秦百君， 江柳慶， 陳 蕊， 楊 昕， 譚 琦， 黃夢(mèng)瑤， 劉錕榮， 陳國(guó)忠

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是由多種病因引起的胰蛋白酶異常激活、胰腺組織水腫、壞死及炎癥介質(zhì)大量釋放，繼發(fā)全身炎癥性反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征的急危重癥[1]。研究[2]表明，SAP約占急性胰腺炎患者的20%，死亡率達(dá)6.5%～26.0%，以發(fā)病2周內(nèi)的病死率較高。近年來(lái)，結(jié)合該病病情進(jìn)展快速、預(yù)后兇險(xiǎn)等特點(diǎn)，醫(yī)師們提出了多學(xué)科聯(lián)合診療(multi-disciplinary team,MDT)模式，盡早介入治療以降低病重率和病死率，這已成為現(xiàn)行主流的治療模式[3]。中醫(yī)藥可在SAP的預(yù)防和治療中發(fā)揮積極作用，在改善腸梗阻、減少炎癥因子釋放、抑制腸道菌群移位等方面具有良好療效[4]，為中西醫(yī)協(xié)同診治重大急危重癥發(fā)揮了重要作用。本研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，SAP多由情志不遂，暴飲暴食、嗜食辛辣熾馎、腸蟲妄動(dòng)等引起，臨床表現(xiàn)可歸為“胰癉”“脾心痛”“結(jié)胸”等，在《黃帝內(nèi)經(jīng)》和《圣濟(jì)總錄》中也均有相關(guān)論述[5-6]。本病病機(jī)為“濕熱瘀毒”，故提出“清熱化濕解毒、化瘀攻下存陰”的治則，臨證用藥主張?jiān)赟AP早期結(jié)合西醫(yī)高強(qiáng)度治療基礎(chǔ)上，及時(shí)用中藥清解化攻濕熱毒瘀，予邪出路[7]。清解化攻方是陳國(guó)忠教授治療SAP數(shù)十年探索總結(jié)而成的臨證驗(yàn)方，是“清熱化濕解毒、化瘀攻下存陰”治法的代表方劑[8-9]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探索了清解化攻方治療SAP的作用機(jī)制，并利用分子對(duì)接驗(yàn)證和模擬了藥效成分和疾病靶點(diǎn)的作用模式。

1 資料與方法

1.1清解化攻方成分及作用靶點(diǎn)篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;http://tcmspw.com/tcmsp.php)，以生物利用度>30%、類藥性>0.18為條件篩選清解化攻方中藥活性成分，并命名為“ingredients.txt”文件；檢索本方劑所含藥物的潛在靶點(diǎn)，命名為“target.txt”文件。

1.2中藥靶點(diǎn)基因注釋 在uniprot網(wǎng)站(http://www.uniprot.org/)勾選Reviewed Human基因選項(xiàng)，將“target.txt”文件靶點(diǎn)信息轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因名稱，命名為“symble.txt”文件。

1.3疾病相關(guān)基因檢索 通過(guò)GeneCards(www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、pharmgkb(www.pharmgkb.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“severe acute pancreatitis”為關(guān)鍵詞檢索，得到疾病基因集，命名疾病基因文件“Disease.txt”。

1.4中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 對(duì)清解化攻方的藥物靶點(diǎn)和SAP的疾病基因取交集：將方法1.2中的“symble.txt”文件和1.3中的“disease.txt”文件通過(guò)R語(yǔ)言VennDiagram包進(jìn)行運(yùn)算，得到交集基因列表“drug-disease.txt”文件，并繪制韋恩圖。應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件對(duì)交集基因構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 在String網(wǎng)站(http://string-db.org)點(diǎn)擊“Muitiple proteins”，物種選擇“Homo sapiens”，置信度設(shè)置為“>0.90”，刪除游離節(jié)點(diǎn)，導(dǎo)入交集基因列表(即方法1.4的“drug-disease.txt”文件)輸出結(jié)果，命名為“string_interactions.xls”文件。

1.6GO和KEGG富集分析 應(yīng)用CytoNCA行拓?fù)鋵W(xué)分析，以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度(degree)、介數(shù)中心度(betweenness，BC)和接近中心性(closeness，CC)為節(jié)點(diǎn)關(guān)鍵指標(biāo)，篩選大于三者中位數(shù)的成分作為核心靶點(diǎn)基因；通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，P<0.05；應(yīng)用R軟件“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”包對(duì)交集基因進(jìn)行KEGG富集分析，P<0.01。

