孫清榮，關(guān)秋竹，何平，李林光，王海波，陶吉寒，孫洪雁

（山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

果樹繁殖主要是通過把優(yōu)良品種的接穗嫁接到適宜砧木上進行的，這種繁殖方式一方面保證了無性繁殖品種的穩(wěn)定性，另一方面又可利用砧木的優(yōu)良特性對接穗品種進行改良，提高其抗逆性、抗病蟲能力及早實性，改善樹體大小等［1-3］。另外，砧木還可影響接穗品種的基因表達模式［4］及抗或耐重茬性［5］。因此，在果樹栽培生產(chǎn)上，砧木發(fā)揮著與品種同等重要的作用。而矮化砧木的育成與應(yīng)用對現(xiàn)代化商業(yè)化果園的生產(chǎn)更有其特殊意義。矮化砧木可控制上部接穗品種樹體的長勢，使樹體矮化，便于果園機械化管理；矮化還可加大種植密度，提高光能利用率和單產(chǎn)，從而提高經(jīng)濟效益。因此世界各國都非常重視矮化砧木的選育，不斷有新品種育成。

蘋果砧木G.935是美國康乃爾大學(xué)紐約Geneva實驗站從Ottawa 3（抗冠腐和根腐病資源）×Robusta 5（抗火疫病資源）雜交種中選育出的半矮化砧木，具有高抗火疫病、耐重茬、高抗根腐病、耐寒等優(yōu)良特性，生產(chǎn)效率相當(dāng)于矮化砧木M9?，F(xiàn)已引入我國，但尚處于試驗觀察階段，還沒有在生產(chǎn)上大規(guī)模推廣應(yīng)用。建立其離體快繁體系以快速獲得優(yōu)質(zhì)種苗，可為其今后在栽培生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，從而加速優(yōu)良砧木推廣。目前有關(guān)蘋果半矮化砧木G.935組培快繁的研究國內(nèi)外尚未見報道。本研究以G.935當(dāng)年生新梢芽段為外植體獲得無菌苗，然后以無菌苗為試材，設(shè)置不同的基本培養(yǎng)基和激素種類及濃度，對其增殖和生根培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以建立其高效離體快繁技術(shù)體系，為今后推廣應(yīng)用及提供優(yōu)良矮化砧木種苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山東省果樹研究所天平湖試驗基地嫁接種植的蘋果半矮化砧木G.935小樹。

1.2 試驗方法

1.2.1 試管苗建立 2016年4月中旬，剪取當(dāng)年新生的半木質(zhì)化枝條，去掉葉片帶回實驗室；把枝條剪成一芽一段的芽段，參照孫清榮等［6］的方法進行消毒，然后接種到裝有腋芽啟動培養(yǎng)基的試管內(nèi)，一管一個芽段，并置培養(yǎng)室誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)至伸長生長形成無菌綠苗。腋芽啟動培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-芐基氨基嘌呤（6-BA）+0.1 mg·L-1吲哚丁酸（IBA）+0.3 mg·L-1赤霉素（GA3）。

1.2.2 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化試驗 以無菌綠苗作為繼代增殖的材料，設(shè)置4種培養(yǎng)基進行繼代增殖：①MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA；②MS+1.0 mg·L-1BA+0.2 mg·L-1IBA；③NM+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA；④NM+1.0mg·L-1BA+0.2 mg·L-1IBA。每一個繼代增殖周期為4周，統(tǒng)計每一個周期的試管苗增殖倍數(shù)，以繼代培養(yǎng)3個周期的增殖倍數(shù)的平均值作為每一處理的增殖倍數(shù)，重復(fù)2次。

1.2.3 生根培養(yǎng)基優(yōu)化試驗 以繼代增殖并伸長至1 cm以上的健壯綠梢為試材，設(shè)置不同培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基選用1/2MS和1/4MS，激素選用IBA和吲哚乙酸（IAA）并各設(shè)兩個濃度，前者為0.2、0.4 mg·L-1，后者為0.5、1.0 mg·L-1，共構(gòu)成8個處理。每個處理接種3瓶，每瓶種植10個綠梢，共計30個綠梢，作為一個重復(fù)，重復(fù)3次。接種后置于連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)1周，然后轉(zhuǎn)光培養(yǎng)4周，統(tǒng)計生根梢數(shù)和單株生根數(shù)，計算生根率和平均每株生根數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用DPSv3.01軟件進行統(tǒng)計分析，用最小顯著差異（LSD）法進行差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 試管苗的建立

半木質(zhì)化芽段在腋芽啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后萌發(fā)形成可用于繼代繁殖的無菌試管綠苗（圖1 A），腋芽萌發(fā)率在80%以上，表明所選啟動培養(yǎng)基對蘋果砧木G.935腋芽啟動培養(yǎng)是有效的。

2.2 試管苗增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

四種培養(yǎng)基都能促進試管苗增殖，平均一個繼代周期的增殖倍數(shù)都達到了4以上，不同培養(yǎng)基間差異不顯著（表1）。但以MS為基本培養(yǎng)基的增殖倍數(shù)略高于以NM為基本培養(yǎng)基的。增殖苗在不同培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)不同：當(dāng)添加0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA時，MS培養(yǎng)基上產(chǎn)生有明顯節(jié)間伸長生長的綠苗（圖1 B），而NM培養(yǎng)基上的增殖苗增高生長較差，沒有明顯的節(jié)間伸長（圖1 D）；當(dāng)添加1.0 mg·L-1BA+0.2 mg·L-1IBA時，MS培養(yǎng)基上的增殖苗雖有節(jié)間伸長，但葉片卷曲不伸展，而且有玻璃化現(xiàn)象發(fā)生（圖1 C），而NM培養(yǎng)基上的增殖苗節(jié)間伸長，葉片較伸展，沒有玻璃化現(xiàn)象發(fā)生，但葉色較淺（圖1 E）。表明，當(dāng)BA和IBA濃度較低時，基本培養(yǎng)基MS更有利于增殖培養(yǎng)；但當(dāng)BA和IBA濃度較高時，使用基本培養(yǎng)基NM更有利于獲得正常生長的增殖苗。綜合來看，以MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA進行增殖培養(yǎng)的效果最好。

