■馬中華 施力光 符清瑤 侯曉曉 楊 文 姬孟瑤 姜宏正 荀文娟*

（1.海南大學動物科技學院，海南海口 570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州 571737）

免疫應激是導致斷奶仔豬生長階段腹瀉率高以及生長性能降低的主要原因，這也是豬生產(chǎn)中需要攻克的難點[1]。生產(chǎn)上主要應用抗生素和氧化鋅來對抗動物炎癥反應，抑制病原微生物的生長，從而提高生長性能。但由于抗生素引發(fā)的動物機體耐藥性和殘留等問題，我國已經(jīng)從2020年7月起開始全面禁抗[2]，并且目前推行的氧化鋅等相關飼料添加劑留下的重金屬殘留對環(huán)境的污染也越來越受到人們的質(zhì)疑。因此，在當今豬生產(chǎn)領域迫切需要一種飼料添加劑在無抗條件下用于緩解仔豬腹瀉、促進仔豬健康生長。

近年來，植物提取物的活性成分逐漸受到國內(nèi)外學者的關注。大黃素作為眾多蒽醌類衍生物的一種，主要來源于蓼科植物掌葉大黃根莖，是傳統(tǒng)中藥大黃的天然活性成分，價格低廉，具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、保護神經(jīng)和提高胃腸消化活力等廣泛的藥理特性，這些特性也使得大黃素在飼料中的應用成為現(xiàn)實，是性價比極高的飼料添加劑[3]。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠保護大鼠溶血性休克時的胃腸黏膜，促進上皮細胞緊密結(jié)合，提高胃腸活力，降低胃腸黏膜的通透性，繼而避免發(fā)生嚴重感染[4]。也有相關研究表明，大黃素能夠增進腸壁肌肉的蠕動，當刺激信號傳導進腸道時會使?jié)B透壓發(fā)生改變，助于腸道的暢通，這一特性對便秘、痔瘡，尤其是中老年便秘患者療效更為顯著[5]。同時研究發(fā)現(xiàn)，當大黃素應用于小鼠腹瀉模型時，腹瀉次數(shù)明顯減少，表明大黃素同時具有抗腹瀉功效[6]。目前對大黃素研究主要集中在大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)保護、抗腫瘤以及炎癥機制，然而對仔豬斷奶后腹瀉以及腸道黏膜保護作用及機制鮮有報道。在動物生產(chǎn)中，LPS主要破壞機體穩(wěn)態(tài)，改變腸道的正常形態(tài)，誘發(fā)炎癥反應，造成動物免疫應激，使得動物在亞健康下受到各種病原侵襲，造成動物生長遲緩甚至死亡[7]。因此，本研究擬建立LPS誘導的斷奶仔豬免疫應激模型，研究大黃素對免疫應激后斷奶仔豬的腸黏膜形態(tài)、抗氧化能力、緊密連接蛋白及炎性因子mRNA表達的影響，明確其對腸黏膜保護作用，以期為新型綠色飼料添加劑在仔豬上的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大黃素購于南京景竹生物科技有限公司，純度為98%；LPS溶液購于Sigma公司；熒光定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與RNAiso Plus購于南京維諾贊生物有限公司；酶聯(lián)免疫試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；抗氧化試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗設計與飼糧

試驗選取24頭胎次相近，健康狀況良好的28日齡杜×長×大三元雜交斷奶仔豬，按照體重一致原則隨機分為4個組，每組6個重復，單籠飼養(yǎng)。采用2×2雙因素隨機試驗設計，分為兩個水平，第一個水平是大黃素添加與否，分別為飼糧中添加300 mg/kg ED與不添加ED；第二個水平是LPS注射與否，分別為腹腔注射100 μg/kg·BW劑量或注射相同劑量滅菌生理鹽水。試驗期為21 d，在第21 d進行注射試驗。試驗飼糧為玉米-豆粕型基礎飼糧，參照NRC(2012)營養(yǎng)需要配置，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及其營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院品資所畜牧研究基地進行。試驗期間，試驗動物自由采食及飲水，每天飼喂兩次，分別為7：00及17：00，定期進行豬舍的消毒和清理工作，保持豬舍整潔衛(wèi)生。

