安東 王成麗 曹斌 盧煒 葛夢(mèng)婷 楊將輝

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 225300）

雞志賀氏菌病是志賀氏菌引發(fā)的一種細(xì)菌性痢疾病[1]，病原菌有鮑氏志賀菌、痢疾志賀氏菌等。雞志賀氏菌病具有較強(qiáng)的傳染性，且發(fā)病突然，病程短，主要通過(guò)消化道途徑感染，幼齡雛雞感染率和致死率最高[2]。病雞感染后出現(xiàn)精神不振，采食量下降，水樣腹瀉，嚴(yán)重者夾雜血液，日齡越小雛雞死亡率越高，整個(gè)病程可持續(xù)3～7d[3]。由于雞志賀氏菌病對(duì)常用的鏈霉素有一定的耐藥性，若用藥不當(dāng)會(huì)加重病情擴(kuò)散，引發(fā)更多雞只感染。由于該病原體可感染人類(lèi)，對(duì)食用者腸道菌群健康具有破壞作用，必須做好雞志賀氏菌病防治管理。本試驗(yàn)對(duì)江蘇地區(qū)5 個(gè)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)農(nóng)戶(hù)進(jìn)行隨機(jī)抽樣調(diào)查，通過(guò)平板凝集試驗(yàn)了解該地區(qū)志賀氏菌流行情況，為開(kāi)展雞志賀氏菌病的凈化提供參考。

1 材料與方法

1.1 抗原和血清

雞志賀氏菌平板凝集染色抗原、陽(yáng)性血清和陰性血清由本實(shí)驗(yàn)室自行制備。

1.2 稀釋液

0.15%的石炭酸生理鹽水（pH7.2）由本實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.3 培養(yǎng)基

ss 瓊脂平板培養(yǎng)基采購(gòu)于浙江天杭生物科技股份有限公司。1%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.4 受檢雞群

檢測(cè)血清來(lái)自于江蘇地區(qū)的5 個(gè)規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)、35 戶(hù)農(nóng)家散養(yǎng)XXX 雞只，血清采集數(shù)量共700 份，其中規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)500份，農(nóng)家散養(yǎng)200 只。采血部位為雞翅靜脈，血清由血液高速離心獲得，血清樣本置于-20℃保存，每只雞采血量為500uL。

1.5 制備抗原

（1）培養(yǎng)種菌：將純化好的菌株接種到滅菌好的牛肉湯蛋白胨內(nèi)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h。

（2）細(xì)菌接種：將鮑氏志賀菌液均勻地涂抹在ss 瓊脂平板培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h，促進(jìn)病原菌大量繁殖。同樣方法接種痢疾志賀氏菌。

（3）采集培養(yǎng)的細(xì)菌：培養(yǎng)過(guò)后可發(fā)現(xiàn)不同平板內(nèi)均長(zhǎng)滿(mǎn)病原菌，兩種病原菌培養(yǎng)基表面分別加入適量的稀釋液至表面濕潤(rùn)，然后刮取表面病原菌，全部移入無(wú)菌瓶中。

（4）細(xì)菌滅活：鮑氏志賀菌液和痢疾志賀氏菌液分別置于121℃高壓滅活，滅菌時(shí)間為2h30min。

（5）濃縮抗原：將抗原進(jìn)一步濃縮，根據(jù)離心法將不同質(zhì)量的物質(zhì)進(jìn)行離心，得到所需要物質(zhì)，離心轉(zhuǎn)速為每分鐘4000r，離心時(shí)間為20min，用無(wú)菌吸管緩慢吸棄上清，該步驟充分多處直至上清液無(wú)雜質(zhì)且清涼，最后棄掉全部上清液，保留管底菌體。

（6）調(diào)整濃度：最終抗原濃度為40 億/ml，用無(wú)菌吸管將細(xì)菌分散開(kāi)來(lái)。

（7）抗原染色：提取一部分溶液，將這部分溶液進(jìn)行抗原染色。加入適量的堿性亞甲藍(lán)染色液進(jìn)行染色，充分混勻。

（8）保存方法：制備好的2 種不同的抗原菌放入冰箱冷藏保存，以備后續(xù)使用。

1.6 被檢血清處理

采集的雞只血清在檢測(cè)前放置于56℃水浴鍋內(nèi)孵育30min進(jìn)行滅活處理。

1.7 檢測(cè)方法

采用平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)開(kāi)始前將所有血清（含待檢測(cè)、陽(yáng)性、陰性）及制備的抗原放置于室溫條件下1h，讓試劑溫度較為均一，實(shí)驗(yàn)溫度為25～30℃。用蠟筆將玻璃板平均分成6 格，將制備的鮑氏志賀菌凝集反應(yīng)抗原滴加在前3 個(gè)格，第1 格內(nèi)加入待檢血清，第2 格加入雞志賀氏菌病陽(yáng)性血清（陽(yáng)性對(duì)照），第3 格加入等量生理鹽水（引性對(duì)照），將制備的痢疾志賀氏菌凝集反應(yīng)抗原滴加在后3 個(gè)格，第4 格內(nèi)加入待檢血清，第5 格加入雞志賀氏菌病陽(yáng)性血清（陽(yáng)性對(duì)照），第6 格加入等量生理鹽水（引性對(duì)照）。每個(gè)反應(yīng)時(shí)間為5min。

