崔小敏 晉玥媞 任慧 胡靜 董明芝 何芳 李寧 曲彤 陳志永

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）22-2743-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.10

摘 要 目的：建立同時測定正心降脂片中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、蘆丁、橙皮苷、丹酚酸A、槲皮素等7種成分含量的方法，并進行聚類熱圖分析。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18，流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。以含量數(shù)據(jù)為對象，采用Hiplot科研繪圖平臺繪制聚類熱圖。結果：葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、蘆丁、橙皮苷、丹酚酸A、槲皮素檢測質量濃度的線性范圍分別為17.00～170.00（r=0.999 9）、5.14～51.40（r=0.999 8）、3.00～30.00（r=0.999 8）、153.00～1 530.00（r=0.999 9）、7.88～78.75（r=0.999 8）、2.85～28.50（r=0.999 9）、11.34～113.40 μg/mL（r=0.999 8）。精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復性試驗的RSD均小于2%;平均加樣回收率分別為99.58%（RSD=0.83%，n=6）、100.31%（RSD=1.17%，n=6）、100.61%（RSD=1.08%，n=6）、100.05%（RSD=0.82%，n=6）、100.31%（RSD=1.38%，n=6）、100.31%（RSD=0.85%，n=6）、99.85%（RSD=1.01%，n=6）。10批樣品中上述成分的含量分別為7.262 5～8.941 5、2.464 9～3.068 9、1.478 9～1.883 4、58.632 8～79.408 3、3.569 4～4.500 6、1.077 6～1.341 5、1.139 7～5.957 0 mg/g。聚類熱圖分析結果顯示，10批樣品可聚為4類，其中S1～S3聚為一類、S4聚為一類、S5～S6聚為一類、S7～S10聚為一類。結論：所建含量測定方法操作簡便、準確性高、專屬性強，結合聚類熱圖分析可用于正心降脂片的質量控制;不同批次樣品的質量存在一定差異。

關鍵詞 正心降脂片;高效液相色譜法;含量測定;聚類熱圖分析

Content Determination of Multiple Indexes in Zhengxin Jiangzhi Tablets and Cluster Heatmap Analysis

CUI Xiaomin1，JIN Yueti2，REN Hui1，HU Jing1，DONG Mingzhi3，HE Fang3，LI Ning1，QU Tong1，CHEN Zhiyong1（1. Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine， Xian 710061， China;2. School of Pharmacy， Xian Medical College， Xian 710021， China; 3. Xian C. P. Pharmaceutical Co.， Ltd.， Xian 710043， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for the content determination of 7 components， such as puerarin， 3′-methoxypuerarin， daidzein， rutin， hesperidin， salvianolic acid A and quercetin， in Zhengxin jiangzhi tablets， and conduct cluster heatmap analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The separation was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelength was set at 280 nm， and the column temperature was 25 ℃. The sample size was 10 μL. Taking the content data as the object， the cluster heatmap was drawn by Hiplot scientific research mapping platform. RESULTS： The linear range of puerarin， 3′-methoxypuerarin， daidzein， rutin， hesperidin， salvianolic acid A and quercetin were 17.00-170.00 （r=0.999 9）， 5.14-51.40 （r=0.999 8）， 3.00-30.00 （r=0.999 8）， 153.00-1 530.00 （r=0.999 9）， 7.88-78.75 （r=0.999 8）， 2.85-28.50 （r=0.999 9） and 11.34-113.40 μg/mL （r=0.999 8）， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and repeatability tests were all less than 2%; the average recoveries were 99.58% （RSD=0.83%， n=6）， 100.31% （RSD=1.17%， n=6）， 100.61% （RSD=1.08%， n=6）， 100.05% （RSD=0.82%， n=6）， 100.31% （RSD=1.38%， n=6）， 100.31% （RSD=0.85%， n=6）， 99.85% （RSD=1.01%， n=6）， respectively. The contents of above components in 10 batches of samples were 7.262 5-8.941 5， 2.464 9-3.068 9， 1.478 9- 1.883 4， 58.632 8-79.408 3， 3.569 4-4.500 6， 1.077 6-1.341 5， 1.139 7-5.957 0 mg/g， respectively. Results of cluster heatmap analysis showed that 10 batches of samples could be divided into 4 categories， including S1-S3 as one category， S4 as one category， S5-S6 as one category and S7-S10 as one category. CONCLUSIONS： The established method is simple， accurate and specific， which can be used for the quality control of Zhengxin jiangzhi tablets， combined with cluster heatmap analysis. There are some differences in the quality of different batches of samples.