1.4 樣品采集

在試驗第21 d給仔豬注射LPS或生理鹽水，6 h后屠宰全部仔豬，剖開腹腔，收集回腸，立刻放入干冰箱中，取其中中段6～9 cm，用冰浴后的生理鹽水清洗腸壁，洗脫內(nèi)容物，接著用濾紙吸干并剪開，用載玻片輕輕刮取腸道黏膜，取出大約0.5 g用錫箔紙包好，每個樣品包4粒左右放進同一個離心管中標記好，然后放入液氮灌中待試驗樣品收集結(jié)束后立即放入-80℃保存。另取6 cm左右的回腸中段，用生理鹽水沖洗后，放入4%多聚甲醛固定液中保存。

1.5 回腸黏膜形態(tài)觀察

多聚甲醛固定液中的回腸段經(jīng)修整、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、展片后，用蘇木精-伊紅（HE）染色，在熒光顯微鏡下挑取適宜的視野，測小腸絨毛高度和隱窩深度，每張切片挑選完整的6個視野并選用2～4個完整的腸絨毛測量均值，計算絨毛高度與隱窩深度比（V/C）。

1.6 回腸黏膜抗氧化能力測定

回腸黏膜的總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和微量還原型谷胱甘肽(GSH)含量，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性均采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測定，檢測嚴格按照說明書操作完成。

1.7 回腸黏膜炎性因子的含量測定

回腸黏膜的炎性因子白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量測定所用到的酶聯(lián)免疫試劑盒采購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，檢測嚴格按照說明書操作完成。

1.8 抗氧化酶基因、緊密連接蛋白及細胞因子mRNA的相對表達量測定

采用實時熒光定量PCR對抗氧化物谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）；炎性因子白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）；回腸黏膜閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、閉鎖蛋白（Occludin）和跨膜蛋白（Claudin）mRNA表達量進行檢測，用RNAiso Plus提取回腸黏膜當中的總RNA并保存于-80℃待用，分裝部分RNA采用微量分光光度計檢測其濃度，在260 nm波長與280 nm波長的吸光度比值在1.8～2.2之間表示純度較好，后續(xù)采用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，發(fā)現(xiàn)28、18 s和5 s小分子呈亮帶則說明RNA較為完整。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并保存于-20℃。接下來的cDNA用于實時熒光定量PCR步驟：以cDNA為模板進行擴增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，利用Premier 5.0軟件設計引物，引物序列見表2。按照維諾贊熒光定量試劑盒進行操作。設置程序：95℃30 s→95℃10 s→56℃ 30 s→72 ℃ 30 s（40個循環(huán)）；熔解曲線步驟為95℃ 15 s→60℃ 60 s→95℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法，根據(jù) Ct值計算出各組中基因 mRNA 相對表達量。

表2 引物序列

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)整理后采用SPSS 25.0進行單因素方差分析，利用單因素方差分析(ANOVA)進行組間數(shù)據(jù)比較，以P＜0.05定義為組間差異顯著，以0.05＜P＜0.1定義為有趨勢。采用一般線性模型進行雙因素方差分析，數(shù)據(jù)分析模型包括是否注射脂多糖和是否添加大黃素為飼料添加劑以及兩者間的互作。結(jié)果用“平均值±均值標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ED對免疫應激仔豬回腸黏膜形態(tài)的影響（見圖1、表3）

由圖1能觀察到，對照組的回腸絨毛結(jié)構較為完整，排列有序（見圖1A）；大黃素組的回腸絨毛較對照組排列更為緊湊，黏膜發(fā)育較好（見圖1B）；LPS應激對照組的回腸絨毛結(jié)構則排列疏松，且絨毛有脫落和斷裂的情況（見圖1C）；在LPS+大黃素組中可見絨毛趨于完整，雖有小面積脫落，但整體結(jié)構較為密集且完整，形狀規(guī)則（見圖1D）。

