宋佳寶，劉煜光，周曉慧，趙丹，史寶勝

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000)

光系統(tǒng)活性是植物生長(zhǎng)過(guò)程中的一項(xiàng)敏感指標(biāo)，葉綠素?zé)晒鈪?shù)能夠反映植物葉片的光合效應(yīng)以及熱耗散等情況，進(jìn)而有效評(píng)估逆境對(duì)光合作用損傷的相關(guān)機(jī)制[1]。熱脅迫是一項(xiàng)重要的環(huán)境脅迫因素，發(fā)生在整個(gè)光合機(jī)構(gòu)，阻礙線性電子及環(huán)式電子傳遞，導(dǎo)致植物光系統(tǒng)Ⅱ活性衰減，被不可逆損壞[2-3]?；ㄉ剀帐遣嗜~植物呈色的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，已有研究證明花色素苷能夠減弱過(guò)量ROS(活性氧自由基)的產(chǎn)生，保護(hù)處于逆境中植物的光合機(jī)構(gòu)[4]。

日本晚櫻(Cerasusserrulata)、日本櫻花(C.yedo-ensis)為薔薇科(Rosaceae)櫻屬(CerasusMill.)植物，紫葉矮櫻(Prunus×cistena)為薔薇科李屬(PrunusL.)植物，樹(shù)形優(yōu)美，花開(kāi)絢麗，芳香四溢，在城鄉(xiāng)綠化美化、山地邊坡治理中應(yīng)用廣泛，具有極高的生態(tài)、觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，對(duì)于3種植物的研究主要集中在栽培繁殖技術(shù)[5]、生物學(xué)習(xí)性[6]、遺傳關(guān)系[7]等方面。前人對(duì)3種植物的耐旱性[8-9]、抗污染物能力[10]等已經(jīng)開(kāi)展了豐富的研究，但主要集中在生化指標(biāo)的測(cè)定方面，葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合特性對(duì)熱脅迫的響應(yīng)規(guī)律未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。因此，本研究以日本晚櫻、日本櫻花及富含花色素苷的紫葉矮櫻為研究材料，采用人工控制熱脅迫溫度和時(shí)間，探討熱脅迫下3種植物葉片熒光特性和色素含量及其他生理指標(biāo)的變化情況和相關(guān)性，旨在揭示熱脅迫下其植物葉片光合響應(yīng)機(jī)制及花色素苷對(duì)熱脅迫傷害的協(xié)調(diào)保護(hù)機(jī)制，為耐熱優(yōu)質(zhì)品種選育提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)設(shè)在河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地位(38°48′26.13″N、115°24′58.30″E)，屬暖溫帶亞濕潤(rùn)氣候，年平均氣溫12.7 ℃，年均降水量575.4 mm，年日照時(shí)數(shù)為2 560 h，年平均蒸發(fā)量1 760 mm，無(wú)霜期200 d，土壤類型為壤土，pH值7.6。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年9月底進(jìn)行。供試材料為7～8 a生生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的日本晚櫻、紫葉矮櫻、日本櫻花，每種植物選取3株植株，每株間距3 m。所選植株四周無(wú)高大喬木和灌木遮陰，土壤氣候條件一致。每植株采摘向陽(yáng)主枝頂端起第4～8葉序葉片，取樣葉片須完全展開(kāi)，且無(wú)病蟲(chóng)害。采摘后，迅速置于濕毛巾中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將采摘的3種植物的葉片置于內(nèi)鋪濕潤(rùn)濾紙的封口聚乙烯薄膜袋中，利用恒溫水浴鍋在完全避光條件下進(jìn)行加熱。測(cè)量溫度為(25±0.2)、(30±0.2)、(33±0.2)、(36±0.2)、(39±0.2)、(42±0.2)、(45±0.2)、(48±0.2)、(51±0.2)℃，將溫度計(jì)置于水中，使玻璃泡與葉片浸沒(méi)于同一高度，確保溫度的準(zhǔn)確性。處理時(shí)間為5、25、45 min。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

