顧叢叢

（山東省桓臺(tái)縣畜牧漁業(yè)服務(wù)中心 256400）

1 材料

1.1 采樣用品

磷酸鹽緩沖保護(hù)液（含有30%甘油和10%雙抗）、一次性使用滅菌棉拭子、75%酒精、1.5ml EP 管、EDTAk2 無菌抗凝管、記號筆、冰袋、封口袋、剪刀、記號筆、防護(hù)服、口罩、防護(hù)帽、手套等。

1.2 主要試劑和儀器

病毒DNA/RNA 提取試劑盒（4.0），西安天龍科技有限公司生產(chǎn)。非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測試劑盒，本試劑盒采用Taqman 探針實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real time PCR），對非洲豬瘟病毒核酸進(jìn)行定性或定量檢測，深圳真瑞生物科技有限公司生產(chǎn)。全自動(dòng)核酸提取儀是西安天龍科技有限公司生產(chǎn)的NP968 -C，熒 光 定 量 PCR 儀 器 是 Applied Biosystems QuantStudio 3，生物安全柜是Thermo Fisher Scientific Model 1389。

2 采樣

2.1 采樣依據(jù)

本次采樣主要根據(jù)《2020 年淄博市非洲豬瘟監(jiān)測實(shí)施方案》 《關(guān)于加強(qiáng)病死豬無害化處理環(huán)節(jié)非洲豬瘟風(fēng)險(xiǎn)管控的通知》 《2020 年桓臺(tái)縣縣級動(dòng)物疫病監(jiān)測方案》 等。

2.2 樣品要求

固體環(huán)境樣品應(yīng)放置在加有PH7.2 PBS 的1.5ml EP 管中，液體樣品直接放在1.5ml EP 管中，不得少于1ml/管。每頭豬的樣品應(yīng)單獨(dú)包裝、編號，同一場點(diǎn)的樣品應(yīng)再加外包裝，防止?jié)B漏，樣品運(yùn)輸過程中應(yīng)盡量保持低溫。

每家養(yǎng)豬場戶采集兩欄豬舍的樣品，包括豬糞：四角及中心位置每欄采集5 份拭子，放入1 個(gè)采樣管中；污水：每欄采集1 份，不低于1ml/份；眼鼻拭子、肛門拭子：每欄采集2 頭豬的拭子，同一頭豬的眼鼻拭子、肛門拭子放入同一個(gè)EP 管中。病死豬的樣品采集肛門拭子放入EP 管中，抗凝血樣品主要采集了兩家養(yǎng)殖場，每家養(yǎng)豬場戶采集30 份抗凝血，每頭豬不少于5ml/管。

2.3 樣品采集

本次樣品采集針對縣域內(nèi)的生豬養(yǎng)殖場戶，從2020 年1～12 月，連續(xù)監(jiān)測12 個(gè)月。重點(diǎn)采集了病死豬樣品，特別是出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽、扎堆、腹瀉、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、皮膚潰爛、耳朵發(fā)紺等癥狀、經(jīng)治療無效的死亡豬的肛門拭子樣品，其次，每月采集7 家年出欄量在2000 頭以下生豬養(yǎng)殖場戶的樣品，包括豬糞、污水、眼鼻拭子、肛門拭子、EDTAk2 抗凝血樣品，共采集樣品約450 余份。

2.4 樣品處理

檢測前樣品應(yīng)在二級生物安全柜中處理。棉拭子樣品加入1mL 的0.01mol/L PBS (pH7.2)，取出棉拭子，13000rpm 離心10min，保留上清備用；污水樣品10000rpm 離心10min，保留上清備用；豬糞樣品于EP 管中加入1ml 滅菌生理鹽水，混勻，10000rpm 離心10min，保留上清備用。抗凝血樣品取1ml 放入EP 管中，10000rpm 離心10min，保留上清備用。將上述處理的樣品置于60℃條件下滅活30min。

2.5 樣品保存

采集或處理好的樣品在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；如需長期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(凍融不超過3 次)。

3 檢測步驟

3.1 核酸提取

3.1.1 預(yù)封裝試劑準(zhǔn)備

從試劑盒中取出真空包裝的預(yù)封裝試劑，顛倒混勻數(shù)次使磁珠重懸，去掉真空包裝，輕甩孔板，使試劑及磁珠均集中到孔板底部，使用前小心撕去鋁箔封口膜，避免振動(dòng)，防止液體濺出。

