qū)域還存在ⅠB、ⅡB、ⅢA亞結構域17個氨基酸殘基。PBZ與HSA間結合常數為104數量級，其值適中。本研究對預測WF與HSA結合率和其安全性評估提供一定的參考數據。