將不同處理下的葉片用葉夾進(jìn)行暗適應(yīng)30 min后，采用FluorPen手持式葉綠素?zé)晒鈨x(PSI，捷克)測(cè)定葉片快相葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線(OJIP)，測(cè)定時(shí)下鋪濕潤(rùn)濾紙，盡可能減少葉片水分流失對(duì)葉片測(cè)定參數(shù)帶來(lái)的影響。每處理選取5個(gè)葉片的相應(yīng)位置打取葉圓片作為5次重復(fù)，記錄葉綠素?zé)晒鈪?shù)(表1)。

表1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)及含義

1.4.2 葉綠素含量的測(cè)定

熱脅迫處理后，每個(gè)處理每個(gè)重復(fù)均選取適量葉片，迅速擦凈、去主脈，然后剪碎混勻。每處理稱取0.1g葉片，3次重復(fù)。用95%乙醇作浸提液，置于暗處24h提取色素，用Thermo10S分光光度計(jì)(Cole-Parmer，美國(guó))分別測(cè)定665、649、470nm處吸光值，用Arnon法修正公式計(jì)算葉綠素a(mg/g)、葉綠素b(mg/g)的含量[11]。

1.4.3 花色素苷含量的測(cè)定

花色素苷含量的測(cè)定按照Pirie等[12]的方法。稱取適量葉片，用體積比1%鹽酸甲醇溶液浸提，提取液分別于600、530、325、280nm處測(cè)定吸收值，以O(shè)D530～600 nm=0.1作1個(gè)單位，以U表示。

1.4.4 葉色的測(cè)定

采用全自動(dòng)色彩色差計(jì)CR-400(柯尼卡美能達(dá)，日本)每個(gè)處理重復(fù)測(cè)定3次。測(cè)定指標(biāo)包括L*、a*、b*，其中L*表示光澤明亮度；a*值表示色澤紅綠程度；b*的正值表示黃色程度。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

運(yùn)用Excel 2010和SPSS 26.0軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖及分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 瞬時(shí)熱脅迫對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.1.1 對(duì)初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)的影響

與25 ℃對(duì)照相比，5 min熱脅迫下紫葉矮櫻Fo值隨脅迫溫度的升高而不斷增加，51 ℃脅迫下的Fo值與CK差異顯著(P<0.05)(圖1A)；日本晚櫻、日本櫻花分別在48 ℃、51 ℃時(shí)差異達(dá)到顯著水平(圖1B、圖1C)。當(dāng)脅迫時(shí)間延長(zhǎng)至25和45 min，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花Fo值開(kāi)始顯著增加的溫度分別為48 、45 和45 ℃，與5 min熱脅迫處理相比均降低3 ℃。本試驗(yàn)中，熱脅迫提高了紫葉矮櫻、日本晚櫻葉片的Fo值，表明其葉片PS Ⅱ反應(yīng)中心遭到破壞，且破壞程度隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)和脅迫溫度升高而增加。

圖1 不同熱脅迫處理3種植物Fo值的變化

隨著溫度的升高，紫葉矮櫻、日本晚櫻Fm值表現(xiàn)出先升后降的“單峰”變化趨勢(shì)(圖2A、2B)：與對(duì)照相比，紫葉矮櫻Fm值在36 ℃達(dá)到峰值，隨后又逐漸下降，最終降低至較低水平；日本晚櫻Fm值在33 ℃左右達(dá)到峰值，之后不斷降低，至42 ℃以上迅速降低。日本櫻花Fm值在熱脅迫下的變化則呈“上升(30 ℃)-下降(36 ℃)-上升(42 ℃)-下降(51 ℃)”的雙峰型曲線(圖2C)。Fm值可以反映PS Ⅱ電子傳遞情況。較高溫度的熱脅迫使3種試材Fm值顯著減小，表明高溫阻礙葉片中PS Ⅱ電子傳遞。

圖2 不同熱脅迫處理3種植物Fm值的變化

2.1.2 對(duì)最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響

熱脅迫5 min處理下，隨著溫度的升高3種試材的Fv/Fm值呈緩慢下降趨勢(shì)，至45 ℃以上Fv/Fm值迅速降低；脅迫時(shí)間延長(zhǎng)至25 min和45 min，紫葉矮櫻、日本晚櫻的Fv/Fm值在溫度升高至45 ℃以上就迅速降低，日本櫻花在脅迫溫度達(dá)到39 ℃以上時(shí)Fv/Fm值迅速降低，與5 min相比均有所提前(圖3)?？梢?jiàn)，45 ℃以上的瞬時(shí)熱脅迫會(huì)顯著降低3種試材PS Ⅱ原初光能化學(xué)轉(zhuǎn)換率。

