陳康軒, 李詩豪, 李富花

凡納濱對蝦“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸調控精巢發(fā)育的分子機制研究

陳康軒1, 2, 李詩豪1, 李富花1

(1. 中國科學院海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院大學 北京 100049)

位于甲殼動物眼柄的神經(jīng)內分泌器官在調控甲殼動物的繁殖過程中發(fā)揮著重要作用。已有證據(jù)表明“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸調控十足目雄性甲殼動物精巢的發(fā)育, 但是該過程的分子機制仍不清楚。本研究以凡納濱對蝦()為實驗對象, 研究了切除雄性對蝦的單側眼柄對促雄性腺內胰島素樣促雄性腺素基因()和精巢內基因表達的影響。結果表明, 切除單側眼柄后,基因的表達明顯上調; 比較了眼柄切除前后對蝦精巢的轉錄組數(shù)據(jù), 共有267個基因的表達量出現(xiàn)明顯變化。對精巢內差異表達基因進行功能分析發(fā)現(xiàn), 多個參與性腺發(fā)育和內分泌調控的基因發(fā)生表達上調, 如()、保幼激素環(huán)氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase,)、細胞色素P450酶系基因以及泛素化系統(tǒng)相關基因等。對差異表達基因進行熒光定量PCR驗證, 結果與轉錄組結果一致, 證實了轉錄組結果的可靠性。研究結果表明, 對蝦眼柄調控精巢的發(fā)育很可能是通過影響促雄性腺中的表達, 進而調控精巢內、、內分泌及泛素化系統(tǒng)相關基因的表達實現(xiàn)的。研究結果對深入理解甲殼動物精巢發(fā)育的分子調控機制提供了重要依據(jù), 對甲殼動物的人工繁育也具有重要指導意義。

對蝦; 眼柄; 胰島素樣促雄性腺素; 精巢發(fā)育

十足目甲殼動物眼柄內的X器官/竇腺復合體(X-organ/sinus-gland complex, XO-SG)是其神經(jīng)內分泌系統(tǒng)的中樞, 在調節(jié)動物新陳代謝、蛻皮、生殖發(fā)育等生理過程發(fā)揮著重要作用[1, 2]。通過人工摘除眼柄, 可以起到促進蛻皮、性腺成熟及生長的作用[3-7]。XO-SG復合體合成分泌的蛻皮抑制激素(Molt-inhibiting hormone, MIH)、甲殼動物雌性性激素(Crustacean female sex hormone, CFSH)、性腺抑制激素(Gonad inhibiting hormone, GIH)、甲殼動物高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone, CHHs)等一系列神經(jīng)肽激素在這些生理過程的調控中發(fā)揮著重要作用[8-13]。促雄性腺(androgenic gland, AG)是雄性甲殼動物所特有的, 其通過分泌胰島素樣促雄性腺素(Insulin-like androgenic gland hormone, IAG)參與甲殼動物雄性性別分化過程。雄性甲殼動物眼柄中的XO-SG復合體可以抑制促雄性腺的發(fā)育和基因的表達, 其中已經(jīng)證實CHH家族等眼柄神經(jīng)肽類激素直接負調控基因的表達[9, 14-17]。研究表明, 雄性甲殼動物的性別發(fā)育過程受到“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸的調控[14]。然而, 精巢中哪些基因受到“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸的調控參與雄性性別發(fā)育目前仍不十分清楚。轉錄組技術的發(fā)展和應用實現(xiàn)了對特定器官在特定條件下基因表達水平的高通量分析, 一系列性別發(fā)育相關基因也得到鑒定, 使得構建甲殼動物性腺發(fā)育的分子調節(jié)網(wǎng)絡成為可能。本研究以凡納濱對蝦為實驗對象, 研究了雄性對蝦的單側眼柄切除對促雄性腺內基因及精巢內基因表達的影響, 發(fā)現(xiàn)對蝦基因及精巢內多個參與性腺發(fā)育和內分泌調控的基因發(fā)生明顯上調表達。研究結果為深入理解甲殼動物精巢發(fā)育的分子調控機制提供了重要依據(jù), 對甲殼動物的人工繁育也具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康的雄性凡納濱對蝦()來自于青島市附近的養(yǎng)殖場(體長12 cm±0.2 cm, 體質量10.5 g±1.5 g)。