1.7分子對(duì)接技術(shù) 通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載清解化攻方藥物關(guān)鍵成分的小分子結(jié)構(gòu)(拓?fù)鋵W(xué)分析排名前三)，應(yīng)用Chem3D軟件將小分子配體結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)。通過(guò)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(protein data bank,PDB;https://www.rcsb.org)檢索藥物核心靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)(PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前三)。應(yīng)用Autodock Vina軟件對(duì)小分子配體和蛋白受體分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1清解化攻方的活性成分 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集到清解化攻方10味藥物的共202個(gè)化合物。藥物靶點(diǎn)經(jīng)Uniprot基因注釋后得到225個(gè)注釋基因。見表1。5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)收集到6 522個(gè)疾病基因，并將藥物靶基因和疾病靶點(diǎn)取交集，最終得到210個(gè)藥物-疾病交集基因。見圖1。

表1 部分藥物活性成分及靶點(diǎn)信息

圖1 藥物-疾病韋恩圖

2.2“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵藥物成分

網(wǎng)絡(luò)共402個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中藥物成分節(jié)點(diǎn)156個(gè)，靶基因節(jié)點(diǎn)246個(gè)，1 925條邊見圖2。清解化攻方中節(jié)點(diǎn)度值最高的藥物成分包括(排名前10)：槲皮素(degree=131個(gè))、木犀草素(degree=56個(gè))、山柰酚(degree=49個(gè))、漢黃芩素(degree=39個(gè))、丹參酮Ⅱa(degree=37個(gè))、柚皮素(degree=35個(gè))、川陳皮素(degree=29個(gè))、黃芩素(degree=29個(gè))、β-谷甾醇(degree=30個(gè))及二氫丹參酮(degree=26個(gè))。提示這些藥物成分在清解化攻方治療SAP過(guò)程中可能發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

黃色代表靶基因，藍(lán)色代表有效成分，紫色代表藥物。體現(xiàn)了復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)

2.3蛋白互作用PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn) 蛋白互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。核心靶點(diǎn)的BC、CC、degree拓?fù)鋵W(xué)分析，按中位值進(jìn)行過(guò)濾，重復(fù)2次，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖共14個(gè)節(jié)點(diǎn)，50條邊。提示該14個(gè)靶點(diǎn)可能是清解化攻方干預(yù)SAP發(fā)揮關(guān)鍵藥效作用的潛在靶點(diǎn)。見表2。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)排名前10關(guān)鍵靶點(diǎn)及拓?fù)鋮?shù)

2.4潛在靶點(diǎn)通路富集分析結(jié)果 GO富集分析得到GO條目2 778個(gè)，其中生物過(guò)程2 423個(gè)，細(xì)胞組成112個(gè)，分子功能243個(gè)。見圖4。藥物成分主要富集在細(xì)胞對(duì)藥物反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、氧氣反應(yīng)等過(guò)程。細(xì)胞組成涉及到細(xì)胞膜筏、受體復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等。分子功能包含轉(zhuǎn)錄因子活性及配體調(diào)節(jié)特異性DNA結(jié)合序列、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性等。KEGG預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的通路共包括118條代謝通路，選取P<0.01，且富集數(shù)目>20的通路繪制氣泡圖，結(jié)果顯示通路主要與代謝、炎性因子以及細(xì)胞凋亡等相關(guān)。見圖5。

圖4 GO富集氣泡圖

圖5 KEGG富集氣泡圖

2.5分子對(duì)接結(jié)果 在“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)中，槲皮素、木犀草素、山柰酚等是清解化攻方作用于SAP的關(guān)鍵藥效成分團(tuán)，JUN、TP53、STAT3是PPI網(wǎng)絡(luò)排名前三的核心基因。應(yīng)用Autodock軟件對(duì)接每種構(gòu)象得到20個(gè)不同組合，選擇結(jié)合能最低的組合作為分子對(duì)接構(gòu)象，見圖6。經(jīng)計(jì)算得到JUN、TP53、STAT3靶點(diǎn)與3種關(guān)鍵成分的最低結(jié)合能均小于-7 kcal/mol，顯示出強(qiáng)烈的結(jié)合活性和穩(wěn)定構(gòu)象。藥效成分、作用靶點(diǎn)、氫鍵結(jié)合能見表3。