圖3 不同熱脅迫處理3種植物Fv/Fm的變化

2.1.3 對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心活性參數(shù)的影響

由表2可知，5 min和25 min的較短時(shí)間脅迫下，與25 ℃對(duì)照相比，39～51 ℃的高溫處理使3種植物的ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC值顯著升高，而在45 min較長(zhǎng)時(shí)間的51 ℃高溫脅迫下3種植物的ETO/RC值顯著降低。25 min和45 min脅迫時(shí)間下ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC、ETO/RC值發(fā)生顯著變化時(shí)的溫度(39～42 ℃)與5 min脅迫時(shí)間下(45～51 ℃)相比有所提前，幅度為3～6 ℃。最高熱脅迫溫度和最長(zhǎng)熱脅迫時(shí)間組合處理下，與對(duì)照相比，紫葉矮櫻的ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC值變幅最小，日本晚櫻的ETO/RC值變幅最大。

表2 不同熱脅迫處理3種植物PSⅡ反應(yīng)中心活性參數(shù)的變化

2.1.4 對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ能量分配比率的影響

由圖4可知：隨著熱脅迫溫度的升高，經(jīng)45～51 ℃高溫處理后的3種植物葉片φPo值顯著下降、φDo值顯著增加；φEo隨著脅迫溫度升高呈降低、升高再降低的趨勢(shì)，脅迫程度最大，即51 ℃高溫處理45 min時(shí)的值顯著低于對(duì)照值，分別降低41.6%、77.0%、67.0%；隨溫度增加，日本晚櫻ψo(hù)先降低后升高，日本櫻花和紫葉矮櫻ψo(hù)值先升高后降低，經(jīng)51 ℃熱脅迫后，3種植物ψo(hù)值均顯著低于對(duì)照，降幅為19.8%、65.3%、32.5%。這表明，高溫脅迫下，葉片光系統(tǒng)通過(guò)增加熱耗散、調(diào)節(jié)PSⅡ能量分配比率以適應(yīng)熱脅迫。

圖4 不同熱脅迫處理3種植物葉片PSⅡ能量分配比率的變化

2.2 瞬時(shí)熱脅迫對(duì)葉綠素含量的影響

隨著熱脅迫溫度的升高，與25 ℃(對(duì)照)相比，5 min熱脅迫時(shí)間處理下，紫葉矮櫻的葉綠素含量呈現(xiàn)先緩慢上升再顯著下降的趨勢(shì)(圖5A)，日本晚櫻和日本櫻花的葉綠素含量表現(xiàn)為下降趨勢(shì)(圖5B、圖5C)，經(jīng)33 ℃的熱脅迫后，3種植物葉片葉綠素含量與對(duì)照相比均顯著降低；脅迫時(shí)間延長(zhǎng)20 min后，紫葉矮櫻葉綠素含量先波動(dòng)變化(25～36 ℃)再顯著降低，日本晚櫻和日本櫻花的葉綠素含量逐漸降低；45 min的熱脅迫下，日本晚櫻和日本櫻花經(jīng)過(guò)30 ℃熱脅迫后的葉綠素含量與對(duì)照相比顯著降低(P<0.05)，紫葉矮櫻發(fā)生這個(gè)過(guò)程的溫度為33 ℃，與其他2種櫻花相比溫度有所升高。最高熱脅迫溫度和最長(zhǎng)熱脅迫時(shí)間組合處理下，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花葉綠素含量較對(duì)照分別降低44.5%、70.3%、69.2%，試驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)高溫?zé)崦{迫后紫葉矮櫻葉片的葉綠素含量降低的幅度最小。