在預(yù)封裝試劑的第1 或7 列中分別加入20μl 蛋白酶K 溶液，200μl 樣本，陰陽性對照無需進(jìn)行核酸提取處理，可直接用于熒光PCR 檢測。

NP968 系列核酸提取儀按以下程序進(jìn)行自動(dòng)化提取。

（1）移磁，混合時(shí)間1min，磁吸時(shí)間10s，溫度0℃。

（2）裂解，混合時(shí)間5min，磁吸時(shí)間45s，90℃裂解加熱。

（3）洗滌1，混合時(shí)間2min，磁吸時(shí)間30s，90℃洗脫加熱。

（4）洗滌2，混合時(shí)間1min，磁吸時(shí)間20s，90℃洗脫加熱。

（5）洗滌3，混合時(shí)間1min，磁吸時(shí)間20s，90℃洗脫加熱。

（6）洗脫，混合時(shí)間5min，磁吸時(shí)間35s，90℃洗脫加熱。

（7）棄磁，混合時(shí)間1min，磁吸時(shí)間0s，溫度0℃。

自動(dòng)化程序結(jié)束后，將第6 或12 列的洗脫液轉(zhuǎn)移至干凈的無核酸酶離心管中。

3.1.2 試劑配制

取ASFV 核酸熒光PCR 檢測混合液（n×22.5μl）與Taq 酶（n×0.4μl）混合，震蕩混勻數(shù)秒，3000rpm 離心數(shù)秒。

3.1.3 加樣

取上數(shù)混合液22.5μl 于PCR 反應(yīng)管中，然后將陰性對照品、已處理樣品、陽性對照品各2.5μl 分別加入PCR 反應(yīng)管中，蓋好PCR 反應(yīng)管蓋，立即進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。

3.1.4 PCR 擴(kuò)增

反應(yīng)管置于定量熒光PCR 儀上，采用常規(guī)模式，94℃，2min，循環(huán)數(shù)1；93℃，15s，60℃，60s，循環(huán)數(shù)40。單點(diǎn)熒光檢測在60℃，熒光通道檢測選擇：FAM，passive reference 和quencher 處選擇none。

3.1.5 基線和閾值設(shè)定

基線調(diào)整取6～15 個(gè)循環(huán)的熒光信號，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過陰性對照品的最高點(diǎn)。

3.1.6 結(jié)果成立條件

陽性對照品：CT 值≤35。陰性對照品：未檢出。以上需求需要同時(shí)滿足，否則本次試驗(yàn)無效，需要重新進(jìn)行，參見附表。

附表 CT值評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表

4 結(jié)果

每月檢測一次，對450 余份樣品檢測結(jié)果均為陰性，未檢出ASFV 核酸。監(jiān)測曲線，見附圖。

附圖 ASFV核酸監(jiān)測曲線圖

5 討論

經(jīng)過為期12 個(gè)月的監(jiān)測，全縣養(yǎng)殖場戶的環(huán)境樣品，如豬糞、污水非洲豬瘟監(jiān)測均為陰性，肛門、眼鼻拭子也均為陰性，該結(jié)果與恒臺(tái)縣有效防控非洲豬瘟的工作落實(shí)有關(guān)。這些工作措施如下。

（1）宣傳教育到位?？h防控指揮部利用專題會(huì)、明白紙、宣傳畫、廣播電視、微信平臺(tái)等，廣泛宣傳非洲豬瘟的防控知識(shí)，消除養(yǎng)殖場戶的恐慌心理，增強(qiáng)防控信心，推動(dòng)非洲豬瘟防控工作開展。

（2）疫情排查到位。非洲豬瘟防控工作抓早抓小是關(guān)鍵，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早處置，全縣八個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)配備20 余名專業(yè)技術(shù)人員，33 名村級動(dòng)物防疫員按照各自的防疫責(zé)任區(qū)域，每天1 排查、2 報(bào)告，做到排查不漏戶（場）、排查有簽字、現(xiàn)場有記錄。

（3）全程監(jiān)管到位。各項(xiàng)防控措施安排及時(shí)得當(dāng)、鄉(xiāng)鎮(zhèn)疫情排查上報(bào)及時(shí)、基層畜牧獸醫(yī)防控技術(shù)宣傳指導(dǎo)到位、動(dòng)物衛(wèi)生檢疫檢測到位、公路檢查站、生豬產(chǎn)品市場監(jiān)管到位。

（4）檢疫檢驗(yàn)到位，縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心投資一百余萬元，擴(kuò)建了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，為全縣非洲豬瘟的監(jiān)測提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障。此外，有效的宣傳使恒臺(tái)縣部分生豬規(guī)模養(yǎng)殖場對疾病認(rèn)識(shí)非常到位，自我提高生物安全辦廠要求，自費(fèi)購買熒光PCR 儀等設(shè)備，對生豬、豬舍污染物、飼料、養(yǎng)殖環(huán)境等進(jìn)行日常監(jiān)測，投入的同時(shí)也帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

（5）物質(zhì)保障到位。物質(zhì)經(jīng)費(fèi)保障是做好非洲豬瘟防控工作的重要保障，村防疫人員的薪資全部納入財(cái)政支付，全縣各項(xiàng)應(yīng)急物資儲(chǔ)備，生活設(shè)施、車輛運(yùn)行、生活補(bǔ)助，督查人員的車輛運(yùn)行，防控指揮部印發(fā)各項(xiàng)防控資料、宣傳材料、防控明白紙，應(yīng)急無害化處置補(bǔ)助等經(jīng)費(fèi)支出，雖然數(shù)量很大，均能及時(shí)撥付。

生豬養(yǎng)殖過程中非洲豬瘟的防控工作不是一個(gè)單獨(dú)部門或養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的工作，需要養(yǎng)殖過程中的各部門及飼養(yǎng)環(huán)節(jié)相互聯(lián)合，做好聯(lián)防聯(lián)控工作才能做好非洲豬瘟防控工作。