譚銀豐 孫墨簫 張蕾 楊雯悅 李海龍 李友賓

中圖分類號 R969.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）22-2701-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.03

摘 要 目的：建立測定大鼠血漿中蘆薈苦素濃度的方法，并考察蘆薈苦素的藥動學特征。方法：血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白后，以蘆薈新苷D為內標，采用液相色譜-串聯(lián)質譜法測定大鼠血漿中蘆薈苦素的血藥濃度。以Synergi Hydro-RP為色譜柱，以0.1‰甲酸溶液-甲醇為流動相進行梯度洗脫，流速為0.50 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為5 ?L;采用電噴霧離子源，以多反應監(jiān)測模式進行負離子檢測，用于定量分析的離子對分別為m/z 393.1→272.9（蘆薈苦素）、m/z 555.3→144.9（內標）。采用上述方法測定大鼠尾靜脈注射（3.35 mg/kg）和灌胃（16.75 mg/kg）蘆薈苦素后0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2.5、4、6、8、10 h靜脈血中蘆薈苦素的質量濃度，采用DAS 3.0軟件計算藥動學參數(shù)。結果：蘆薈苦素檢測質量濃度的線性范圍為1～600 ng/mL（r=0.994 5），定量下限為1 ng/mL，批內、批間RSD均小于15%，批內、批間準確度在±15%內，基質因子為（92.74±4.33）%～（94.84±2.57）%，提取回收率為（69.04±2.13）%～（75.03±2.84）%，穩(wěn)定性試驗的實測結果與理論值的偏差在±15%內。大鼠靜脈注射和灌胃蘆薈苦素后，主要藥動學參數(shù)cmax分別為（10 693.3±2 745.3）、（223.3±36.2） ng/mL，t1/2分別為（2.45±1.45）、（3.33±1.91） h，AUC0-24 h分別為（4 190.6±883.6）、（1 210.1±93.9） ng·h/mL（n=3），口服絕對生物利用度為11.13%。結論：本研究成功建立了一種快速、靈敏的蘆薈苦素血藥濃度測定方法，適用于其藥動學研究。

關鍵詞 蘆薈苦素;蘆薈新苷D;血藥濃度;藥動學;液相色譜-串聯(lián)質譜法;大鼠

Determination of Aloesin in Rat Plasma by LC-MS/MS and Its Pharmacokinetic Study

TAN Yinfeng，SUN Moxiao，ZHANG Lei，YANG Wenyue，LI Hailong，LI Youbin（School of Pharmacy， Hainan Medical University/Hainan Provincial Key Laboratory for Research and Development of Tropical Herbs/Haikou Key Laboratory of Li Nationality Medicine， Haikou 571159， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the determination of aloesin in plasma of rats， and to investigate pharmacokinetic characteristics of aloesin. METHODS： The plasma samples were precipitated with methanol. Using aloeresin D as internal standard， the plasma concentration of aloesin was determined by LC-MS/MS. The determination was performed on Synergi Hydro-RP column with mobile phase consisted of 0.1‰ formic acid-methanol （gradient elution） at the flow rate of 0.50 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 5 ?L. The electrospray ionization source was applied to carry out negative ion detection with multiple reaction monitoring mode. The ion transitions for quantitative analysis were m/z 393.1→272.9 （aloesin） and m/z 555.3→144.9 （internal standard）， respectively. The concentration of aloesin in venous blood was determined by above method at 0.083， 0.167， 0.333， 0.667， 1， 1.5， 2.5， 4， 6， 8， 10 h after intravenous injection （3.35 mg/kg） and intragastric administration （16.75 mg/kg） of aloesin. DAS 3.0 software was used to calculate pharmacokinetic parameters.? RESULTS： The linear range of aloesin were 1-600 ng/mL （r=0.994 5）. The lower limit of quantification was 1 ng/mL， and RSDs of within and between batches were less than 15%; accuracies within and between batches were within ±15%. The matrix factors were （92.74±4.33）%-（94.84±2.57）%， and extraction recoveries were （69.04±2.13）%-（75.03±2.84）%; the deviation between the measured results of the stability test and the theoretical values were within±15%. After intravenous injection and intragastric administration of aloesin， main pharmacokinetic parameters were as follows： cmax were （10 693.3±2 745.3） and （223.3±36.2） ng/mL; t1/2 were （2.45±1.45） and （3.33±1.91） h; AUC0-24 h were （4 190.6±883.6） and （1 210.1±93.9） ng·h/mL （n=3）. Absolute bioavailabi- lity was 11.13%. CONCLUSIONS： The established method is rapid and sensitive for plasma determination of? aloesin， and suitable for its pharmacokinetic study.

