陳炯宇，覃英，謝顯秋，黃毓燕，董登峰，邢永秀，李楊瑞

摘? 要：葡萄糖脫氫酶（GDH）和吡咯喹啉醌（PQQ）對(duì)溶磷微生物溶解無(wú)機(jī)磷具有重要作用。本研究為了探討甘蔗內(nèi)生固氮菌變棲克雷伯菌（Klebsiella variicola）DX120E的溶磷機(jī)制，從該菌中克隆溶磷基因GDH和pqqE的ORF，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)還研究了該菌對(duì)不同磷源的利用能力。結(jié)果表明：克隆得到甘蔗內(nèi)生固氮菌Klebsiella variicola DX120E GDH和pqqE基因的ORF分別為2373 bp和1143 bp，編碼氨基酸分別為790個(gè)和380個(gè)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，GDH蛋白為穩(wěn)定蛋白，pqqE蛋白為不穩(wěn)定蛋白。GDH蛋白是一個(gè)與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白，具有PQQ_membr_DH、PQQ_mGDH功能域和PQQ_DH_like超家族蛋白結(jié)構(gòu);pqqE基因編碼的蛋白是胞內(nèi)蛋白，含有1個(gè)PQQ_syn_pqqE功能域和Radical SAM超家族蛋白的結(jié)構(gòu)。內(nèi)生固氮菌Klebsiella variicola DX120E對(duì)不同磷源的利用和GDH和pqqE基因在不同磷源培養(yǎng)時(shí)的qRT-PCR分析表明，該菌對(duì)不同磷源的溶磷能力表現(xiàn)為FePO4>AlPO4>Ca3（PO4）2，且溶解FePO4的能力與溶解Ca3（PO4）2、AlPO4等難溶磷源的差異均顯著（P<0.05）。在幾種磷源條件下，GDH和pqqE基因相對(duì)表達(dá)量均增加，且2個(gè)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)一致。GDH和pqqE基因在以FePO4為磷源條件下的表達(dá)量與以Ca3（PO4）2為磷源的表達(dá)量差異顯著（P<0.05）。本研究可為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生固氮菌與甘蔗的互作和溶磷機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞：甘蔗;Klebsiella variicola DX120E;GDH;pqqE;溶磷特性

中圖分類號(hào)：S566.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Cloning of Phosphorus-soluble Gene GDH and pqqE from Sugarcane Endogenous Nitrogen-fixing Bacteria Klebsiella variicola DX120E

CHEN Jiongyu1， QIN Ying1， XIE Xianqiu1， HUANG Yuyan1， DONG Dengfeng1， XING Yongxiu1*， LI Yangrui1，2*

1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Sugarcane Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences / Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： Glucose dehydrogenase （GDH） and pyrroloquinoline quinone （PQQE） play an important role in the dissolution of inorganic phosphorus by phosphorus-soluble microorganisms. The phosphorus-soluble mechanism of the nitrogen-fixing bacteria Klebsiella variicola DX120E in sugarcane was investigated. The ORF of the phosphorous-soluble gene GDH and pqqE were cloned from the bacterium and analysised by bioinformatics. At the same time， the utilization ability of the bacteria to different phosphorus sources was studied. The ORF of GDH and pqqE was 2373 bp and 1143 bp， the coding amino acids were 790 and 380， respectively. Bioinformatics analysis showed that GDH was a stable protein， but pqqE was an unstable one. GDH was a membrane receptor protein related to cell signaling， with PQQ_membr_ DH， PQQ_mGDH functional domain and PQQ_DH_like superfamily protein structure. pqqE encoded proteins called intracellular proteins， structure containing PQQ_syn_pqqE functional domain and Radical SAM superfamily proteins. The utilization of different phosphorus sources and the qRT-PCR analysis of GDH and pqqE in different phosphorus sources showed that under different conditions， the ability of the bacteria to dissolve phosphorus was FePO4>AlPO4> Ca3（PO4）2 and the ability to dissolve FePO4 was significantly different from that of Ca3（PO4）2 and AlPO4（P<0.05）. Under the condition of several phosphorus sources， the relative expression of GDH and pqqE increased， and the expression change trend of the genes was the same. The expression of GDH and pqqE in phosphorus source was significantly different from that in Ca3（PO4）2（P<0.05）. This study would lay a foundation for further study on the interaction and phosphorus dissolution mechanism between endophytic nitrogen-fixing bacteria and sugarcane.