1.2 方法

1.2.1 眼柄切除

將60 尾健康的雄性凡納濱對蝦分為兩組, 一組使用酒精噴燈燒紅的鑷子從基部燙斷右側眼柄, 另外一組作為對照組, 正常飼養(yǎng)。在(25±1) ℃曝氣海水中飼養(yǎng)一周后, 取促雄性腺組織和精巢組織于液氮中速凍, –80 ℃冰箱保存。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成

使用Takara公司的RNAisol方法提取AG及精巢組織的總RNA。使用Nanodrop 2000檢測樣品濃度與純度, RNA質量檢測使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳方法。使用Thermo公司的Revert Aid Fist Strand cDNA synthesis Kit進行AG和精巢組織cDNA第一鏈的合成。

1.2.3基因表達水平檢測及轉錄組樣品制備

使用熒光定量PCR分別對眼柄切除組和對照組每只對蝦AG組織的基因表達水平進行檢測。測定后, 根據(jù)基因表達水平, 選取實驗組中該基因表達水平提高幅度較大的9個個體的精巢RNA樣品用于轉錄組測序, 另外從對照組中選擇該基因表達水平變化不大的9個體的精巢RNA樣品用于轉錄組測序。為避免蛻皮時期對基因表達的影響, 所取樣對蝦均處于蛻皮間期。每組選擇的9個精巢RNA樣品每3個混合成一個樣品, 每組包含3個生物學重復樣品。實驗組3個樣品分別命名為EAT1、EAT2和EAT3, 對照組3個樣品分別命名為ECT1、ECT2和ECT3。

1.2.4 轉錄組測序

RNA樣品送至廣州基迪奧生物科技公司測序, 首先使用帶 Oligo (dT) 的磁珠富集真核生物mRNA, 超聲片段化后作為模板進行cDNA雙鏈合成。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復與添加poly(A)尾后與測序接頭連接。用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA, 進行PCR擴增, 最后使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物, 獲得測序文庫。利用瓊脂糖凝膠電泳、Qubit2.0 Fluorometer以及Agilent 2100 bioanalyzer等方法檢測樣品純度、濃度與完整性后, 符合標準的文庫使用Illumina HiseqTM 2500測序儀進行雙末端測序。

1.2.5 測序數(shù)據(jù)比對

使用短reads比對工具Bowtie2(version 2.2.8)剔除核糖體RNA(rRNA)序列獲得clean reads。利用凡納濱對蝦參考基因組(PRJNA438564)為索引, 使用HISAT2.2.4將雙端測序的clean reads在參考基因組上進行比對。

1.2.6 生物信息分析

轉錄組數(shù)據(jù)分析參照基迪奧公司有參轉錄組分析的基本流程, 包括數(shù)據(jù)質控、序列比對分析、基因分析、 基因表達量統(tǒng)計、樣本關系分析、組間差異分析、基因功能富集等。差異表達基因的篩選標準為: 差異倍數(shù)>2和錯誤發(fā)現(xiàn)率≤0.01。

通過從相應的InterProScan或Pfam結果中基因本體注釋并進行富集分析。使用KEGG自動注釋服務器將差異表達基因信息與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對, 對涉及的基因通路進行注釋。

1.2.7 實時熒光定量PCR

對篩選到的精巢差異表達基因, 使用Primer3.0 plus設計特異性引物(表1), 使用實時熒光定量PCR驗證基因表達情況。以眼柄切除前后的精巢RNA反轉錄的cDNA為模板, 使用18S rRNA作為內參基因, 擴增條件為: 95 ℃預變性4 min; 95 ℃變性15 s, 56 ℃退火 20 s, 72 ℃延伸30 s, 擴增40個循環(huán)。使用2–ΔΔCT法計算基因的相對表達量, 對數(shù)據(jù)采用單因素方差分析[18]進行統(tǒng)計學檢驗, 以< 0.05和<0.01作為顯著性差異和極顯著差異的評價標準。

