任李俊，王 智，朱大偉，張利坤，胡建宏

(1.白水縣同羊原種場，陜西 白水715600；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院)

隨著我國社會經(jīng)濟的不斷發(fā)展，人民的生活質(zhì)量和消費水平也正在逐漸提高，羊肉已經(jīng)成為我國城鄉(xiāng)居民日常消費的重要畜產(chǎn)品之一，而羊肉的巨大需求量促使我國的對于綿羊的養(yǎng)殖方式逐步從農(nóng)戶散養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)模化、集約化舍飼養(yǎng)殖。隨著養(yǎng)殖方式的現(xiàn)代化轉(zhuǎn)變，人工授精技術(shù)在規(guī)?；B(yǎng)殖中得到大力推廣，對于優(yōu)質(zhì)綿羊冷凍精液的需求量也正在逐漸增大。使用優(yōu)質(zhì)綿羊的冷凍精液進行人工授精可有效發(fā)揮優(yōu)秀種公羊的生產(chǎn)性能，提供種公羊的利用率，可以有效改善羊群結(jié)構(gòu)，加快良種綿羊的繁殖效率。冷凍精液解凍后的品質(zhì)可直接影響人工授精后母羊的受胎率、產(chǎn)羔數(shù)等，精液在冷凍保存程序過程中精子的結(jié)構(gòu)以及功能容易受到外界環(huán)境(溫度、滲透壓、pH等)影響造成一定的損傷，從而導(dǎo)致解凍后精子活率較低、頂體完整率和質(zhì)膜完整率降低，影響精液的品質(zhì)。本文從精液稀釋液的理化指標(biāo)、冷凍-解凍方法、溫度等因素對綿羊精液冷凍保存保存效果的影響進行綜述，以期為綿羊的冷凍保存技術(shù)應(yīng)用推廣提供參考。

1 稀釋液對精液品質(zhì)的影響

1.1 pH

在精液冷凍過程中，pH是影響精液冷凍保存效果的重要因素，在精液稀釋中pH的劇烈變化可直接導(dǎo)致精子的死亡。綿羊精液的pH為7.0～7.2，稀釋液pH偏堿性時會加快精子的代謝活動，同時會降低精子的存活時間。目前研究普遍認(rèn)為精液稀釋液在冷凍保存過程中隨著保存時間的延長pH逐漸降低至偏酸性，稀釋液偏酸性時可抑制精子的代謝活動，有利于精液冷凍保存。Liu等的研究表明，精液冷凍解凍后精子的活率與稀釋液pH呈強相關(guān)性，在稀釋液中添加檸檬酸鹽、重碳酸鹽等鹽類物質(zhì)可維持稀釋液pH的穩(wěn)定。馬玉英等研究表明，薩?？搜蚓合♂屢旱膒H維持在6.0～7.0時，精液冷凍解凍后精子活力效果較好。精液稀釋液中加入糖類物質(zhì)如環(huán)糊精、葡萄糖、果糖等，精子可利用稀釋液中的糖類進行能量代謝并可生成乳酸鹽等弱酸物質(zhì)，從而形成弱酸環(huán)境，有利于精液冷凍保存。宋玉坤等研究表明，在稀釋液配方中加入1%十二烷基硫酸鈉、Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉可顯著提高精液冷凍保存效果。李方舟等研究表明，在稀釋液中聯(lián)合添加1.0 mg/mL海帶多糖+2.0 mg/mL枸杞多糖可顯著提升精液冷凍保存效果。

1.2 滲透壓

在精液冷凍過程中，滲透壓對于對于精液冷凍保存效果有重要的影響，精子與精液稀釋液應(yīng)基本保持等滲狀態(tài)。若精液稀釋液中鹽類濃度較低，精子會從稀釋液中吸水而膨脹，導(dǎo)致精子運動速度降低，甚至漲破死亡，反之則精子會脫水，稀釋液中鹽類濃度過高過低均會導(dǎo)致精液品質(zhì)降低，因此保證適宜的滲透壓并維持穩(wěn)定可有效降低精子的損傷。目前研究普遍認(rèn)為精子可以適應(yīng)的滲透壓范圍為240～350 mOsm/L，在此范圍內(nèi)對精子損傷較低。張亞妮等研究表明，在綿羊常溫保存中稀釋液的滲透壓為339 mOsm/L時精子的活力顯著高于滲透壓為280 mOsm/L。劉福元等研究發(fā)現(xiàn)，綿羊低溫保存中稀釋液滲透壓梯度為260、300、340、380、420、420、460 mOsm/L時，滲透壓為340 mOsm/L的精液中精子有效存活時間、存活時間最高。稀釋液中添加緩沖物質(zhì)可有效維持精液內(nèi)滲透壓，常見物質(zhì)主要有糖類、鹽類、磷脂類等。糖類物質(zhì)主要有環(huán)糊精、葡糖糖、果糖，可為精子提供代謝能量同時可調(diào)節(jié)精液內(nèi)滲透壓。鹽類物質(zhì)主要有檸檬酸鹽、磷酸鹽、重碳酸鹽等。宋玉坤研究表明，在精液冷凍稀釋液中添加卵黃可為精子提供代謝能量同時可以將稀釋液的滲透壓維持在370 mOsm/L，可降低精子在精液冷凍保存中精子頂體、質(zhì)膜的損傷，提高冷凍解凍后精液品質(zhì)。

