侯利杰，張澤，申炳俊，金麗虹

（長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

保泰松（Phenylbutazone，PBZ）又名布他酮，化學(xué)名為1，2-二苯基-4-正丁基吡唑烷-3，5-二酮，是二十世紀(jì)四十年代合成的唑酮類非甾體類抗炎藥物，具有一定的解熱鎮(zhèn)痛和顯著的抗炎作用。在臨床上PBZ被廣泛用于治療炎癥性疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎、絲蟲病急性淋巴管炎和急性痛風(fēng)等[1-3]。作為一種解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥物，PBZ在醫(yī)療上曾發(fā)揮過巨大的作用。然而，PBZ的副作用較大，若長(zhǎng)期服用或劑量過大，輕者出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、便秘等癥狀，重者可致消化性潰瘍，可抑制骨髓功能引起粒細(xì)胞減少，再生障礙性貧血，甚至死亡[4-5]。因此，二十世紀(jì)九十年代開始，隨著新的止痛和消炎藥物的發(fā)現(xiàn)，PBZ的使用量逐漸下降，但PBZ在臨床上的優(yōu)勢(shì)依舊未減。隨著相關(guān)研究人員的不懈努力，近年來PBZ及其衍生物的新生物活性相繼被發(fā)現(xiàn)。研究表明，4-羥基羥基保泰松具有良好的抗炎增強(qiáng)免疫作用和抗HIV活性，挪威Aviral公司正在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)。由于PBZ在治療結(jié)核病、急性血吸蟲病和惡性腫瘤引起的發(fā)燒方面比其他解熱鎮(zhèn)痛藥更有效，這為PBZ提供了新的市場(chǎng)。目前，PBZ臨床用藥安全和劑量設(shè)計(jì)重新引起了人們的廣泛關(guān)注。

人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）約占血漿總蛋白的60%，是人血漿中含量最高的胞外蛋白質(zhì)。HSA帶有較多的極性基團(tuán)，能顯著可逆結(jié)合內(nèi)源性和外源性化合物，在體液中承擔(dān)多種物質(zhì)的儲(chǔ)存和運(yùn)輸功能。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，口服PBZ能迅速吸收進(jìn)入血液，其血漿蛋白結(jié)合率高達(dá)98%。Sudlow和Birbett等人[6]研究發(fā)現(xiàn)，HSA有SiteⅠ（位點(diǎn)Ⅰ）、SiteⅡ（位點(diǎn)Ⅱ）和SiteⅢ（位點(diǎn)Ⅲ）三個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)。其中，SiteⅠ位于ⅡA亞域疏水腔中，該疏水腔相對(duì)較大且具有良好的彈性，SiteⅠ結(jié)合的化合物多為體積較大的分子，2個(gè)不同配體分子亦可同時(shí)結(jié)合于SiteⅠ；而SiteⅡ和SiteⅢ均位于ⅢA亞結(jié)構(gòu)域。作為SiteⅠ標(biāo)記探針之一，PBZ被廣泛用于藥物分子與蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的研究中。目前，PBZ與牛血清白蛋白（BSA）結(jié)合研究已有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，但PBZ與HSA相互作用的系統(tǒng)研究甚少，有關(guān)PBZ結(jié)合位點(diǎn)處的熱點(diǎn)殘基、作用力類型以及對(duì)HSA構(gòu)象影響尚未明確。本研究利用分子對(duì)接技術(shù)結(jié)合三維、內(nèi)源和同步多種熒光光譜法，在分子水平上研究了PBZ與HSA間鍵和模式及作用機(jī)理，獲得了兩者間結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)及周圍熱點(diǎn)氨基酸殘基信息、結(jié)合距離、結(jié)合力以及對(duì)作用過程中HSA構(gòu)象變化等信息。研究結(jié)果對(duì)于闡明PBZ體內(nèi)儲(chǔ)藏運(yùn)輸、指導(dǎo)臨床合理用藥提供更多的參考信息。

圖1 PBZ分子結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-280型熒光分光光度計(jì)（天津港東科技發(fā)展有限公司）；UV-2550型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；DC-4006型高精度低溫恒溫槽（上海菁海科技有限公司）；DELTA320型pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

PBZ（純度≥99%，南通飛宇生物科技有限公司）用無水乙醇配制成2.0 mmol/L儲(chǔ)備液，使用前用無水乙醇稀釋成0.1 mmol/L。HSA（純度≥99%，Sigma公司）儲(chǔ)備液用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.40，0.1 mol/L NaCl）配制，濃度為0.1 mmol/L。實(shí)驗(yàn)用水為18 MΩ/cm超純水，所用其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分子對(duì)接模擬