2 結果

2.1 眼柄切除對LvIAG基因表達的影響

通過real-time PCR 法檢測, 眼柄切除組中基因在促雄腺組織中的相對表達量與對照組相比上調約12.2倍(圖1), 表明眼柄切除后引起了基因的表達顯著上調。

表1 引物的序列信息及退火溫度

圖1 眼柄切除處理組與對照組LvIAG基因在促雄腺中的表達水平檢測

**. 差異極顯著(<0.01)

**. very significant difference(<0.01)

2.2 轉錄組數(shù)據(jù)分析及差異表達基因鑒定

轉錄組測序共得到原始測序序列總計230 724 552條, 經(jīng)過質量控制后獲得高質量序列共226 147 040條, 占總測序數(shù)據(jù)的98.01%, 測序信息統(tǒng)計見表2。獲得的測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對率為83.05%～85.39%, 過濾后Q20范圍為97.74%～ 98.18%, Q30在93.62%～94.44%。以上數(shù)據(jù)說明轉錄組測序的總體質量較好, 可用于后續(xù)的差異基因表達分析。

通過本次精巢差異轉錄組測序, 共獲得267個差異表達基因, 其中有238個基因呈現(xiàn)上調表達, 29個基因呈現(xiàn)下調表達(圖2)。

2.3 差異表達基因的富集分析

KEGG通路富集分析結果顯示, 眼柄切除的對蝦精巢轉錄組中差異表達基因主要富集在特定的代謝途徑, 包括轉運與分解代謝(Transport and catabolism)、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、信號分子與互作(signaling molecules and interaction)等(圖3)。

表2 實驗組和對照組精巢的轉錄組測序數(shù)據(jù)信息

圖2 實驗組和對照組精巢差異表達基因的火山圖

注: 紅色點: 表達上調基因; 黃色點: 表達下調基因; 藍色點: 表達差異不顯著基因

使用GO數(shù)據(jù)庫, 將眼柄切除實驗組中鑒定的精巢差異表達基因按照生物學過程、細胞組分和分子功能分別進行統(tǒng)計分析, 共富集到3個大類的15個過程中, 結果如圖4所示。生物過程大類富集最多, 包括代謝過程(metabolism process)、單一生物過程(single- or-ganism process) 以及細胞學過程(cellular process)。細胞組分大類中, 具有結合(binding)和催化活性(catalytic activity)的基因富集較多。

圖3 實驗組和對照組對蝦精巢差異表達基因KEGG通路富集結果

注: EAT為眼柄切除實驗組; ECT為對照組

圖4 對蝦精巢差異表達基因GO富集分析

注: 黃色部分: 實驗組相對對照組表達上調基因; 藍色部分: 實驗組相對對照組表達下調基因

2.4 差異表達基因的功能分類與定量驗證

根據(jù)已報道基因的功能, 將眼柄切除前后精巢中差異表達基因進行分類, 鑒定了一系列與性別發(fā)育、內分泌系統(tǒng)和泛素化系統(tǒng)等相關的基因(表3)。性別發(fā)育相關的基因表達量顯著上調。內分泌系統(tǒng)相關的差異表達基因均呈現(xiàn)上調表達, 包括可能參與MF降解的保幼激素酯酶基因和細胞色素P450酶系基因和。泛素化系統(tǒng)相關基因包括泛素激活酶E1(ubiquitin-activating enzyme E1)、泛素偶聯(lián)酶E2(ubiquitin-conjugating enzyme E2)和泛素特異性肽酶USP21(ubiquitin specific peptidase 21)均呈現(xiàn)上調表達趨勢, 而E3泛素連接酶SH3RF1(E3 ubiquitin-protein ligase SH3RF1)則呈現(xiàn)下調表達。