KEYWORDS? ?Zhengxin jiangzhi tablets; HPLC; Content determination; Cluster heatmap analysis

正心降脂片由羊紅膻、決明子、何首烏、黃芪、葛根、槐米、陳皮、丹參等8味中藥組成，主要用于臨床治療冠心病患者氣虛血瘀、痰濁蘊結所致的胸痹、心痛、頭痛、眩暈等，現(xiàn)收錄于2020年版《中國藥典》（一部）[1]。葛根中的主要藥效成分葛根素、3′-甲氧基葛根素和大豆苷為異黃酮類成分，具有降血壓、降血脂、降血糖等多種藥理作用[2-4];槐米中的主要成分蘆丁具有改善心肌缺氧、降低膽固醇、抑制血小板集聚、保護神經等藥理作用[5-6]，槲皮素具有抗炎、抗氧化、減輕心肌細胞氧化損傷等作用[7-8];陳皮中的橙皮苷是生物類黃酮化合物之一，有研究證實橙皮苷具有抗炎、抗氧化應激、降血脂、軟化血管、抗過敏等藥理作用[9];丹酚酸A是丹參的主要活性成分之一，具有降血糖、保護心臟等作用[10]。上述化學成分的藥理活性均與冠心病的治療相關，且本課題組前期預實驗結果表明，正心降脂片中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、蘆丁、橙皮苷、丹酚酸A和槲皮素的含量相對較高，可能是該藥的主要活性成分。目前，2020年版《中國藥典》（一部）“正心降脂片”含量測定項下僅有葛根素這一指標。藍日春等[11]建立了正心降脂片中丹參酮ⅡA的含量測定方法，李志平等[12]建立了正心降脂片中羊紅膻、決明子和黃芪等3味藥材中7種成分的含量測定方法，但均是以某一味或者少數(shù)幾味藥材中的若干成分作為質量控制的指標。鑒于中藥制劑的質量控制應體現(xiàn)中藥多組分、多途徑協(xié)同作用的特點[13]，因此現(xiàn)有研究難以全面反映正心降脂片的綜合質量。

聚類熱圖法可對數(shù)據(jù)進行篩選、提取和降維，有利于發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)間潛在的復雜關系[14]。該法除通過橫向聚類來反映樣品的關系外，還可以通過縱向聚類來反映化學成分的關系，并以熱圖顏色的深淺來反映樣品中相應成分含量的高低，能直觀呈現(xiàn)數(shù)據(jù)結果[15]?；诖耍狙芯坎捎酶咝б合嗌V（HPLC）法同時測定了正心降脂片中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、蘆丁、橙皮苷、丹酚酸A和槲皮素的含量，并進行聚類熱圖分析，旨在為全面評價該藥的質量提供參考，亦為保證臨床用藥的安全有效提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260型HPLC儀（美國Agilent公司），KQ-400DE型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司），BT25S型十萬分之一電子分析天平、BS210S型萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

大豆苷對照品（批號wkq20041310）、蘆丁對照品（批號wkq20030203）、3′-甲氧基葛根素對照品（批號wkq20092106）均購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度均大于98%;丹酚酸A對照品（批號MUST- 2103311）、葛根素對照品（批號MUST-21010610）、槲皮素對照品（批號MUST-16031804）、橙皮苷對照品（批號MUST-21030701）均購自成都曼斯特生物有限公司，純度均大于98%;乙腈、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

正心降脂片[批號分別為200401、200402、200403、200904、200905、200906、201208、201209、201210、201211（編號依次為S1～S10），規(guī)格為0.31 g/片（薄膜衣片）;S1～S3樣品的生產時間為2020年4月，S4～S6為2020年9月，S7～S10為2020年12月]均購自西安正大制藥有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）- 0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～40 min，5%A→40%A）;流速為0.8 mL/min;檢測波長為280 nm;柱溫為25 ℃;進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別稱取葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、蘆丁、橙皮苷、丹酚酸A和槲皮素對照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋，制成上述各成分質量濃度分別為170.00、51.40、30.00、1 530.00、78.75、28.50、113.40 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取正心降脂片，除去薄膜衣后粉碎，精密稱取上述樣品粉末0.2 g，置于50 mL具塞三角瓶中，加入75%甲醇25 mL，稱定質量，超聲（功率400 W、頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45 ?m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按正心降脂片處方工藝分別制備缺葛根、陳皮、槐米、丹參的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備各陰性樣品溶液。