KEYWORDS? ?Aloesin; Aloeresin D; Plasma concentration; Pharmacokinetics; LC-MS/MS; Rats

蘆薈苦素是一種色酮苷類物質，存在于多種百合科蘆薈屬植物中，在蘆薈中的含量約為3‰[1]。蘆薈為百合科植物庫拉索蘆薈Aloe barbadensis Miller、好望角蘆薈Aloe ferox Miller或其他同屬近緣植物葉的汁液濃縮干燥物，具有瀉下通便、清肝瀉火、殺蟲療疳之功效[2-3]。相關研究顯示，蘆薈苦素是蘆薈的重要活性物質之一[4-5]，其主要功效如下：（1）抑制酪氨酸酶活性，阻止黑色素的合成，具有美白功效[6];（2）調節(jié)細胞炎癥因子和生長因子的釋放，具有抗炎作用[7];（3）誘導Sam蛋白、Mad蛋白及其類似蛋白（Smad）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活，促進傷口愈合[7];（4）激活Wnt信號通路，下調Notch信號通路，調節(jié)消化系統(tǒng)功能，改善結腸炎模型大鼠的病理狀態(tài)[8-9];（5）促進脂聯(lián)素分泌，調節(jié)糖脂代謝，具有抗糖尿病作用[10]。毒理學研究表明，蘆薈苦素基本無毒副作用[11]。藥動學屬性是評估活性化合物成藥性的重要指標，然而，針對蘆薈苦素的藥動學研究很少，有關報道僅采用二維液相色譜法測定了蘆薈苦素的含量，并沒有提供其具體的藥動學參數(shù)，所用分析技術相對落后且操作繁瑣[12]。本文擬采用液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）法測定大鼠血漿中蘆薈苦素的濃度，并考察其藥動學特征，為蘆薈苦素的成藥性研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Nexera XR型超高效液相色譜（UHPLC）儀（日本Shimadzu公司）、AB-SCIEX API 4000+型串聯(lián)四極桿質譜儀及配備的Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件（美國Applied Biosystem公司）、5922型冷凍離心機（日本Kubota公司）、XS105DU型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、LabTower EDI15型超純水一體機（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Vibrax型圓周振蕩器（德國Ika公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

蘆薈苦素對照品（批號20190530，純度≥98%）購自昊?；瘜W（上海）有限公司;蘆薈新苷D對照品（內標，批號19072605，純度≥98%）購自成都普菲德生物技術有限公司;異氟烷（批號2018/08）購自北京吉安得爾科技有限公司;甲醇（色譜級）購自德國Merck公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為7周齡SPF級SD雄性大鼠，共6只，體質量為243～300 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，生產許可證號為SCXK（湘）2014-0011。所有大鼠均在溫度（22±2）℃、相對濕度40%～70%、12 h明暗交替的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進食、飲水。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

以Synergi Hydro-RP（2.10 mm×50 mm，4 ?m）為色譜柱，以0.1‰甲酸溶液（A）-甲醇（B）為流動相進行梯度洗脫（0～0.50 min，5%B;0.51～3.00 min，5%B→90%B;3.01～4.00 min，90%B;4.01～5.00 min，5%B）;流速為0.50 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為5 ?L。采用電噴霧離子源（ESI），以多反應監(jiān)測模式（MRM）進行負離子檢測;噴霧電壓為4 500 V;離子源氣體1（氮氣）壓力為50 psi;離子源氣體2（氮氣）壓力為50 psi;氣簾氣（氮氣）壓力為30 psi;噴霧溫度為550 ℃;碰撞氣壓力為2 psi。蘆薈苦素及內標的質譜參數(shù)見表1，二級質譜圖及化學結構式見圖1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 蘆薈苦素貯備液 取蘆薈苦素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解、稀釋，制成質量濃度為0.1 mg/mL的貯備液，于4 ℃下保存，備用。臨用時，用甲醇稀釋至所需質量濃度即可。