表3 對蝦精巢差異表達基因功能分類

為了驗證轉錄組中所鑒定差異表達基因的可靠性, 選取了5個差異表達基因、、、、進行RT-qPCR驗證。結果如圖5所示, 每個基因的轉錄組數(shù)據(jù)與RT-qPCR結果均具有相同的表達趨勢, 表明轉錄組差異表達基因的鑒定結果是可靠的。

圖5 精巢差異表達基因的轉錄組數(shù)據(jù)和RT-qPCR結果比較

注: *: 差異顯著(<0.05); **: 差異極顯著(<0.01)

3 討論

本研究通過對雄性凡納濱對蝦進行單側眼柄切除, 顯著提高了促雄性腺中基因的表達, 表明眼柄切除一定程度上解除了眼柄內分泌系統(tǒng)中抑制性別發(fā)育的因素。在此前提下, 通過對眼柄切除前后對蝦的精巢進行比較轉錄組分析, 鑒定到一系列與性別發(fā)育、內分泌、泛素化等過程相關的差異表達基因, 它們可能受到“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸調控參與精巢的發(fā)育過程。

3.1 性別發(fā)育相關基因受“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸調控參與精巢發(fā)育

促雄性腺表達分泌的胰島素樣促雄性腺素(IAG)除了具有促進雄性甲殼動物動物性別分化的作用外[19],在維持雄性性征及精子發(fā)生等方面也發(fā)揮關鍵作用[20]。眼柄切除后,基因表達量顯著上升, 這與眼柄內分泌系統(tǒng)中表達分泌該基因的抑制因子如CHH等神經(jīng)肽激素密切相關[9]。眼柄切除引起的基因表達升高, 對于精巢的發(fā)育過程具有促進作用。

Doublesex()是Dmrt家族成員, 它作為性別級聯(lián)通路下游的關鍵調控因子, 具有調控性別分化過程的作用[21-23]。在中國明對蝦()中,基因表達被沉默后, 顯著降低了基因的表達水平, 表明對基因的表達起到正向調控作用[24]。同時, 在個體發(fā)育過程中,基因也具有維持性腺發(fā)育的功能。多種甲殼物種中的基因在成體中呈現(xiàn)出性別二態(tài)性表達特征[25-27]。部分基因在甲殼動物精巢中特異性高表達, 說明其可能參與了精子發(fā)生過程[28-29]。在本研究中, 眼柄切除后的精巢內基因表達量顯著上調, 表明可能在“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸調控下參與精巢發(fā)育的過程。

3.2 細胞色素P450酶系基因受“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸調控參與精巢發(fā)育

在脊椎動物中, 合成類固醇的過程需要細胞色素P450酶系的參與, 例如芳香化酶基因對于脊椎動物性腺分化和發(fā)育起了重要作用[30]。在節(jié)肢動物中, 已有多個P450家族成員被報道具有調節(jié)內源性信號分子(包括蛻皮激素)、信號分子與防御用途化學物質的合成和降解的功能[31]。在甲殼動物中, 細胞色素P450被認為可以合成與代謝各種類固醇激素, 其中蛻皮激素被認為是細胞色素P450最重要的底物[32]。在海洋橈足類飛馬哲水蚤()中, 含有較高脂肪儲備的雌性個體, 體內往往有著高濃度的20E, 而在這類個體中表達量最高, 表明其參與蛻皮酮合成和脂質儲存調節(jié)過程[33]。在普通濱蟹()中,也被發(fā)現(xiàn)可能具有調節(jié)20E合成的作用[34]。

甲殼動物性腺和血淋巴中廣泛存在多種類固醇類激素。三疣梭子蟹()的卵巢組織中發(fā)現(xiàn)了17-α羥基化孕酮[35], 美洲龍蝦()精巢中發(fā)現(xiàn)孕酮會被轉化為20-α-羥基孕酮[36], 斑節(jié)對蝦()卵巢中的孕酮可被代謝為20α-dihydroprogesterone[36]。然而, 類固醇激素在甲殼動物發(fā)育、生長、性別分化以及繁殖等方面的具體作用以及細胞色素P450是否參與這些類固醇激素合成與代謝都還不明確。本研究發(fā)現(xiàn)的基因, 其同源基因最早在對加勒比海眼斑龍蝦()中報道, 對黃體酮和睪酮的單加氧反應具有催化作用[37]。及其他P450家族基因在眼柄切除后的顯著上調, 說明它們可能受“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸調控, 在凡納濱對蝦精巢發(fā)育過程中具有重要作用。