Keywords： sugarcane; Klebsiella variicola DX120E; GDH; pqqE; phosphorus-soluble characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.010

磷是植物必需的大量元素，但大量的可溶性無(wú)機(jī)磷肥作為化肥施于土壤后大多被固定，植物無(wú)法利用[1]。廣西是我國(guó)土壤含磷量較低的地區(qū)，土壤全磷含量一般為0.03%～0.15%，全磷含量低于0.06%的土地面積約占85%。施用的磷肥絕大部分保留于土壤中[2]。溶磷微生物在土壤中分布十分廣泛，能使土壤中無(wú)機(jī)磷酸鹽溶解或有機(jī)磷磷酸鹽礦化，進(jìn)一步提高土壤中磷的利用率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。前蘇聯(lián)學(xué)者蒙金娜首次報(bào)道巨大芽孢桿菌具有溶磷特性[5]。Jain等[6]從綠豆根際分離得到具有溶磷能力的曲霉S29（Aspergillus sp.），該菌能夠溶解各種無(wú)機(jī)形式的磷酸鹽，對(duì)綠豆生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。還有研究發(fā)現(xiàn)[7-10]溶磷微生物具有植物根際促生細(xì)菌（plant growth promoting rhizobacteria， PGPR）菌株的許多特性，能夠產(chǎn)生生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素（CK）及分泌鐵載體等物質(zhì)，促進(jìn)植物對(duì)鉀、鈣、鎂和鋅等元素的吸收。不同作物間作也可提高土壤磷的利用效率[11-12]，為活化土壤難溶磷以促進(jìn)作物生長(zhǎng)提供了新思路。因此，具有溶磷能力的微生物對(duì)于環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略實(shí)施具有重要意義。

具有溶磷能力的微生物通過(guò)分泌磷酸酶、葡萄糖脫氫酶（GDH）以及核酸酶等來(lái)溶解難溶性的無(wú)機(jī)磷或者有機(jī)磷，進(jìn)而發(fā)揮溶磷作用[11]。吡咯喹啉醌（PQQ）是GDH等的輔酶，溶磷菌在GDH和PQQ以及金屬離子如Mg2+或Ca2+的共同作用下參與葡萄糖酸溶磷代謝，溶解土壤無(wú)機(jī)或有機(jī)磷酸鹽，將不溶性無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化成可被植物吸收利用的有效磷，促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的攝入和植物生長(zhǎng)[12-13]。GDH的激活需要輔因子PQQ的參與才能產(chǎn)生葡萄糖酸，二者缺一不可[14]。PQQ由pqqABCDEF操縱子編碼合成，包含pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE和pqqF 6個(gè)基因在內(nèi)的基因簇，其中pqqE對(duì)PQQ的生物合成至關(guān)重要[14-15]。本課題組Lin等[16]從廣西大新縣種植的甘蔗品種‘新臺(tái)糖22號(hào)（ROC22）根內(nèi)分離到一株變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E，該菌具有高固氮活性、分泌生長(zhǎng)素和鐵載體以及溶解無(wú)機(jī)磷特性等促生長(zhǎng)特性，但其溶磷機(jī)制還未見報(bào)道。本研究通過(guò)克隆DX120E的溶磷基因GDH和pqqE，并分析其在不同難溶磷源的溶磷能力和基因相對(duì)表達(dá)量，探討該菌溶磷能力及機(jī)制，研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究甘蔗內(nèi)生固定菌DX120E與甘蔗的互作和溶磷機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

菌株Klebsiella variicola DX120E為本課題組分離[16]。

1.2? 試驗(yàn)試劑

克隆載體pMD18-T Vector、PCR擴(kuò)增試劑、分子克隆試劑均購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司;大腸桿菌株DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3? 引物設(shè)計(jì)合成

根據(jù)GenBank中登陸的GDH和pqqE基因的核苷酸序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列如表1所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4? GDH和pqqE基因PCR擴(kuò)增

以甘蔗內(nèi)生固氮菌DX120E為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25.0 μL反應(yīng)體系：EsTaq Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃ 6 min。擴(kuò)增結(jié)束后在1.0%瓊脂糖凝膠糖1.0 TAE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳。