表1 蘋果半矮化砧木G.935試管苗增殖培養(yǎng)基優(yōu)化試驗結(jié)果

圖1 G.935試管苗建立及在不同增殖培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)

2.3 試管苗生根培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 不同培養(yǎng)基對試管苗生根率和單株生根數(shù)的影響 兩種基本培養(yǎng)基上均以添加IBA的生根率和單株生根數(shù)較高，顯著高于添加IAA的；基本培養(yǎng)基相同時，添加0.2 mg·L-1IBA的生根率和單株生根數(shù)高于0.5 mg·L-1IBA，在1/2MS上差異不顯著，在1/4MS上差異達顯著水平；IBA添加濃度相同時，以1/2MS為基本培養(yǎng)基的生根率和單株生根數(shù)均高于以1/4MS為基本培養(yǎng)基的，其中，生根率在添加0.5 mg·L-1IBA時差異達顯著水平，單株生根數(shù)在兩種濃度IBA下均差異顯著（表2）。

表2 不同培養(yǎng)基上蘋果砧木G.935試管苗的生根率和單株生根數(shù)

2.3.2 不同培養(yǎng)基對生根進程和途徑的影響培養(yǎng)至第14天就可以觀察到明顯的小短根產(chǎn)生（圖2 A～D），添加IBA培養(yǎng)基上的根（圖2 A和C）比添加IAA上的根（圖2 B和D）稍短，但單株根數(shù)較多。隨著培養(yǎng)時間的延長，在添加IBA的培養(yǎng)基上既有根的伸長生長又有單株根數(shù)的增加（圖2 E和F），而在添加IAA處理的培養(yǎng)基上僅有根的伸長生長，根數(shù)不再增加（圖2 G和H）。

在添加IBA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的愈傷（圖2 A、C、E、F），推測IBA可能是先誘導(dǎo)出愈傷，再由愈傷產(chǎn)生根；而在添加IAA的培養(yǎng)基上根是從莖切面直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的，不通過愈傷階段（圖2 B、D、G、H），所以其誘導(dǎo)生根進程更快，第14天時的根明顯長。

圖2 不同生根培養(yǎng)基對生根的影響

綜合上述分析，適宜蘋果半矮化砧木G.935的生根培養(yǎng)基為添加0.2 mg·L-1IBA的1/2MS或1/4MS培養(yǎng)基，尤以1/2MS+0.2 mg·L-1IBA最佳。

3 討論與結(jié)論

植物試管苗增殖快繁的成敗取決于培養(yǎng)基的組成，其中，基本培養(yǎng)基組分和外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是主要的影響因素［7］，在蘋果砧木上的研究已有較多報道，但不同品種適宜的基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不同［8-16］。如適宜砧木54-118、JM7、GM256、Budagovsky71-3-150、Budagovsky60-160增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為QL［10-12］；適宜砧木G.41的增殖培養(yǎng)基為同時添加1 mg·L-1BA和0.1 mg·L-1TDZ的MS培養(yǎng)基，若單加BA則增殖率很低，若單加TDZ雖增殖率較高，但產(chǎn)生畸形葉和玻璃化苗［13］。本研究選用的試材砧木G.935與G.41的親本之一都有‘Robusta5’，但適宜兩者試管苗增殖的培養(yǎng)基不同，本試驗中適宜G.935增殖的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA。因此，蘋果砧木試管苗的增殖快繁應(yīng)針對不同品種選用其適宜的增殖培養(yǎng)基。

生根培養(yǎng)是離體快繁中關(guān)鍵的一步，直接影響工廠化繁育試管苗的成敗。本試驗選用的G.935是一個生根相對較易的品種，在1/2MS或1/4MS培養(yǎng)基中添加適宜濃度的IBA或IAA都能成功誘導(dǎo)試管苗生根，但以添加0.2 mg·L-1IBA的效果更好，生根率可達90%以上，單株生根6條以上，其中以1/2MS為基本培養(yǎng)基的效果好于1/4MS，這與孫清榮等［17］報道的BP-176砧木在1/2MS上的生根效果好于1/4MS一致。王淑華等［18］研究表明在‘嘎啦’蘋果試管苗生根培養(yǎng)時IAA表現(xiàn)優(yōu)于IBA和NAA；而吳玉霞等［19］在‘粉紅佳人’試管苗生根培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)IBA比IAA明顯提高生根率。不同品種對IAA的生根反應(yīng)不同可能與不同品種梢基部的游離IAA水平不同有關(guān)。Alvarez等研究表明，相比M9，IAA誘導(dǎo)M26的生根率更高，其原因是M26比M9的梢基部含有更高水平的游離IAA［20］。

本研究建立了蘋果優(yōu)良半矮化砧木G.935的高效離體快繁技術(shù)體系：以當(dāng)年新生的半木質(zhì)化枝條為材料，以MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1GA3作為腋芽啟動培養(yǎng)基，獲得無菌試管苗；再以試管苗為試材，用MS+0.5 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1IBA進行增殖培養(yǎng)，用1/2MS+0.2 mg·L-1IBA進行生根培養(yǎng)，短時間內(nèi)可獲得規(guī)模無性繁殖的健康幼苗。這為今后推廣應(yīng)用半矮化砧木G.935奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。