2.2.4 空白對照溶液 以75%甲醇為空白對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下各溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結果見圖1。由圖1可知，空白對照不干擾樣品中各成分的測定，各成分、各成分與雜質峰均可實現(xiàn)基線分離，分離度均大于1.5，理論板數(shù)按葛根素峰計均不低于8 000。

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于5 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.4”項下線性范圍下限質量濃度的混合對照品溶液（葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、蘆丁、橙皮苷、丹酚酸A、槲皮素的質量濃度分別為17.00、5.14、3.00、153.00、7.88、2.85、11.34 μg/mL），用75%甲醇逐級稀釋，分別以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1計算檢測限和定量限。結果顯示，葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、蘆丁、橙皮苷、丹酚酸A、槲皮素的檢測限分別為0.07、0.05、0.06、0.10、0.05、0.03、0.07 μg/mL，定量限分別為0.22、0.17、0.19、0.35、0.15、0.10、0.24 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，加75%甲醇稀釋2倍，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、蘆丁、橙皮苷、丹酚酸A和槲皮素峰面積的RSD分別為0.89%、0.86%、0.45%、0.75%、0.76%、0.61%、0.65%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號S8），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、蘆丁、橙皮苷、丹酚酸A和槲皮素峰面積的RSD分別為0.58%、0.70%、0.94%、0.17%、0.25%、0.61%、0.66%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

取正心降脂片樣品（編號S8）粉末，每份0.2 g，精密稱定，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結果顯示，葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、蘆丁、橙皮苷、丹酚酸A和槲皮素含量的RSD分別為0.48%、0.38%、0.88%、0.90%、1.02%、0.90%、0.92%（n=6），表明方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知各成分含量的正心降脂片樣品（編號S8）粉末，每份0.1 g，共6份，分別加入1.70 mg/mL的葛根素對照品溶液0.5 mL、1.285 mg/mL的 3′-甲氧基葛根素對照品溶液0.2 mL、1.00 mg/mL的大豆苷對照品溶液0.2 mL、1.41 mg/mL的蘆丁對照品溶液5.0 mL、0.525 mg/mL的橙皮苷對照品溶液0.75 mL、1.425 mg/mL的丹酚酸A對照品溶液0.1 mL、1.26 mg/mL的槲皮素對照品溶液0.5 mL（取各單一對照品，分別用甲醇溶解并稀釋，即得各單一對照品溶液），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表2。

2.10 樣品含量測定

取10批正心降脂片樣品粉末約0.2 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。每樣品平行測定3次，結果見表3。

2.11 聚類熱圖分析

將10批正心降脂片中7種成分的含量測定結果數(shù)據(jù)經歸一化處理后，導入Hiplot科研繪圖平臺（https：//hiplot.com.cn/），選擇“ward”法，設置距離度量為“euclidean”，繪制聚類熱圖（圖中，顏色由藍到紅代表含量由低到高）。結果顯示，10批樣品可聚為四類，其中S1～S3聚為一類，這3批樣品中槲皮素含量相對較低，蘆丁和橙皮苷含量相對較高;S5～S6聚為一類，這2批樣品中的大部分成分含量均相對較低;S7～S10聚為一類，這4批樣品中葛根素、大豆苷、蘆丁、丹酚酸A和槲皮素的含量均相對較高;S4聚為一類，該批樣品中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和丹酚酸A含量均最高，而蘆丁含量最低。結果見圖2。

3 討論

本課題組前期分別對Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、 Agilent TC-5 C18（250 mm×4. 6 mm，5 μm）、Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）等3種不同色譜柱進行了考察。結果顯示，采用Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）時，各成分的分離效果相對最好且分離時間最短，故選擇Kromasil C18為色譜柱。

本課題組前期分別對不同檢測波長（230、254、280、325 nm）下葛根素等7種成分的色譜響應進行了考察。結果顯示，雖然葛根素等7種成分在254、280 nm波長下均有較強的紫外吸收，均可滿足定量分析的要求，但橙皮苷、丹酚酸A在280 nm波長下的紫外吸收顯著強于254 nm，且橙皮苷在280 nm波長下與鄰近色譜峰的分離度更好，故綜合考慮，最終選擇280 nm為檢測波長。