圖1 各組回腸黏膜形態(tài)（200×）

由表3可知，在免疫應激狀態(tài)下和飼糧中添加大黃素時會分別顯著影響仔豬的回腸絨毛高度和V/C（P＜0.05），而隱窩深度無顯著影響（P＞0.05）。

表3 大黃素對免疫應激斷奶仔豬回腸黏膜形態(tài)的影響(n=6)

2.2 大黃素對免疫應激仔豬回腸黏膜抗氧化活性和相關酶mRNA相對表達量的影響（見表4～表5）

由表4可知，脂多糖的注射顯著影響了MDA含量的升高和GSH含量的降低，并且導致了GSH-Px、CAT酶活性的下降（P＜0.05），大黃素的添加顯著影響了TAOC和CAT活性的升高（P＜0.05），并且也有增加GSH-Px活力的趨勢（P＜0.05）。并且相對于LPS應激對照組，LPS+大黃素組T-AOC、GSH-Px活性均顯著升高（P＜0.05），MDA指標顯著下降（P＜0.05）。

表4 大黃素對免疫應激斷奶仔豬回腸黏膜抗氧化能力的影響(n=6)

由表5可知，注射脂多糖顯著降低了GSH-Px、SOD和CAT的mRNA的相對表達量（P＜0.05），并且飼糧中添加大黃素顯著提高了CAT的mRNA相對表達（P＜0.05），飼糧添加大黃素與免疫應激對回腸黏膜CAT mRNA表達量存在交互作用（P＜0.05）。

表5 大黃素對免疫應激斷奶仔豬回腸黏膜抗氧化酶mRNA相對表達量的影響(n=6)

2.3 大黃素對免疫應激仔豬回腸黏膜炎性因子的含量和mRNA相對表達量的影響（見表6～表7）

由表6可知，大黃素的添加使得IL-6、TNF-α指標顯著降低（P＜0.05），飼糧添加大黃素和LPS應激對回腸黏膜IL-6含量的變化存在交互作用（P＜0.05）。對比LPS應激對照組，注射脂多糖的大黃素組IL-6、TNF-α指標均顯著降低（P＜0.05）。

表6 大黃素對免疫應激斷奶仔豬回腸黏膜炎性因子的含量的影響(n=6，U/mg prot.)

由表7可知，注射脂多糖使得IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相對表達量的顯著升高（P＜0.05），飼糧中添加大黃素顯著降低了IL-6、TNF-α的mRNA相對表達量（P＜0.05）。對比LPS應激對照組，LPS+大黃素組IL-6的mRNA相對表達量顯著降低（P＜0.05）；對比對照組，大黃素組的IL-6、TNF-α的mRNA相對表達量顯著降低（P＜0.05）。

表7 大黃素對免疫應激斷奶仔豬回腸黏膜炎性因子mRNA相對表達量的影響(n=6)

2.4 大黃素對免疫應激仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響（見表8）

由表8可知，LPS的注射導致腸黏膜ZO-1、Occludin和Claudin的mRNA相對表達量均顯著下降（P＜0.05），而飼糧中添加大黃素會顯著提高ZO-1、Occludin蛋白的相對表達量（P＜0.05），其中對Claudin蛋白的表達量也有顯著提高的趨勢（P=0.097）。對比免疫應激對照組，大黃素應激組回腸黏膜的緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin的mRNA相對表達量均顯著上升（P＜0.05）。

表8 大黃素對免疫應激斷奶仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響(n=6)

