傅松波，馬承旭，井高靜，趙 楠，湯旭磊*，牟軍勤，常寅龍

(1.蘭州大學第一醫(yī)院 內分泌科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市城關區(qū)人民醫(yī)院 內分泌科，甘肅 蘭州 730030)

乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid cancer，PTC)10～15年的存活率達到85%，預后良好。然而，部分乳頭狀甲狀腺癌患者會發(fā)展到侵入鄰近組織(如淋巴結)，預后較差[1]。因此，闡明部分乳頭狀甲狀腺癌侵襲轉移的分子機制和開發(fā)具有診斷及判斷乳頭狀甲狀腺癌預后的分子標志物具有重要意義。miRNA表達譜揭示差異表達的miR-182-5p和乳頭狀甲狀腺癌的臨床復發(fā)密切相關[2]，miR-182的表達水平比正常甲狀腺組織增加3倍[3]，其在乳頭狀甲狀腺癌癌變中起致癌作用。

苦參堿(matrine)具有誘導腫瘤細胞周期停止[4]、增加腫瘤細胞的凋亡、降低腫瘤細胞的增殖[5]和遷移[6]等作用，具有抗多種腫瘤細胞活性。本研究表明苦參堿顯著的降低TPC-1中miR-182-5p的表達，但是，苦參堿治療乳頭狀甲狀腺癌的分子機制是否與miR-182-5p相關尚未報道，本文將探討苦參堿降低miR-182-5p的表達對乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞系增殖和遷移的影響，為臨床應用苦參堿治療乳頭狀甲狀腺癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及細胞

苦參堿(大連美侖生物技術有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶和血清(Gibco公司)；CCK-8試劑盒(北京同仁生物科技有限公司)；Transwell小室(康寧生物科技有限公司)；EndoFectin-Max 轉染試劑、miR-182-5p mimics及miR-182-5p抑制劑(GeneCopoeia公司)，E-cadherin、N-cadherin和vinmentin抗體(Abcam公司)。人甲狀腺正常細胞系Nthy-ori 3-1和人甲狀腺乳頭狀癌細胞系TPC-1(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理：分為兩大組，1)藥物處理組(分別用0、0.25、0.5和1 mg/mL的苦參堿處理TPC-1細胞)；2)轉染組(將TPC-1細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后行細胞轉染實驗并分為抑制劑對照組(inhibitor-NC)、miR-182-5p的抑制劑組(inhibitor)、模擬物對照組(mimics-NC)和miR-182-5p 模擬物組(miR-182-5p mimics)。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖：將轉染組(6×103個/孔)的TPC-1細胞接種于96孔板，其中mimics-NC和miR-182-5p mimics組的TPC-1貼壁后加入或者不加入0.5 mg/mL的苦參堿，于37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)0、24、48及72 h,加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h，讀取波長450 nm處各組細胞的吸光度值。

1.2.3 采用Transwell小室法檢測TPC-1細胞的遷移：將8×103個/室的轉染組的TPC-1細胞接種于小室上面，每室約100 μL，下面添加DMEM培養(yǎng)基，其中mimics-NC和miR-182-5p mimics組的TPC-1細胞貼壁后，向小室下面添加或者不添加0.5 mg/mL的苦參堿，置37 ℃、孵育48 h，取出小室，置24孔板，PBS漂洗2次，固定10 min，染色15 min，觀察TPC-1細胞的遷移并計數(shù)。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測miR-182-5p、E-cadherin、N-cadherin和vinmentin基因表達：從上述各組細胞中提取RNA，反轉錄合成cDNA，采用Bio-Rad CFX Manager3.1 PCR儀擴增，分析miR-182-5p、E-cadherin、N-cadherin和vinmentin的表達，采用2-ΔΔCt方法分析目的基因的相對表達水平。

1.2.5 采用Western blot檢測vinmentin、E-cadherin和N-cadherin的蛋白表達：提取各處理組總蛋白，SDS-PAGE分離，轉膜，用一抗二抗標記，檢測分離的目的蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 miR-182-5p在TPC-1細胞中上調表達水平

TPC-1細胞中miR-182-5p表達量顯著地高于NT組(P<0.01)。

2.2 miR-182-5p的下調抑制TPC-1細胞的增殖及遷移

在TPC-1細胞中轉染miR-182-5p inhibitor，24、48和72 h后，inhibitor組TPC-1細胞A450 nm吸光度值均顯著地低于inhibitor-NC組；inhibitor組遷移的TPC-1細胞明顯少于inhibitor-NC組(P<0.01)(圖1)。

*P<0.01 compared with inhibitor-NC圖1 miR-182-5p對TPC-1細胞增殖和遷移的影響Fig 1 Effect of miR-182-5p on proliferation and migration of TPC-1 n=5 or n=3)

2.3 苦參堿降低了miR-182-5p表達和TPC-1細胞的增殖、遷移

與control組相比，劑量為0.5和1 mg/mL的苦參堿均抑制TPC-1細胞中miR-182-5p表達(P<0.01)，且0.5 mg/mL苦參堿的抑制效果最好；與control組相比，0.5 mg/mL苦參堿在24、48和72 h均顯著地抑制TPC-1細胞增殖；0.5 mg/mL的苦參堿治療TPC-1細胞，48 h后，遷移的TPC-1細胞明顯少于control組(P<0.01)(圖2)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group圖2 苦參堿影響了TPC-1細胞中miR-182-5p的表達、增殖和遷移Fig 2 Effect of matrine on miR-182-5p level and proliferation and migration of TPC-1 n=5 or n=3)