PBZ的3D結(jié)構(gòu)由有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)（Pub Chem數(shù)據(jù)庫(kù)）獲得，其CID編號(hào)為4781。HSA的晶體結(jié)構(gòu)取自蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank），PDB編號(hào)為1H9Z。使用Auto Dock 4.2.5.1軟件對(duì)PBZ和HSA進(jìn)行分子對(duì)接模擬，應(yīng)用 Lamarckian Genetic Algorithm（LGA）遺傳算法得到PBZ與HSA結(jié)合構(gòu)象，用PyMOL2.3.1.0軟件對(duì)藥物和蛋白質(zhì)分子構(gòu)象進(jìn)行可視化分析。

1.2.2 三維熒光光譜

室溫下，在兩個(gè)Tris-HCl緩沖體系中分別加入 0、240 μL 1.0×10-4mol/L PBZ 溶液以及 40 μL HSA儲(chǔ)備液，獲得HSA∶PBZ（濃度比）為1∶0和1∶6混合液，總體積為4 mL。充分混合后靜置30 min，測(cè)量三維熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)（λex）和發(fā)射波長(zhǎng)（λem）范圍分別為210～340 nm和250～500 nm，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)間隔均為5 nm。

1.2.3 熒光光譜和同步熒光光譜

配置 HSA∶PBZ（濃度比）分別為 1∶0，1∶1，1∶3，1∶5和 1∶7混合液，總體積為 4 mL，溶液獲得過程同三維熒光光譜。充分混合，在298 K（或310 K）恒溫水浴中靜止30 min，測(cè)量熒光光譜或同步熒光光譜。其中，熒光光譜測(cè)量條件為：激發(fā)波長(zhǎng)（λex）為282 nm或295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λem）范圍為290～410 nm或310～430 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫為10 nm/5 nm；同步熒光光譜測(cè)量條件為：發(fā)射和激發(fā)波長(zhǎng)間隔（Δλ）為15 nm（或60 nm），發(fā)射波長(zhǎng)范圍285～375 nm（或310～410 nm）。

1.2.4 結(jié)合距離

1.0 μmol/L HSA 和 PBZ Tris-HCl溶液分別測(cè)量熒光光譜和吸收光譜，熒光光譜測(cè)量參數(shù)同1.2.3節(jié)，吸收光譜波長(zhǎng)范圍290～410 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子對(duì)接模擬

分子模擬是研究分子之間特別是生物分子復(fù)合物（如藥物與受體）之間相互作用的一種有效方法，它能獲得配體和受體結(jié)合構(gòu)象、位點(diǎn)和作用力等信息[8-10]。圖2（a）為 PBZ 在 HSA 的亞結(jié)構(gòu)區(qū)域ⅡA的對(duì)接圖，圖2（b）直觀顯示HSA疏水腔內(nèi)有足夠的空間容納PBZ，疏水作用力在穩(wěn)定復(fù)合物方面應(yīng)起到了重要作用。PBZ周圍4.0 ?范圍內(nèi)存在44個(gè)對(duì)結(jié)合作用貢獻(xiàn)較大的活性氨基酸殘基，圖2（c）為PBZ與HSA部分氨基酸結(jié)合截圖。44個(gè)活性氨基酸殘基涉及，HSAⅡA結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基有，ⅡA-h1的Gln196、Leu198、Lys199和 Ser202，ⅡA-h1和ⅡA-h2間伸展鏈的 Phe206，ⅡA-h2的 Arg209、Ala210、Phe211、Lys212、Ala213、Trp214、Ala215、Val216、Arg218、Leu219和 Arg222，Ⅱ A-h3的Ser232、Val235、Thr236、Leu238和 His242，ⅡA-h4的 Arg257、Leu260和 Ala261，ⅡA-h6的 Ser287、Ile290和Ala291，除ⅡA結(jié)構(gòu)域5個(gè)α螺旋中的27個(gè)氨基酸殘基外，WF周圍4.0 ?區(qū)域還涉及ⅠB、ⅡB、ⅢA亞結(jié)構(gòu)域17個(gè)氨基酸殘基，其在HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)中的具體分布為：ⅠB-h3的Glu153，ⅠB-h4的 Lys195，ⅡB-h2的Asp324、Leu327、Gly328和 Leu331，ⅡB-h3的 Leu347、Ala350和 Lys351，ⅡB-h3和ⅡB-h4間β-轉(zhuǎn)角的 Glu354，ⅢA-h4的Glu450、Asp451和 Ser454，ⅢA-h5和ⅢA-h6間伸展 鏈 的 Ser480、Leu481和 Val 482，ⅢA-h6的Asn483。