2.2.2 內標溶液 取內標對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解、稀釋，制成質量濃度為50 ng/mL的內標溶液，于4 ℃下保存，備用。

2.3 血漿樣品的處理

取血漿樣品50 ?L，置于離心管中，加入內標溶液150 ?L，以2 000 r/min渦旋10 min，充分沉淀蛋白，再于4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，取上清液置于微量進樣管中，進行LC-MS/MS分析。

2.4 方法學考察

按2020年版《中國藥典》（四部）通則“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求，進行方法學考察[13]。

2.4.1 專屬性考察 取不同來源的大鼠空白血漿、空白血漿+蘆薈苦素（1 ng/mL）、靜脈注射給藥8 h時經(jīng)眼眶靜脈采集到的大鼠血漿樣品、灌胃給藥8 h時經(jīng)眼眶靜脈采集到的大鼠血漿樣品，按“2.3”項下方法處理（空白血漿不加內標）后，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄色譜圖（圖2）。結果顯示，蘆薈苦素、內標的出峰時間分別約為1.85、2.67 min，分離效果良好，內源性物質對測定無干擾，表明本方法專屬性良好。

2.4.2 線性關系與定量下限考察 取空白血漿，分別加入0.1 mg/mL的蘆薈苦素貯備液適量，配制成質量濃度分別為600、400、200、40、10、2、1 ng/mL的系列標準曲線血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積。以待測物與內標的峰面積之比（y）為縱坐標、待測物的質量濃度（x）為橫坐標，采用加權最小二乘法（權重為1/x2）進行線性回歸，得回歸方程為y=0.006 17x+0.001 13（r=0.994 5）。結果顯示，蘆薈苦素在1～600 ng/mL質量濃度范圍內與峰面積成良好的線性關系，定量下限為1 ng/mL。

2.4.3 準確度與精密度試驗 取空白血漿，分別加入0.1 mg/mL的蘆薈苦素貯備液適量，配制成定量下限質量濃度（1 ng/mL）和低、中、高質量濃度（3、50、500 ng/mL）的質控血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積，根據(jù)隨行回歸方程計算實測質量濃度。每個質量濃度平行分析5個樣品，考察批內精密度[以相對標準差（RSD）表示，下同]和批內準確度[以實測質量濃度的均值與理論質量濃度的相對誤差（RE）表示，下同];于3 d內分析3個分析批，考察批間精密度和批間準確度。結果見表2。

2.4.4 殘留效應考察 取“2.4.2”項下標準曲線線性范圍上限的血漿樣品（蘆薈苦素質量濃度為600 ng/mL）適量，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析;隨后取空白血漿樣品適量，不加內標，同法處理后進樣分析，考察殘留效應。結果顯示，蘆薈苦素的殘留峰面積小于定量下限質量濃度質控血漿樣品蘆薈苦素峰面積的20%，內標的殘留峰面積小于上述質控血漿樣品內標峰面積的5%，表明本方法殘留效應符合要求[13]。

2.4.5 稀釋可靠性考察 用空白血漿配制蘆薈苦素質量濃度為15 000 ng/mL的稀釋質控樣品，再用空白血漿稀釋30倍（稀釋后的理論質量濃度為500 ng/mL）后，按“2.3”項下方法處理，再按“2.1”項下條件進樣分析，考察稀釋可靠性。共平行分析5個樣品。結果顯示，經(jīng)稀釋后質控樣品的準確度（RE）在±15%內。

2.4.6 基質效應和提取回收率試驗 按文獻[14-15]方法考察基質效應和提取回收率。取不同來源的大鼠空白血漿適量，按“2.4.3”項下方法配制蘆薈苦素低、中、高質量濃度（3、50、500 ng/mL）的質控血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積A1（以內標峰面積進行歸一化處理，下同）。用甲醇配制蘆薈苦素和內標質量濃度與前者對應的標準溶液，按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積A2。取按“2.3”項下方法處理后的大鼠空白血漿適量，配制蘆薈苦素和內標質量濃度與前者對應的血漿樣品，按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積A3。每個質量濃度平行分析5個樣品，并按如下公式計算基質因子和提取回收率，基質因子=A3/A2×100%，提取回收率=A1/A3×100%。結果見表3。