2.4 TPC-1細胞系中miR-182-5p的上調降低了苦參堿對增殖和遷移的抑制作用

與mimics-NC相比，mimics-NC+苦參堿組TPC-1細胞A450 nm吸光度值顯著地降低(P<0.01)；與mimics-NC+苦參堿組相比，miR-182-5p mimics+苦參堿組A450 nm處吸光度顯著地升高(P<0.01)。與mimics-NC相比，mimics-NC+苦參堿組穿透小室TPC-1細胞數(shù)量明顯減少(P<0.01)；與mimics-NC+苦參堿組相比，miR-182-5p mimics+苦參堿組穿透小室TPC-1細胞數(shù)量明顯增多(P<0.01)(圖3)。

*P<0.01 compared with mimics-NC group；#P<0.01 compared with mimics-NC+matrine group圖3 TPC-1細胞中miR-182-5p的上調對苦參堿抑制效果的影響Fig 3 Effect of matrine on proliferation and migration of TPC-1 cells when miR-182-5p over-expression

2.5 miR-182-5p的上調降低了苦參堿對Vinmentin和N-cadherin的抑制、對E-cadherin表達的促進作用

在TPC-1細胞中，與mimics-NC組相比，mimic-NC+matrine組Vvinmentin和N-cadherin的蛋白表達明顯降低、E-cadherin的蛋白表達升高；與mimic-NC+matrine組相比，miR-182-5p-mimic+matrine組vinmentin和N-cadherin的表達水平上升、E-cadherin的蛋白表達水平降低(圖4)。

A.mimic-NC;B.miR-182-5P-mimic;C.mimic-NC+matrine;D.miR-182-5P-mimic+matrine圖4 miR-182-5p的過表達降低了苦參堿對vinmentin、N-cadherin和E-cadherin的調節(jié)作用Fig 4 Over-expression of miR-182-5p abolished the matrine-induced the decrease in N-cadherin and vinmentin protein expression as well as the increase in E-cadherin protein expression

在TPC-1細胞系中，與mimics-NC相比，mimic-NC+matrine組N-cadherin表達量降低(P<0.05)、E-cadherin表達增加(P<0.01)；與mimic-NC+matrine組相比，miR-182-5p-mimic+matrine組N-cadherin基因表達量顯著地增加、E-cadherin基因表達極顯著地降低(P<0.01)。苦參堿對vinmentin表達模式的調節(jié)作用與N-cadherin一致(表1)。

表1 miR-182-5p的過表達降低了苦參堿對TPC-1細胞中E-cadherin、N-cadherin 和 vinmentin的影響Table 1 Over-expression of miR-182-5p abolishes the matrine-induced the decrease of N-cadherin and vinmentin gene expression as well as the increase of E-cadherin gene n=3)

3 討論

乳頭狀甲狀腺癌在生物學上屬于“惰性腫瘤”，但部分甲狀腺癌易發(fā)展為侵襲性。甲狀腺癌細胞惡性增殖和獲得遷移表型是一個未受到調控的復雜過程。miRNA既可以促進癌細胞的轉移也可以抑制癌細胞的轉移，在調控甲狀腺癌細胞的增殖、分化和凋亡等生物學行為中發(fā)揮雙重角色[7]。本研究結果顯示：在TPC-1細胞系中，miR-182-5p的表達顯著增加，且抑制miR-182-5p的表達降低了TPC-1細胞的增殖和遷移，提示miR-182-5p具有導致人乳頭狀甲狀腺癌細胞惡性生物學行為的能力。

苦參堿是一種廣泛應用的抗腫瘤藥物，能抑制甲狀腺癌細胞的惡性病理行為(抑制腫瘤細胞生長、腫瘤組織侵襲及組織內新血管生成等)，誘導腫瘤細胞凋亡[8-10]，我們研究用劑量為0.5和1 mg/mL的苦參堿治療TPC-1細胞，表明苦參堿的劑量為0.5 mg/mL時明顯地抑制了miR-182-5p的表達，同時降低了TPC-1細胞系的增殖和遷移，過表達TPC-1細胞中miR-182-5p，苦參堿的抑制效果被降低。提示苦參堿通過降低TPC-1細胞中miR-182-5p發(fā)揮治療乳頭狀甲狀腺癌的作用。

人乳頭狀甲狀腺癌細胞的侵襲和轉移與甲狀腺癌臨床復發(fā)事件密切相關，癌細胞經歷了上皮間充質轉換，獲得了遷移表型，以E-cadherin的下調和N-cadherin的上調為分子基礎，為甲狀腺癌細胞具有侵襲和轉移的能力提供了必要的條件[11]。本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿逆轉了TPC-1細胞中E-cadherin和N-cadherin的表達模式，從而降低TPC-1細胞獲得遷移表型的能力，抑制上皮間充質轉化。雖然苦參堿能夠調節(jié)上述分子的表達，但這些變化的分子哪些分子可能是miR-182-5p的潛在靶標還需進一步的實驗(例如熒光素酶報告試驗)證實。