3 討論

3.1 ED對免疫應激仔豬回腸黏膜形態(tài)的影響

仔豬斷奶后，消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)還未發(fā)育完全，會引起消化道內(nèi)的一系列病癥，而腸道的絨毛結(jié)構指標可以直觀反映出腸道健康狀況的改變。Kruzel等[8]研究發(fā)現(xiàn)免疫應激能夠引起斷奶仔豬腸道的絨毛萎縮，以及腸黏膜的形態(tài)功能的減退。范長友[9]研究發(fā)現(xiàn)，免疫應激斷奶仔豬回腸絨毛高度以及V/C顯著降低，并且隱窩深度顯著增加。免疫應激可造成急性腸損傷，其病理基礎是腸壁缺血性水腫和腸黏膜通透性增加[10]。Qian等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大黃素對急性腸損傷大鼠的腸道損傷具有改善作用，經(jīng)大黃素治療后僅有小部分腸絨毛壞死脫落，表層水腫伴有局部出血和少量炎細胞浸潤，大黃素治療組大鼠腸組織病理損傷明顯輕于損傷模型組，損傷評分顯著降低。在本試驗中，免疫應激造成回腸絨毛高度和V/C顯著降低，說明回腸黏膜受損嚴重；添加300 mg/kg大黃素能夠顯著提高回腸絨毛高度和V/C，說明大黃素在一定程度上緩解了仔豬腸道應激，對回腸黏膜形態(tài)起到了保護作用。

3.2 ED對免疫應激仔豬回腸黏膜抗氧化能力和相關酶基因mRNA相對表達量的影響

抗氧化能力能夠反饋動物的健康狀況，在機體健康的情況下，其體內(nèi)的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)共同參與調(diào)節(jié)自由基的生成與消除，維持自由基的穩(wěn)態(tài)保持其平衡。當受到應激的作用時會產(chǎn)生大量的自由基，體內(nèi)的氧化平衡狀態(tài)將會被打破，導致機體的生長性能下降[12]。SOD、CAT和GSH-Px是抗氧化的三個關鍵酶，也是抗氧化系統(tǒng)中重要組成部分。GSH可以在GSH-Px和SOD的協(xié)同作用下清除過氧化物，TAOC反映了機體內(nèi)總的非酶抗氧化防御系統(tǒng)能力，而MDA的含量越高，則機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度就越嚴重，它間接反映了腸黏膜細胞損傷程度[13-15]。ROS又稱活性氧，注射脂多糖后，ROS大量產(chǎn)生使得免疫系統(tǒng)遭受破壞，氧化負荷隨之增加，而機體可通過抗氧化酶來清除過量ROS，其中抗氧化酶主要包括SOD、CAT等[16]。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖的刺激能夠破壞動物腸道的抗氧化系統(tǒng)，導致腸黏膜受損[17]。本試驗的結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，LPS顯著增加了回腸黏膜的MDA含量和顯著降低了GSH、GSH-Px、CAT指標并導致相關酶基因GSH-Px、SOD、CAT的mRNA表達量的顯著下降，造成了回腸腸道氧化平衡的失調(diào)。大黃素可以使得細胞中ROS和NO水平顯著降低，有效緩解機體過氧化損傷[18]，Yao等[19]研究大黃素對炎性模型大鼠的影響發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠降低模型血清中MDA含量，并提高血清中SOD含量，提示了大黃素能夠提高機體抗氧化水平。并且在體外試驗中，發(fā)現(xiàn)大黃素對采用伽瑪射線誘導小鼠DNA損傷和應激的細胞具有保護作用與清除氧自由基的活性[20]。本試驗中，飼糧中添加大黃素顯著提高了回腸T-AOC能力和CAT酶活性，對于GSH-Px酶活性有提升的趨勢，并且CAT酶基因mRNA表達量受大黃素影響顯著提高，表明大黃素可以提高腸道的抗氧化能力。