2.4.7 穩(wěn)定性考察 取空白血漿適量，按“2.4.3”項下方法配制蘆薈苦素低、中、高質量濃度（3、50、500 ng/mL）的質控血漿樣品，分別考察樣品在下列情況下存放的穩(wěn)定性：①樣品按“2.3”項下方法處理后放置于自動進樣器（25 ℃）中8 h，進樣分析;②樣品經(jīng)反復凍融（-20～25 ℃）3次后再同法處理，進樣分析;③樣品在室溫下放置4 h后再同法處理，進樣分析;④樣品在-20 ℃下存放15 d后再同法處理，進樣分析。每個質量濃度平行制備20份，每種情況各5份，按“2.4.3”項下方法計算RE。結果見表4。

2.5 藥動學實驗

取SD大鼠6只，適應性飼養(yǎng)5 d，并于給藥前禁食不禁水12 h。取3只大鼠經(jīng)尾靜脈注射蘆薈苦素3.35 mg/kg（溶劑為生理鹽水），另取3只大鼠灌胃蘆薈苦素16.75 mg/kg（溶劑為生理鹽水），劑量參考文獻[12]并結合檢測方法的定量下限設置。分別于給藥后0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2.5、4、6、8、10 h經(jīng)眼眶靜脈采血約0.1 mL，置于預先用肝素鈉溶液潤洗的離心管中，以4 000 r/min離心10 min，取血漿于-80 ℃下保存。在定量分析時，用空白血漿將上述血漿樣品稀釋至蘆薈苦素線性范圍內，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積，根據(jù)隨行回歸方程計算質量濃度。采用DAS 3.0軟件繪制藥-時曲線，并計算藥動學參數(shù)。結果顯示，給藥8 h后，靜脈注射或灌胃給藥大鼠血漿中蘆薈苦素的質量濃度均低于定量下限（1 ng/mL），蘆薈苦素在大鼠體內的口服絕對生物利用度[（灌胃AUC0-∞×靜脈注射劑量）/（靜脈注射AUC0-∞×灌胃劑量）×100%）為11.13%，詳見圖3（給藥8 h后的數(shù)據(jù)略）、表5。

3 討論

蘆薈苦素是極性較大的化合物，易溶于水，在開發(fā)LC-MS/MS定量分析方法的過程中，筆者曾使用Kinetex XB-C18（2.10 mm×50 mm，2.6 ?m）進行分離，結果顯示，蘆薈苦素在0.5 min左右即出峰，且色譜峰峰形較差。經(jīng)過篩選，筆者改用對極性化合物有更好分離效果的Synergi Hydro-RP（2.10 mm×50 mm，4 ?m）進行分離，結果顯示，蘆薈苦素的分離效果較好，滿足實驗要求。

本研究前期使用了葒草苷作為蘆薈苦素定量分析的內標化合物，因為該成分與蘆薈苦素都是碳苷，結構差異主要在于葒草苷苷元是黃酮。然而，葒草苷的極性比蘆薈苦素小，在甲醇中的溶解度低于1 mg/mL，色譜峰拖尾嚴重，筆者通過在流動相中加入甲酸以改善峰形，卻導致蘆薈苦素出現(xiàn)前延峰，表明葒草苷不適合用作蘆薈苦素定量分析的內標化合物。經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)，蘆薈新苷D和蘆薈苦素都是從蘆薈中分離得到的色酮苷類化合物，且化學性質相近[1]。本研究結果表明，蘆薈新苷D適宜用作蘆薈苦素定量分析的內標化合物。

本研究通過LC-MS/MS法測定不用給藥方式下大鼠血漿中蘆薈苦素的藥動學參數(shù)發(fā)現(xiàn)，蘆薈苦素在大鼠體內的口服絕對生物利用度為11.13%。由此推測，蘆薈苦素的親水性分子結構可能阻礙了其跨膜轉運，減少了其體內吸收，提示在蘆薈苦素的后續(xù)藥物研發(fā)中應通過結構改造、制劑研究或其他方法來提升其有效血藥濃度，提高其生物利用度。

綜上所述，本研究成功建立了一種快速、靈敏的蘆薈苦素血藥濃度測定方法，并適用于該化合物的藥動學研究。

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（收稿日期：2021-07-01 修回日期：2021-10-09）

（編輯：鄒麗娟）