表3 分子對(duì)接結(jié)果

圖6 分子對(duì)接圖

3 討論

3.1廣西地處亞熱帶區(qū)域，氣候炎熱潮濕，人體脾胃若傷，濕邪內(nèi)外相合，據(jù)不同體質(zhì)和時(shí)令從化而發(fā)生急性胰腺炎。據(jù)此，陳國(guó)忠教授提出清、解、化、攻治法，針對(duì)性治療早期SAP的“熱、毒、濕、瘀”濁邪，以盡快疏調(diào)體內(nèi)氣機(jī)，減輕毒邪敗壞臟器，防止由閉轉(zhuǎn)脫，與《急性胰腺炎中醫(yī)診療專家共識(shí)意見(2017)》[10]提出SAP初期治則理論相契合。清解化攻方由柴胡、黃芩、大黃等10味中藥組合，以通腑瀉濁的小承氣湯為基礎(chǔ)，配理氣化濕、活血祛瘀、清熱解毒藥。陳國(guó)忠教授遵從張介賓之祛邪即是扶正，并結(jié)合其根本病機(jī)[7]：人體氣機(jī)受阻，瘀血內(nèi)生，釀生濕熱，濕熱瘀濁不去，耗氣灼津，腸腑不通，日久成毒，用藥?kù)钚爸啡绱簏S、黃芩等量適度，理在勿大砍大伐，防邪未去而正已傷。理氣行氣柴胡、厚樸、廣木香與活血化瘀桃仁、丹參合用，氣行則血行，氣血同調(diào)，但用藥中也當(dāng)防其辛燥之性化熱傷陰，用量宜小。方中枳實(shí)、豆蔻化濕宜重用，意為濕去則熱孤。全方共奏清熱化濕、解毒化瘀功效。本方藥物辛燥苦寒，當(dāng)中病即止，以防變證[11]。

3.2網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從整體層面探索藥物和疾病相關(guān)性的研究方法，通過(guò)生信分析系統(tǒng)揭示藥物干預(yù)疾病的多靶點(diǎn)、多通路機(jī)制，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了新的思路和方法[12-13]。本研究基于該方法篩選到清解化攻方含槲皮素、木犀草素、山柰酚、漢黃芩素等關(guān)鍵成分。槲皮素是多羥基黃酮類化合物，具有抗氧化清除自由基，抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用，可通過(guò)抑制炎性因子NF-κB表達(dá)及活化發(fā)揮治療胰腺炎的作用[14-15]。木犀草素是黃酮類化學(xué)物，通過(guò)降低p-P38蛋白表達(dá)，抑制NF-κB和p38MAPK通路激活，發(fā)揮對(duì)胰腺的保護(hù)作用[16]。山萘酚具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種藥理活性[17]，可保護(hù)胰腺免受炎癥損害。拓?fù)鋵W(xué)分析清解化攻方治療SAP的14個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，包括JUN、TP53、STAT3等，主要參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、炎癥反應(yīng)等過(guò)程。JUN在轉(zhuǎn)導(dǎo)偶聯(lián)信息傳遞過(guò)程中發(fā)揮信使作用，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并作為基因調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。STAT3作為多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胞質(zhì)蛋白，已被證實(shí)可由炎性因子激活后通過(guò)STAT3通路對(duì)抗胰腺腺泡細(xì)胞凋亡或延遲炎癥細(xì)胞修復(fù)來(lái)加重急性胰腺炎[19]，D Oliveira Martins等[20]也論證了TP53基因變異與SAP易感性存在潛在關(guān)聯(lián)。

3.3本研究GO富集分析結(jié)果顯示，清解化攻方可參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、活性氧代謝等過(guò)程，KEGG主要富集于P53、HIF-1、TNF、PI3K-Akt等信號(hào)通路。胰腺炎癥及全身炎性反應(yīng)綜合征是SAP發(fā)病的重要特征，PI3K-Akt可通過(guò)磷酸化NF-κB的上游IκB激酶復(fù)合體，使抑制蛋白IκB降解，引起NF-κB釋放活化，從而轉(zhuǎn)錄調(diào)控大量炎性因子的表達(dá)，引發(fā)疾病[21]。一項(xiàng)地塞米松治療SAP的研究[22]也發(fā)現(xiàn)，地塞米松通過(guò)抑制絲裂原激活蛋白激酶NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3信號(hào)途徑而減少炎性因子和趨化因子釋放，從而降低SAP的嚴(yán)重程度。PI3K/Akt信號(hào)通路也參與了細(xì)胞凋亡，可通過(guò)激活NF-κB調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)活性而抑制凋亡。Wang等[23]的研究通過(guò)抑制SAP大鼠的PI3K通路，使得NF-κB活性降低，凋亡抑制基因表達(dá)和炎癥因子釋放減少，大鼠的病情得到減輕。本研究分子對(duì)接結(jié)果顯示，槲皮素、木犀草素與JUN、TP53、STAT3等受體具有良好的結(jié)合性，說(shuō)明清解化攻方可能通過(guò)調(diào)控P53、PI3K-Akt等信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、改善能量代謝等作用，提示清解化攻方具有多靶點(diǎn)和多通路治療SAP的特點(diǎn)。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接初步探討了清解化攻方的活性成分和潛在靶點(diǎn)，及多通路、多靶點(diǎn)協(xié)同治療SAP的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，為后續(xù)深入研究清解化攻方治療SAP的作用機(jī)制提供參考，但研究結(jié)論仍需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。