1.8 結(jié)果判斷

陽(yáng)性檢查結(jié)果：整個(gè)液體血滴凝集成白色花斑狀，凝集片或成片狀凝集大小的顆粒，分布在液體血滴的各個(gè)邊緣，肉眼觀察較明顯。

陰性試驗(yàn)結(jié)果：白色混合液仍然能保持原來(lái)的白色狀態(tài)，或逐漸變成白色中心部分較濃的白色圓點(diǎn)狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雞場(chǎng)雞志賀氏菌病感染調(diào)查結(jié)果

如表1 所示，在700 份待檢血清中共檢測(cè)出82 份雞志賀氏菌病陽(yáng)性血清，其中規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)檢測(cè)樣本數(shù)量為500 份，陽(yáng)性血清樣本42 份，陽(yáng)性率8.6%；農(nóng)戶(hù)散養(yǎng)檢測(cè)樣本數(shù)量為200份，陽(yáng)性血清樣本40 份，陽(yáng)性率20.0%。從感染情況來(lái)看，規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)鮑氏志賀菌感染數(shù)量為22 份（占比51.16%），痢疾志賀氏菌感染數(shù)量為15 份（占比34.88%），混合感染數(shù)量為6 份（占比13.95%）；農(nóng)戶(hù)散養(yǎng)鮑氏志賀菌感染數(shù)量為19 份（占比47.50%），痢疾志賀氏菌感染數(shù)量為12 份（占比30.00%），混合感染數(shù)量為9 份（占比22.50%）。

表1 不同養(yǎng)殖方式雞志賀氏菌病感染情況調(diào)查

2.2 不同群體雞志賀氏菌病感染調(diào)查結(jié)果

如表2 所示，商品雞陽(yáng)性率最高，383 份樣本中檢測(cè)陽(yáng)性血清57 份，陽(yáng)性率為14.88%，其次為后備母雞，陽(yáng)性率為8.98%，而種母雞陽(yáng)性率為7.14，種公雞未檢測(cè)出陽(yáng)性雞志賀氏菌病。從感染情況看，商品雞鮑氏志賀菌感染數(shù)量為29 份（占比50.88%），而痢疾志賀氏菌感染數(shù)量為17 份（占比29.8 2%），混合感染數(shù)量為11 份（占比19.30%）；后備母雞鮑氏志賀菌感染數(shù)量為11 份（占比50.0%），痢疾志賀氏菌感染數(shù)量為8 份（占比36.36%），混合感染數(shù)量為3 份（占比13.64%）。

表2 不同群體雞志賀氏菌病感染情況調(diào)查

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)自制的雞志賀氏菌平板凝集染色抗原可用于檢測(cè)雞志賀氏菌，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖方式和飼養(yǎng)群體的雞志賀氏菌病感染情況不同。從養(yǎng)殖方式看，規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)由于飼養(yǎng)方式較為科學(xué)，調(diào)查的5 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)均采用分群飼養(yǎng)管理，且每周進(jìn)行1～2 個(gè)雞舍消毒工作，養(yǎng)殖人員進(jìn)出雞舍要更換衣物和清潔消毒，在養(yǎng)殖方式較為科學(xué)的條件下，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)雞志賀氏菌病陽(yáng)性率明顯低于農(nóng)戶(hù)散養(yǎng)模式。表明在管理粗放、衛(wèi)生條件不良的條件下，雞志賀氏菌病具有較高的發(fā)病率。若散養(yǎng)戶(hù)不采用科學(xué)的飼養(yǎng)模式，缺乏定期消毒觀念，會(huì)進(jìn)一步加重雞志賀氏菌病感染情況，增加雞志賀氏菌病防治難度。

從養(yǎng)殖群體看，商品雞感染雞志賀氏菌病最嚴(yán)重，陽(yáng)性率高達(dá)14.88%，而后備母雞和種母雞也存在感染情況。商品雞發(fā)病率高的原因也和養(yǎng)殖方式有關(guān)，由于散養(yǎng)戶(hù)主要養(yǎng)殖商品雞，且養(yǎng)殖觀念較為落后，疫苗接種不當(dāng)會(huì)增加感染幾率，甚至有散養(yǎng)戶(hù)存在“不發(fā)病不接種”的錯(cuò)誤思想，造成雞群存在隱性感染雞只。江蘇地區(qū)應(yīng)進(jìn)一步加大科學(xué)養(yǎng)殖宣傳工作，鼓勵(lì)養(yǎng)殖戶(hù)每年進(jìn)行至少2 次雞群檢疫，及時(shí)淘汰病雞和可疑雞只，每周對(duì)雞舍進(jìn)行消毒，尤其是雛雞要與不同日齡雞分群飼養(yǎng)，這樣可減少雛雞雞志賀氏菌病發(fā)病率和死亡率。