應(yīng)震，周莊，楊燕萍，付雙彬，徐碗

(浙江亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325000)

寒蘭(CymbidiumkanranMakino)植株修長優(yōu)美，花色豐富，香味清醇，具有極高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和文化價(jià)值，為五大國蘭之一，廣泛分布于我國東部、南部及日本和朝鮮半島，在東亞具有悠久的栽培歷史和廣泛的種植基礎(chǔ)。通過實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在浙江地區(qū)，寒蘭無論種植于室內(nèi)還是室外，其花期主要集中于10—12月，偶有寒蘭會(huì)于春季和夏季開花，花期總體上具有一定的周期性。

隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，植物光周期調(diào)控開花的分子機(jī)理在擬南芥上逐漸揭示，葉片COL基因?qū)庵芷陧憫?yīng)是植物光周期開花的根本原因[1]。通過深入研究，以COL和FT基因?yàn)楹诵恼{(diào)控元件的光周期調(diào)控的開花模型已經(jīng)在很多植物開花研究中得到了驗(yàn)證[2]。在蒺藜[3]、菊花[4]、李子[5]、山茶[6]和棉花[7]等植物中已克隆得到對應(yīng)的FT和COL基因及其同源基因。研究發(fā)現(xiàn)，在模式植物中過量表達(dá)FT基因可以明顯縮短植物花期；而過量表達(dá)COL基因可以明顯上調(diào)FT基因的表達(dá)水平，同樣起到縮短花期的功能。

寒蘭作為五大國蘭之一，花期與大多數(shù)蘭花存在不同，本文擬通過對寒蘭開花的統(tǒng)計(jì)分析以及利用已報(bào)道的蘭屬、石斛屬[8]和蝴蝶蘭屬[9]COL基因家族信息，對寒蘭COL基因在花期前后表達(dá)水平進(jìn)行分析，擬為下一步開展光周期調(diào)控寒蘭的開花系統(tǒng)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及采樣

寒蘭種植于浙江亞熱帶作物研究所溫室大棚中，定期澆水培養(yǎng)，選擇生長健壯的植株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開展時(shí)間為5—11月，每第一個(gè)月第一周，采集10盆寒蘭葉片，葉片采集并液氮處理后超低溫冰箱保存。

待植株開花后按照是否開花進(jìn)行樣品分類，并提取RNA，建立cDNA文庫。

1.2 熒光定量引物設(shè)計(jì)

通過現(xiàn)有蝴蝶蘭和蘭屬已報(bào)道的COL基因序列，結(jié)合課題組已有寒蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用bioedit軟件進(jìn)行比對，獲得兩條相似性較高的寒蘭COL轉(zhuǎn)錄組序列(c112049.graph_c0和c110006.graph_c0)分別命名為CKMCOL1和CKMCOL2。采用NCBI Primer BLAST在線設(shè)計(jì)熒光定量引物，篩選得到2對熒光定量引物(COL1-F：TGTTC GCAGGTGTCCTCATC，COL1-R：CGCGTAGCGTAT CGTCTTCT；COL2-F：CCCTTCAAATGGCGCAACAG，COL2-R：AGCGAACCGCCCTTTAATCC)。以ACTIN為內(nèi)參基因，引物為ACTIN-F：ATGCTCCCAGGG CTGTATTC，ACTIN-R：TACCCCTTTTAGACTGCGCC。

1.3 COL表達(dá)水平檢測

采用1.2設(shè)計(jì)的引物，對采集的樣品進(jìn)行熒光定量分析，比較兩組之間表達(dá)水平差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 花期前后寒蘭COL基因表達(dá)水平分析

通過圖1可以看出，無論是否開花，寒蘭COL1基因在5—7月表達(dá)水平都逐漸上升，而8—11月，開花組寒蘭的COL1基因表達(dá)水平先快速上升再緩慢下降，與未開花組寒蘭相比，均呈顯著和極顯著差異，由此可見，COL1基因在葉片中的特異性表達(dá)與寒蘭開花有密切聯(lián)系；而7月開始，光照時(shí)間縮短，但溫度較高，因此，推測COL1基因可能參與FT基因的調(diào)控，同時(shí)也能響應(yīng)溫度變化。

*—開花組和未開花組之間差異顯著，P<0.05；**—開花組和未開花組之間差異極顯著，P<0.01。

由圖2可知，COL2基因無論在開花組和未開花組，在5—8月都呈現(xiàn)表達(dá)水平上升的趨勢，而9—11月呈下降趨勢，與植株開花并無明顯關(guān)聯(lián)，這說明COL2基因的功能可能是響應(yīng)溫度的變化。

圖2 COL2基因在開花和未開花植株間表達(dá)水平

2.2 COL基因?qū)獍档捻憫?yīng)

圖3顯示，COL1基因在光處理3 h時(shí)，表達(dá)水平呈現(xiàn)略上升趨勢，但無顯著性差異，而在暗處理?xiàng)l件下，COL1基因隨著處理時(shí)間延長表達(dá)水平上升，在3 h時(shí)，顯著高于對應(yīng)的光處理?xiàng)l件。由此可以推斷COL1基因既能夠響應(yīng)溫度變化，同時(shí)也能響應(yīng)光照變化。

圖3 COL1基因在光暗處理下表達(dá)水平

圖4顯示，寒蘭COL2基因在光暗處理?xiàng)l件下的表達(dá)水平變化，可以看出，無論光處理還是暗處理，COL2基因表達(dá)水平變化基本相等，并無明顯的上升和下降，因此，可以推斷COL基因不能響應(yīng)光周期的變化。

圖4 COL2基因在光暗處理下表達(dá)水平

3 討論

COL基因家族在植物中對環(huán)境因子進(jìn)行響應(yīng)并且對下游的植物生理現(xiàn)象進(jìn)行調(diào)控，這其中包含了花期調(diào)控。本研究通過轉(zhuǎn)錄組大數(shù)據(jù)篩選，得到了寒蘭的COL1和COL2基因，其中COL1基因不僅具有顯著的光周期調(diào)節(jié)特性，同時(shí)也能對溫度變化進(jìn)行響應(yīng)，與寒蘭花期存在相關(guān)性；而COL2基因則具有溫度響應(yīng)的特性，與花期并無顯著相關(guān)性。為了繼續(xù)深入探究寒蘭COL基因家族的功能，今后需要結(jié)合擬南芥等模式植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組大數(shù)據(jù)分析，對其基因功能進(jìn)行更加深入的了解。