圖5 不同熱脅迫處理3種植物葉綠素含量的變化

熱脅迫下，3種植物葉綠素a、葉綠素b含量逐漸減少，隨著脅迫溫度的升高和脅迫時(shí)間的增加，3種植物葉綠素a/b含量總體呈升高趨勢(shì)，溫度達(dá)到45～51 ℃，3種植物經(jīng)歷一個(gè)先降后增的過(guò)程(圖6)。5 min熱脅迫時(shí)間處理下，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花葉綠素a/b值出現(xiàn)降低情況的溫度為51 ℃、51 ℃、42 ℃；25 min處理下的拐點(diǎn)溫度分別為51 ℃、45 ℃、45 ℃；45 min處理下則提前至48 ℃、45 ℃、42 ℃。51 ℃處理下3種植物葉綠素a/b分別增加23.2%、30.7%、45.5%，紫葉矮櫻增幅最小。

圖6 不同熱脅迫處理3種植物葉綠素a含量/葉綠素b含量的變化

2.3 瞬時(shí)熱脅迫對(duì)葉片花色素苷含量的影響

同一脅迫時(shí)間下，3種植物葉片花色素苷含量隨溫度的升高而減少；同一溫度下，花色素苷含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少(圖7)。當(dāng)脅迫程度達(dá)到最大，即脅迫溫度為51 ℃、脅迫時(shí)間為45 min時(shí)，紫葉矮櫻、日本晚櫻、日本櫻花花色素苷含量分別為對(duì)照的66.6%、17.3%、16.7%。這說(shuō)明高溫在一定程度上影響3種植物葉片中花色素苷的合成或分解，而紫葉矮櫻的花色素苷熱穩(wěn)定性最高。

圖7 不同熱脅迫處理3種植物花色素苷含量的變化

2.4 瞬時(shí)熱脅迫對(duì)3種植物葉色的影響

隨熱脅迫溫度的升高和熱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，3種植物葉片L*逐漸降低，a*值逐漸增加，b*值有所降低(表3)。當(dāng)熱脅迫程度達(dá)到最大(51 ℃、45 min組合處理)時(shí)，與對(duì)照相比，日本晚櫻、紫葉矮櫻、日本櫻花L*值分別降低19.81%、10.06%、11.17%，a*值分別增加31.15%、25.57%、48.73%，b*值分別降低56.69%、3.08%、25.4%。表明高溫能夠降低3種植物葉片的亮度，提高葉片紅綠比值，降低黃藍(lán)比值，使呈色偏向紅色。3種植物中，紫葉矮櫻葉色參數(shù)的變化最小。

3 討論

3.1 瞬時(shí)高溫脅迫誘導(dǎo)植物光系統(tǒng)活性的降低

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是在生理生化水平上了解熱脅迫和熱脅迫耐受性的重要指標(biāo)。植物PS Ⅱ?qū)δ婢趁{迫非常敏感，在植物正常生理?xiàng)l件下，其潛在的PS Ⅱ光化學(xué)效率Fv/Fm變化很小，而逆境條件下該參數(shù)則會(huì)明顯降低[13]。已有研究結(jié)果表明，高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物葉片F(xiàn)o增加，F(xiàn)m、Fv/Fm顯著下降[14]。本研究與上述結(jié)果一致。說(shuō)明PS Ⅱ反應(yīng)中心及放氧復(fù)合體OEC受高溫影響失活，抑制QA向QB的電子傳遞，受體側(cè)電子QA不斷積累，PS Ⅱ穩(wěn)定性降低，進(jìn)而影響植物的光合功能[15-16]。此外發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v/Fm在受到較低溫度(25～45 ℃)的熱脅迫和高溫?zé)崦{迫(45 ℃以上)時(shí)下降程度不一，45 ℃以后顯著下降，推測(cè)3種植物在受到45 ℃以下的較低溫度脅迫時(shí)，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)補(bǔ)光天線系統(tǒng)的方式減少PS Ⅱ供給側(cè)激發(fā)能的積累或利用其他方式來(lái)減少光系統(tǒng)傷害程度；在高溫?zé)崦{迫逆境下，葉綠素穩(wěn)定性遭到破壞，電子傳遞鏈?zhǔn)軗p，光化學(xué)效率降低以配合CO2同化能力的降低，PS Ⅱ受到破壞。日本櫻花經(jīng)過(guò)連續(xù)45 min的48 ℃的熱脅迫后，φPo、Fv/Fm降為0，與油菜(BrassicanapusL.)經(jīng)高溫脅迫后的結(jié)果一致[17]，進(jìn)一步說(shuō)明重度高溫脅迫致使葉片光系統(tǒng)Ⅱ發(fā)生不可逆損害。