含量測定結果顯示，葛根素等7種成分的含量分別為7.262 5～8.941 5、2.464 9～3.068 9、1.478 9～1.883 4、58.632 8～79.408 3、3.569 4～4.500 6、1.077 6～1.341 5、1.139 7～5.957 0 mg/g;平均含量從高到低依次為蘆丁>葛根素>橙皮苷>槲皮素>3′-甲氧基葛根素>大豆苷>丹酚酸A。不同批次樣品中，葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、橙皮苷、丹酚酸A的含量較為穩(wěn)定，而蘆丁和槲皮素的含量差異較大。蘆丁和槲皮素為槐米的主要成分[16]，提示槐米對正心降脂片質量穩(wěn)定性的影響可能較大。

聚類熱圖分析結果顯示，10批樣品可聚為4類，其中S1～S3聚為一類、S4聚為一類、S5～S6聚為一類、S7～S10聚為一類。這提示同一時間段生產的樣品（如S1～S3、S5～S6、S7～S10）質量較為一致，這可能與投料藥材的批次較為相近有關，但同一時間段不同批次的樣品（如S4和S5～S6）質量差異較大。經實際生產調研發(fā)現(xiàn)，S1～S3樣品為連續(xù)生產，投料所用藥材批次基本相同;S5～S6樣品所用投料藥材批次完全一致;S7～S10樣品也為連續(xù)生產，投料所用藥材批次也基本相同;S4樣品所用投料藥材除陳皮為同一批次外，其余藥材批次均不相同，提示聚類熱圖分析結果與實際生產情況基本一致。

綜上所述，所建含量測定方法操作簡便、準確性高、專屬性強，結合聚類熱圖分析可用于正心降脂片的質量控制;不同批次樣品的質量存在一定差異。

參考文獻

[ 1 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：789-790.

[ 2 ] 朱衛(wèi)豐，李佳莉，孟曉偉，等.葛屬植物的化學成分及藥理活性研究進展[J].中國中藥雜志，2021，46（6）：1311- 1325.

[ 3 ] 李智穎，范紅艷.葛根素藥理作用的研究進展[J].吉林醫(yī)藥學院學報，2020，41（5）：375-377.

[ 4 ] 謝欣辛，朱全剛，陳中建，等.葛根中大豆苷的高速離心分配色譜法分離純化[J].時珍國醫(yī)國藥，2017，28（10）：2386-2388.

[ 5 ] 韓晶晶，吳俊麗，張峰.蘆丁神經保護作用的研究現(xiàn)狀[J].中國臨床藥理學雜志，2021，37（7）：922-924.

[ 6 ] 馬溶，龐廣昌.蘆丁對現(xiàn)代文明病的作用[J].食品科學，2013，34（7）：307-311.

[ 7 ] 馬納，李亞靜，范吉平.槲皮素藥理作用研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2018，20（8）：221-224.

[ 8 ] CHEKALINA N，BURMAK Y，PETROV Y，et al. Quercetin reduces the transcriptional activity of NF-κB in stable coronary artery disease[J]. Indian Heart J，2018，70（5）：593-597.

[ 9 ] 蒲鵬.橙皮苷改善肥胖小鼠糖脂代謝的機制研究[J].中國中藥雜志，2016，41（17）：3290-3295.

[10] 丁凡，王擁軍，張巖.丹參活性成分的藥理作用和臨床應用研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2021，36（2）：659-662.

[11] 藍日春，韋作干，樊立勇. HPLC測定正心降脂片中丹參酮ⅡA的含量[J].內科，2012，7（4）：406-407.

[12] 李志平，王加良，劉世娟，等.基于一測多評法對正心降脂片中7種成分的質量控制研究[J].西北藥學雜志，2020，35（4）：510-516.

[13] 伍振峰，鄭琴，楊明，等.中藥制劑質量控制的方法模式分析與研究[J].中國中藥雜志，2012，37（9）：1332-1336.

[14] 張琳琳，張文婷，唐登峰，等.基于指紋圖譜、多指標含量測定及化學計量學的寧心寶膠囊質量評價[J].中國藥學雜志，2019，54（17）：1425-1431.

[15] 楊正明，威則日沙，李學學，等.基于多元統(tǒng)計分析的川產道地藥材江油附子和川烏中6種生物堿含量比較研究[J].中草藥，2019，50（6）：1461-1471.

[16] 劉金亮，李隆云，何光華，等. HPLC指紋圖譜結合化學計量學與抗氧化能力評價不同產地槐米的品質[J].中草藥，2018，49（19）：4644-4652.

（收稿日期：2021-06-21 修回日期：2021-10-13）

（編輯：陳 宏）