2 冷凍-解凍方法對精液品質(zhì)的影響

精液的冷凍-解凍方法對于解凍后精液品質(zhì)具有重要影響。精液的冷凍過程主要分為精液平衡和冷凍兩個過程，其中精液平衡是指將精液稀釋后由37 ℃緩慢降溫到5 ℃，共平衡2.5～3 h；精液冷凍是指將平衡好的精液通過冷凍漂浮器放置于液氮表面進行熏蒸緩慢降溫，熏蒸約5 min后可放置于液氮進行冷凍保存。陳亞明等研究發(fā)現(xiàn)，使用不同體積的水浴包被和8層紗布包被放入冰箱降溫平衡，其中250 mL水浴包被和200 mL水浴包被平衡時間為2.0 h和2.5 h冷凍精子的活率、生存指數(shù)、頂體完整率等均高于其他組。鄧雯等研究發(fā)現(xiàn)，綿羊精液采用250 mL水浴降溫平衡、時間約為3 h時較為適宜，精子解凍品質(zhì)最好。

目前常用的綿羊精液冷凍方法有液氮熏蒸法和程序冷凍儀法，液氮熏蒸法需要控制精液細管與液氮液面的高度差來控制溫度的降溫速率，保國俊等研究發(fā)現(xiàn)種公羊凍精制作時熏蒸距離與熏蒸時間是正相關(guān)的，最佳熏蒸距離為2 cm最佳熏蒸時間為7 min，解凍后精子的活率可達到42.33%。程序冷凍儀法是由電腦程序調(diào)控降溫速率。王新奇等研究發(fā)現(xiàn)，使用液氮熏蒸發(fā)和程序冷凍儀法進行精液冷凍時，采用程序冷凍儀法冷凍后精子活率和質(zhì)膜完整性顯著高于液氮熏蒸法，使用液氮熏蒸法需要嚴(yán)格控制細管與液氮液面的距離，受客觀因素影響較大，程序冷凍儀法是比較理想的冷凍方法。

在精液解凍操作中，將凍精細管從液氮中取出迅速浸入39～45 ℃恒溫水浴鍋，輕輕搖動至融化(10～15 s)，融化后可進行精液品質(zhì)鑒定或者直接使用。張子軍等研究發(fā)現(xiàn)，精液在解凍后的活率與解凍時的溫度差異不明顯，但受稀釋液的配方物質(zhì)影響較大，解凍溫度較高時需要進行的操作及所需配方更為復(fù)雜，適宜的解凍溫度為42～45 ℃，解凍后精子的活率達到0.4。

3 溫度對精液品質(zhì)的影響

在精液冷凍保存中，溫度的變化主要有三個階段：平衡階段精液38 ℃降低至4～5 ℃、冷凍熏蒸階段精液溫度降至-196 ℃、凍融階段精液溫度升至38 ℃。在平衡階段精液溫度降低過程中，精子極容易發(fā)生不可逆損傷甚至死亡，這種現(xiàn)象叫做冷休克。鄧雯等研究發(fā)現(xiàn)，精液平衡時降溫速率控制在前30 min為0.73～0.74 ℃/min，30～90 min降溫速率應(yīng)控制在0.11～0.12 ℃/min，平衡時間為3 h，精子的冷打擊最小。

精子在熏蒸降溫和凍融升溫時溫度在0～-60 ℃時，精子內(nèi)部自由水容易形成冰晶化結(jié)構(gòu)，精子內(nèi)部的冰晶化結(jié)構(gòu)極易對精子內(nèi)部造成物理性損傷。溫度降低速率過快時，冰晶化速度越快對應(yīng)冰晶結(jié)構(gòu)越大，損傷越高；溫度升高速率過慢時，精子內(nèi)部自由水形成冰晶，使精子內(nèi)鹽類物質(zhì)濃度升高滲透壓增加，精液由于在最外部解凍后使大量水分進入精子，導(dǎo)致精子膨脹甚至死亡，同時形成的冰晶化會造成物理性損傷。降溫速率越慢，對精子損傷越大，精液品質(zhì)越低。王新奇研究發(fā)現(xiàn)，在4～-60 ℃的降溫速率為20 ℃/min、降溫時間約為3.75 min，凍融時水浴溫度為40 ℃、解凍時間為10 s，冷凍-解凍后的精液質(zhì)量最好，解凍后精子活率、頂體完整率和質(zhì)膜完整率分別達到37%、41.18%和47.62%。在精液冷凍保存中通常可加入抗凍物質(zhì)從而降低溫度變化對精子的超微結(jié)構(gòu)和生物及功能上的損傷，常用的抗凍物質(zhì)有甘油、卵黃、大豆卵磷脂、乙二醇與二甲基亞砜(DMSO)等。其中甘油的最適添加濃度范圍為6%～8%，卵黃的常用濃度為15%～20%，DMSO的適宜濃度為5%左右。

4 小結(jié)展望

隨著綿羊養(yǎng)殖的規(guī)模化、集約化發(fā)展，人工授精技術(shù)得到更加廣泛的應(yīng)用，對于優(yōu)質(zhì)種公羊精液的需求促使了精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展，綿羊精液冷凍保存技術(shù)可以實現(xiàn)優(yōu)秀種公羊的優(yōu)質(zhì)精液的大范圍、跨地域使用，大大提高優(yōu)秀種公羊的利用率，提高生產(chǎn)效率增加經(jīng)濟效益，同時可加快綿羊的育種改良進程。精液冷凍保存目前研究的熱點在于稀釋液、保護液的配方改良，主要在于添加劑的研究包括其主要性能及功能機制，如某些植物提取物、糖類等。但目前的研究的多種添加劑配方制作凍精多數(shù)停留于試驗階段，未進行最終綿羊人工授精來判斷其最終效果。所以加強探索凍精在綿羊具體生產(chǎn)實際中的應(yīng)用效果，可對于精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展提供實際指導(dǎo)。