表3 不同熱脅迫處理下3種植物L(fēng)*、a*、b*的變化

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種植物在受短暫高溫脅迫后比活性參數(shù)與初始值無(wú)顯著差異，說(shuō)明它們通過(guò)調(diào)節(jié)自身對(duì)光能的吸收、捕獲、傳遞和耗散，最終獲得較高的光能轉(zhuǎn)換能力，PS Ⅱ活動(dòng)能夠正常進(jìn)行[18]。ABS/RC、DIO/RC、TRO/RC值在最大熱脅迫程度下迅速升至高水平，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間(45 min)的高溫(51 ℃)處理致使3種植物因熱耗散不足而導(dǎo)致光能過(guò)剩，使得PS Ⅱ產(chǎn)生光抑制，光合機(jī)構(gòu)被不可逆的損壞。而φDo升高，說(shuō)明3種植物葉片通過(guò)提高熱耗散將過(guò)剩的光能散失，從而達(dá)到降低高溫傷害的目的，這也是3種植物自我保護(hù)的體現(xiàn)。隨高溫脅迫時(shí)間的增加，葉片φEo下降，說(shuō)明高溫使QA傳遞受阻。當(dāng)脅迫溫度超過(guò)45 ℃，這3種植物的φEo閾值存在差異，紫葉矮櫻明顯更低，說(shuō)明其電子傳遞能力更強(qiáng)，光合效率更高。

3.2 花色素苷對(duì)光系統(tǒng)具有保護(hù)作用

不同植物對(duì)熱脅迫處理的生理反應(yīng)明顯不同。紫葉矮櫻的Fo值及變幅、Fv/Fm的降幅最小，說(shuō)明其耐熱性較高，這可能與花色素苷的保護(hù)作用有關(guān)，即當(dāng)植物葉片吸收光能出現(xiàn)過(guò)剩時(shí)，葉片中大量的花色素苷可以通過(guò)吸收和過(guò)濾藍(lán)紫光，減輕葉片光抑制和光氧化傷害程度[19]。張會(huì)慧等研究證明，花色素苷能夠改變丁香葉片吸收和利用光能的途徑及耗散過(guò)剩光能的方式[20]。富含花色素苷的紫葉矮櫻的ABS/RC、ETo/RC、TRo/RC和DIo/RC低于花色素苷含量較低的日本晚櫻和日本櫻花，由此推測(cè)：紫葉矮櫻葉片因花色素苷的大量存在而減輕吸收的光能，對(duì)緩解高溫對(duì)PS Ⅱ反應(yīng)中心的破壞具有積極作用。

高等植物光系統(tǒng)Ⅱ的補(bǔ)光天線(LHCⅡ b)是捕光色素蛋白復(fù)合物，代表葉綠素b向葉綠素a的能量傳遞，高溫使LHCⅡ b穩(wěn)定性降低，葉綠素a/b增加[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫葉矮櫻葉綠素a/b的的變幅最小，可能是因?yàn)槠淙~片中存在大量的花色素苷，能夠減少高溫對(duì)LHCⅡ的影響，進(jìn)而使葉綠素a/b增加速度減緩[23]。這也印證了紫葉矮櫻耐熱性優(yōu)于日本晚櫻和日本櫻花的說(shuō)法。

總的來(lái)說(shuō)，紫葉矮櫻葉片中較高含量的花色素苷可改變其對(duì)光能的吸收，從而具有有效緩解熱脅迫造成的光抑制、減輕熱脅迫對(duì)葉片光合機(jī)構(gòu)尤其是PS Ⅱ反應(yīng)中心的傷害、降低對(duì)細(xì)胞中葉綠素的破壞程度、保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的作用，這可能是紫葉矮櫻對(duì)高溫?zé)崦{迫具有較強(qiáng)抗性的原因之一。