圖2 PBZ與HSA的分子對(duì)接結(jié)構(gòu)模型圖

2.2 HSA與PBZ體系的三維熒光

三維熒光具有高選擇性，它能夠獲得化合物的完整熒光信息，可用于HSA構(gòu)象及微環(huán)境的分析。1.0 μmol/L HSA與PBZ作用前、后的三維熒光光譜如圖3和圖4所示。可以看出，HSA有兩個(gè)熒光譜峰（峰1和峰2）和一級(jí)瑞利散射（峰a，λex=λem）[11]。其中，峰1（λex/λem/Intensity，230 nm/340 nm/153.0）反映的是蛋白質(zhì)多肽鏈結(jié)構(gòu)等信息，峰 2（λex/λem/Intensity，285 nm/340 nm/1 329.8）則反映了HSA色氨酸和酪氨酸殘基的光譜行為。隨著PBZ的加入，峰a強(qiáng)度較HSA有所增加，這應(yīng)是由于溶液中溶質(zhì)粒徑增大所致；峰1和峰2熒光峰強(qiáng)度均顯著降低，其值分別為106.1和968.8，兩者比值1∶9.13，有別于HSA的1∶8.69；最大發(fā)射波長(zhǎng)都藍(lán)移了1.0 nm。說明PBZ與HSA發(fā)生相互作用，導(dǎo)致HSA構(gòu)象略微改變，使HSA中熒光基團(tuán)微環(huán)境非極性有所增加，蛋白質(zhì)粒徑變大。

圖3 HSA的三維熒光光譜

圖4 HSA與PBZ作用后的三維熒光光譜

2.3 PBZ與HSA的熒光猝滅光譜及作用機(jī)制確定

HSA含有色氨酸（1個(gè)）、酪氨酸（18個(gè)）和苯丙氨酸（30個(gè)），這些具有芳香結(jié)構(gòu)氨基酸令其具有內(nèi)源熒光[12]。由于苯丙氨酸熒光量子效率（φ=0.04）遠(yuǎn)低于酪氨酸（φ=0.1）和色氨酸（φ=0.2），而酪氨酸離子化時(shí)其熒光幾乎被猝滅，HSA內(nèi)源熒光主要來源于ⅡA亞域疏水腔的色氨酸（Trp214）。不同濃度PBZ對(duì)HSA熒光光譜影響結(jié)果如圖5（a-e）所示，而PBZ則無明顯內(nèi)源熒光（見圖5曲線f）。由圖5可知，λex=282 nm時(shí)，HSA在340 nm處內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨PBZ濃度增加呈現(xiàn)有規(guī)律的下降，峰形雖沒有明顯變化，但熒光發(fā)射峰位藍(lán)移4.8 nm（激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm時(shí)，PBZ-HSA體系的熒光光譜與其類似），表明PBZ使HSA生色團(tuán)微環(huán)境極性降低，PBZ與HSA間發(fā)生了作用。

圖5 PBZ對(duì)HSA熒光發(fā)射譜的影響（298 K）

PBZ誘導(dǎo)HSA內(nèi)源熒光猝滅機(jī)理可以根據(jù)Stern-Volmer方程進(jìn)行描述[13-14]：

式中，F(xiàn)0和F分別為PBZ加入前、后HSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子碰撞過程速率常數(shù)；τ0為HSA熒光壽命，約為1×10-8s；[Q]為 PBZ平衡濃度（μmol/L）；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。

282 nm和295 nm兩激發(fā)波長(zhǎng)下，由PBZ-HSA體系F0/F對(duì)[Q]的Stern-Volmer曲線圖可計(jì)算獲得猝滅常數(shù)（KSV），其結(jié)果如表1所示。

表1 PBZ與HSA作用的猝滅常數(shù)

可以看出，隨著溫度升高，PBZ-HSA體系的熒光猝滅常數(shù)KSV減少；文中實(shí)驗(yàn)條件下，雙分子猝滅速率常數(shù)（Kq）數(shù)量級(jí)在1012，該值大于2×1010L/（mol·s）（各類猝滅劑對(duì)生物大分子的Kq）。由此推斷，PBZ對(duì)HSA內(nèi)源熒光猝滅過程為靜態(tài)猝滅，兩者間形成了復(fù)合物。