3.3 泛素化相關基因在性腺發(fā)育中的作用

泛素/蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome system, UPP)在細胞周期調控、細胞器生物發(fā)生、組織重塑等許多生化過程中發(fā)揮著重要作用[38]。泛素化依賴于3個泛素化酶的協(xié)同作用: 泛素激活酶E1以ATP依賴的方式將泛素分子C端賴氨酸(Lys)殘基同自身半胱氨酸(Cys)以硫酯鍵連接, 之后泛素分子通過高能硫酯鍵連接到泛素偶聯(lián)酶E2, 最終直接連接到目標蛋白或在泛素連接酶E3酶作用下與靶蛋白通過形成氨基異肽鍵連接, 從而實現(xiàn)對靶蛋白的標記分類[39]。泛素化調節(jié)過程也是可逆的, 這一過程由去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBs)介導, 主要分為5個家族: 泛素羧基末端水解酶(ubiquitin carboxy-terminal hydrolases, UCH)家族, 泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases, USP/ UBP)家族, Otubaim(OTU)家族, Josephin結構域蛋白家族及AB1/MPN/Mov34 metalloenzyme(JAMM)家族[40]。

UPP在性別發(fā)育過程中的作用已在多種動物中有報道。在家豬(Sus scrofa domestica)中,編碼的泛素激活酶E1參與到了精子發(fā)生過程, 在精子獲能和頂體功能方面發(fā)揮作用[41]。在大鼠()中,特異表達于精原細胞, 其可能通過泛素/蛋白酶體系統(tǒng)來影響精子發(fā)生[42]。在小鼠()中, 使用特異性抑制劑PYR-41 處理的卵細胞, 通過干擾常見的泛素化靶蛋白β-catenin, 導致精卵融合后精子體積的增大和染色體減數(shù)分裂的阻滯[43]。在秀麗隱桿線蟲()中, Cul-2泛素連接酶復合物以Fem-1為識別亞基, 以Fem-2和Fem-3輔因子, 通過蛋白酶體依賴性降解TRA-1實現(xiàn)性別決定的最后一步[44]。線蟲基因發(fā)揮重要的泛素化功能, 在精子發(fā)生、體型調控和性別分化發(fā)育等方面發(fā)揮作用[45-47],基因突變阻滯了線蟲精子的減數(shù)分裂過程[48]。在果蠅中, 去泛素化酶Usp9x被發(fā)現(xiàn)參與了性腺發(fā)育和卵子發(fā)生[49]。在甲殼動物中, UPP被認為通過調控蛋白質水解速率, 在性別分化和配子發(fā)生過程中起作用[50]。在日本對蝦中, 泛素結合酶E2r ()基因在雌雄性腺中的表達呈周期性波動, 暗示著在精子發(fā)生和卵子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[51]。在斑節(jié)對蝦中，通過性腺抑制性消減雜交文庫分析, 泛素連接酶E2被鑒定為性別相關基因[52]。本研究發(fā)現(xiàn)泛素化相關基因ubiquitin-activating enzyme E1、ubiquitin-conjugating enzyme E2和E3 ubiquitin-protein ligase SH3RF1以及去泛素化酶ubiquitin specific peptidase 21均在眼柄切除后的精巢中發(fā)生顯著差異表達。結果表明, 泛素/蛋白酶體途徑可能在“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸的調控下, 在對蝦精巢的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