3.3 大黃素對免疫應激仔豬回腸黏膜炎性因子含量和mRNA相對表達量的影響

腸道內(nèi)的炎癥處在一個動態(tài)平衡的模式，而指導這一過程的細胞因子在空間、時間和數(shù)量上受到嚴格控制。在正常情況下，感染或損傷引起的是促炎的初始階段，而之后則是機體內(nèi)病原體的清除和組織修復，最終恢復機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在上述過程中組織的修復需要促炎和抗炎細胞因子以及促進細胞外基質(zhì)重塑、支持上皮再生和誘導血管生成的生長因子，而局部細胞炎性因子水平的升高，例如IL-1β、IL-6和TNF-α等是炎性腸黏膜病變的主要指征之一[21]。核因子-κB（NF-κB）是一種核轉(zhuǎn)錄因子，是炎癥過程的調(diào)節(jié)因子，其中IL-1β，IL-6和TNF-α都受NF-κB轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[22]。大量研究表明，LPS可以通過提高TNF-α等促炎因子水平來觸發(fā)炎癥反應[23]。通過對LPS觸發(fā)的動物炎癥模型的研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖能夠通過促使NF-κB信號通路的激活，使得大量炎性因子表達，引起機體炎癥損傷[24]。本試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，注射LPS后可使回腸黏膜IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相對表達量顯著升高，促使機體炎癥的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠改善LPS誘導免疫應激的相關病理變化并顯著降低了炎性因子TNF-α，IL-1β和IL-6的表達[25]。另有研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠介入大鼠結(jié)腸炎NF-κB炎癥通路，引起應激模型組的TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子減少，減緩炎癥對機體的損傷[26]。本試驗發(fā)現(xiàn)添加大黃素能夠顯著降低IL-6、TNF-α的含量和mRNA相對表達量，這說明大黃素能夠抑制回腸黏膜炎癥的產(chǎn)生，但其相關的機制還有待深入研究。

3.4 ED對免疫應激仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響

腸上皮緊密連接結(jié)構（TJ）是阻止腸腔內(nèi)抗原通過細胞旁途徑進入機體的結(jié)構屏障[27]。TJ復合物由多個蛋白質(zhì)組分組成，包括閉塞小帶（ZO）、緊密連接蛋白（Claudins）和封閉蛋白（Occludin）。ZO-1和ZO-2是通過與其他蛋白質(zhì)（如Claudins和Occludin）相互作用而組裝和保持緊密連接的兩個關鍵因素。Claudins是決定緊密連接通透性的屏障形成蛋白，它的突變或失會增加細胞旁通透性，導致腸屏障功能障礙；Occludin屬于跨膜蛋白，在細胞旁緊密連接的縫隙處起著結(jié)構性作用，同時也參與了緊密連接形成的信號調(diào)節(jié)，它的缺失可以直接導致緊密連接結(jié)構的完整性失效[28]。有研究表明，大黃素可以促進腸膿毒癥大鼠模型中ZO-1、Claudin-5的表達，從而減輕腸上皮緊密連接的破壞，降低腸黏膜通透性，保護腸道機械屏障的完整[29]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS的注射顯著降低了回腸黏膜ZO-1、Occludin和Claudin的mRNA相對表達量，而飼糧中添加大黃素顯著抑制由LPS應激導致的ZO-1、Occludin和Claudin的mRNA相對表達量的下降。該結(jié)果與張瑞[30]的研究結(jié)果相似，即大黃素組減少腸系膜淋巴結(jié)的細菌移位和增加回腸上皮細胞緊密連接相關Occludin等蛋白的表達。由此說明大黃素可以促進回腸黏膜上皮細胞中緊密連接蛋白的表達，維持腸道機械屏障的完整性和通透性。

4 結(jié)論

斷奶仔豬受到免疫應激時，回腸黏膜上皮緊密連接蛋白表達顯著降低，回腸黏膜形態(tài)結(jié)構受損，抗氧化和抗炎性能顯著降低。大黃素的添加可以有效地保護免疫應激斷奶仔豬回腸屏障的完整性，增加其緊密連接蛋白的表達，提高回腸黏膜抗氧化和抗炎性能。