根據(jù)F?rster理論，熒光物質(zhì)與受體間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移亦可能導(dǎo)致HSA內(nèi)源熒光猝滅原因之一[15]。圖6為 1 μmol/L HSA 和 PBZ的熒光發(fā)射譜、吸收光譜的重疊圖，采用矩形分割法可求得298 K時(shí)兩光譜重疊區(qū)的重疊積分為J=2.06×10-16（cm3·L）/mol，臨界距離R0=1.046 nm，能量轉(zhuǎn)移效率E=0.105，結(jié)合距離r=0.65 nm。由于r<7 nm，且0.5R0

圖6 HSA的熒光發(fā)射譜和PBZ的吸收光譜

2.4 PBZ與HSA作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

熒光物質(zhì)與猝滅體之間形成非熒光復(fù)合物時(shí) ，可利用Lineweacr-Burk雙對(duì)數(shù)方程[16]（lg[（F0-F）/F]=lgKA+nlg[Q]）得到結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n（如表2所示）。298 K和310 K下，結(jié)合常數(shù)KA數(shù)量級(jí)均在104，說明PBZ與HSA之間作用力適中，兩者形成了較為穩(wěn)定的復(fù)合物。結(jié)合位點(diǎn)n近似為1，表明PBZ和HSA間結(jié)合類型為1∶1。

表2 PBZ與HSA作用的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

2.5 熱力學(xué)參數(shù)及作用力

藥物分子與HSA間可逆結(jié)合化學(xué)鍵主要涉及：靜電作用、氫鍵、范德華力和疏水鍵[17]。由范特霍夫方程[18]（lnKA=-ΔH/RT+ ΔS/R，ΔG=ΔH-TΔS）計(jì)算PBZ和HSA作用的熱力學(xué)參數(shù)焓（ΔH）、熵（ΔS）和吉布斯自由能（ΔG），結(jié)果如表 3所示。由表 3可知，ΔG<0，ΔH<0，ΔS>0，說明PBZ與HSA間相互作用是一個(gè)自發(fā)吸熱的過程，亦是一個(gè)熵增加的過程，二者作用的主要驅(qū)動(dòng)力為疏水作用力，這與分子對(duì)接以及文獻(xiàn)[7]結(jié)果一致。

表3 PBZ與HSA作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.6 PBZ對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

同步熒光光譜被廣泛用于多組分物質(zhì)分析，它可以提供關(guān)于色氨酸（Trp214，Δλ=60 nm）和酪氨酸（Tyr，Δλ=15 nm）殘基的熒光團(tuán)微環(huán)境變化的有用信息，而這些熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化密切相關(guān)[19-20]。圖7和圖8為PBZ和HSA作用的同步熒光光譜，兩步長(zhǎng)（60 nm和15 nm）熒光強(qiáng)度均隨PBZ濃度的增加而被明顯猝滅。代表色氨酸殘基的熒光猝滅程度（36.8%）明顯大于酪氨酸殘基（13.2%），表明HSA與PBZ結(jié)合部位更靠近色氨酸，這與PBZ為位點(diǎn)I的標(biāo)記藥物結(jié)論相符。此外，色氨酸、酪氨酸殘基最大發(fā)射波長(zhǎng)分別藍(lán)移1.2 nm和0.3 nm，表明與PBZ作用在一定程度上影響了HSA構(gòu)象，主要引起兩熒光生色團(tuán)微環(huán)境極性增加。

圖7 PBZ對(duì)HSAΔλ=15 nm同步熒光的影響（298 K）

圖8 PBZ對(duì)HSAΔλ=60 nm同步熒光的影響（298 K）

3 結(jié)論

綜上所述，通過多光譜技術(shù)與分子對(duì)接，研究了PBZ與HSA間的相互作用。結(jié)果表明，兩者間的疏水作用力推動(dòng)了PBZ-HSA復(fù)合物的形成。結(jié)合過程使HSA構(gòu)象改變，色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境極性均有所增加，兩者間結(jié)合距離為0.65 nm。此外，分子對(duì)接進(jìn)一步解釋并驗(yàn)證了光譜分析正確性，表明除ⅡA結(jié)構(gòu)域28個(gè)氨基酸殘基外，PBZ周圍4.0 ?區(qū)域還存在ⅠB、ⅡB、ⅢA亞結(jié)構(gòu)域17個(gè)氨基酸殘基。PBZ與HSA間結(jié)合常數(shù)為104數(shù)量級(jí)，其值適中。本研究對(duì)預(yù)測(cè)WF與HSA結(jié)合率和其安全性評(píng)估提供一定的參考數(shù)據(jù)。