3.4 甲基法尼酯(methyl farnesoate, MF)代謝相關基因在性腺發(fā)育中的作用

在甲殼動物中, 由大顎器官(mandibular organ, MO)分泌的MF起到了與昆蟲保幼激素(juvenile hormone, JH)類似的作用[53], 在甲殼動物發(fā)育、生長、蛻皮和繁殖等過程中發(fā)揮功能[54]。在昆蟲中, 保幼激素環(huán)氧化物水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase, JHEH)主要負責調節(jié)保幼激素JH的水平[55]。JHEH可以打開JH環(huán)氧環(huán), 生成無生物活性的JH二醇[56], 調節(jié)昆蟲的變態(tài)發(fā)育和生殖過程[57]。雖然目前沒有證據(jù)表明MF會被JHEH降解, 但在中華絨螯蟹()、日本沼蝦()和中華新米蝦()中都鑒定到基因[58], 其表達量與性成熟狀態(tài)或蛻皮周期相關[59], 推測其功能依然和MF濃度調節(jié)有關。在本研究中,在眼柄切除的精巢組織中發(fā)生顯著上調表達, 暗示著其受“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸調控參與精巢發(fā)育過程。

4 結論

本研究通過單側切除雄性對蝦的眼柄, 研究了眼柄內分泌系統(tǒng)對胰島素樣促雄性腺素基因()和精巢內基因表達的影響, 鑒定了精巢中多個與性別發(fā)育、內分泌、泛素化等過程相關的差異表達基因。研究結果揭示了“眼柄-促雄性腺-精巢”內分泌軸通過調控促雄性腺中基因及精巢中一系列基因的表達參與精巢發(fā)育的過程, 為深入理解甲殼動物精巢發(fā)育的分子調控機制提供了重要依據(jù), 對甲殼動物的人工繁育也具有重要指導意義。

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Regulatory mechanisms of the eyestalk-androgenic gland-testis endocrine axis on testis development in

CHEN Kang-xuan1, 2, LI Shi-hao1, LI Fu-hua1

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The neuroendocrine system in crustacean eyestalks regulates the reproduction process. According to previous studies, the eyestalk–androgenic gland (AG)–testis endocrine axis regulates testis development in decapod crustacean species. However, the underlying molecular mechanism remains largely unknown. The Pacific white shrimp () was used in this study to investigate how unilateral eyestalk ablation regulates the expression of insulin-like AG hormones () in AG, and genes in the testis. According to the results, after unilateral eyestalk ablation, theexpression level was significantly upregulated. The transcriptome data of shrimp testis before and after unilateral eyestalk ablation were compared. A total of 267 genes were identified as differentially expressed genes (DEGS). Functional analysis showed that Some genes involved in gonad development and endocrine regulation, such as Doublesex (), juvenile hormone epoxide hydrolase (), genes related to the cytochrome P450 enzyme system, and genes related to the ubiquitylation system, were significantly upregulated. The expression of several DEGs were confirmed using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), which revealed that their expression trends were consistent with those in the transcriptome data, implying that the transcriptome data were reliable. The results indicated that the endocrine system in eyestalk influenced testis development by regulating the expression ofin AG, which in turn regulated the expression of,, and genes in the endocrine and ubiquitylation systems in the testis. The results not only contribute to a better understanding of the molecular mechanisms regulating testis development but also provide significant direction for the artificial reproduction of crustaceans.

penaeid shrimp; eyestalk; insulin-like androgenic gland hormone; testis development

May 11, 2021

S917.4

A

1000-3096(2021)11-0062-11

10.11759/hykx20210511001

2021-05-11;

2021-05-19

國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0900202); 中以(NSFC-ISF)國際(地區(qū))合作與交流項目(31861143047)

[The National Key Research and Development Program of China, No. 2018YFD0900202; the Joint NSFC-ISF Research Program, No. 31861143047]

陳康軒(1996—), 男, 山東青島人, 碩士研究生, 主要從事海洋生物學研究, 電話: 13717691662, E-mail: 15561576203@163. com; 李富花(1965—),通信作者, 電話: 0532-82898836, E-mail: fhli@qdio.ac.cn

(本文編輯: 譚雪靜)