1.5? GDH和pqqE基因的生物信息學(xué)分析

參考孟富宣等[17]和范曉軍等[18]采用的生物信息學(xué)分析方法：用NCBI ORF finder（http：//www. Ncbi.Nlm.nih.gov/gorf/gorf.htm1）進(jìn)行開放閱讀框查找;用BioXM 2.6預(yù)測(cè)該基因的氨基酸序列;用ExPASy（http：//expasy.org/tools/）對(duì)該基因推測(cè)蛋白質(zhì)序列的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析;用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignaIP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè);用GenBank Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）在線分析軟件分析甘蔗GDH和pqqE基因與其他物種的同源性;用TMHMMServer2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析;利用MotifScan、protein blast程序（http：//blast.ncbi.nlm. nih.gov/ Blast.cgi）分別對(duì)GDH和pqqE的蛋白質(zhì)功能和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.6? DX120E對(duì)不同難溶磷源的溶磷能力測(cè)定

按照NBRIP培養(yǎng)基的組分含量，將Ca2（PO4）3改為AlPO4、FePO4，質(zhì)量不變，制成液體培養(yǎng)基。挑取在平板中生長(zhǎng)的單菌落，將其接入液態(tài)LB培養(yǎng)基之內(nèi)，調(diào)整至150 r/min和37 ℃的條件進(jìn)行培養(yǎng)，再調(diào)節(jié)菌液使其OD600=1.0，這樣便得到了種子液。取300 μL種子液接入含有10 mL液態(tài)LB培養(yǎng)基的指型瓶中，同樣選擇150 r/min和37 ℃的條件來(lái)培養(yǎng)，做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以接入的無(wú)菌水作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)后用鉬銻抗比色法評(píng)價(jià)溶磷效果[19]。

1.7? 不同難溶磷源中GDH和pqqE基因相對(duì)表達(dá)量分析

用Primer 5設(shè)計(jì)基因的熒光定量引物，內(nèi)參基因選用DX120E 16S RNA基因，設(shè)計(jì)引物（表2）。熒光定量PCR體系和反應(yīng)程序依照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行（Vazyme公司的ChamQ TM Universal SYBR?qPCR Master Mix）。各處理均進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)處理3次，技術(shù)性重復(fù)3次，采用2–??Ct法分析不同磷源條件下GDH和pqqE基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.8? 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及差異顯著性分析，利用Graphpad軟件制圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? GDH和pqqE基因的克隆

以甘蔗內(nèi)生固氮菌DX120E為模板，用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增所得到片段大小與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相符，GDH和pqqE基因的片段大小分別約為2000 bp和1000 bp（圖1）。將經(jīng)回收純化的產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，所篩選出的陽(yáng)性克隆送深圳華大基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果GDH和pqqE基因分別為2373 bp和1143 bp。GDH基因GenBank登錄號(hào)為MW026649，編碼790個(gè)氨基酸（圖2）。pqqE基因GenBank登錄號(hào)為MW026650，編碼380個(gè)氨基酸（圖3）。

M：DL5000 marker;1：GDH基因;2：pqqE基因。

M： DL5000 marker; 1： GDH gene; 2： pqqE gene.

2.2? GDH和pqqE基因生物信息學(xué)分析

2.2.1? 理化性質(zhì)分析? 應(yīng)用蛋白質(zhì)在線分析軟件系統(tǒng)ExPASy分析GDH蛋白，顯示GDH蛋白理論分子質(zhì)量為85.05 kDa，pI為6.62，分子式為C3840H5941N1021O1103S31;其中甘氨酸（Gly）含量最高，為10.9%，丙氨酸（Ala）次之，為9.4%，帶正電荷的氨基酸為63個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸為65個(gè)。不穩(wěn)定指數(shù)為34.36，為穩(wěn)定性蛋白。

pqqE蛋白分子量為42.99 kDa，pI為5.90，分子式為C1904H2967N531O564S21;其中亮氨酸（Leu）含量最高，為10.8%，丙氨酸（Ala）次之，為9.2%，總帶正電荷的氨基酸為43個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸為48個(gè)。不穩(wěn)定指數(shù)為49.32，為不穩(wěn)定性蛋白。

2.2.2? 信號(hào)肽預(yù)測(cè)? 用SignalP 4.1在線軟件對(duì)GDH和pqqE蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明GDH和pqqE的蛋白均無(wú)信號(hào)肽，不屬于分泌型蛋白（圖4）。

A：GDH;B：pqqE。

2.2.3? 跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)? 通過(guò)TMHMM在線軟件進(jìn)行蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)分析，如圖5A所示，GDH基因的編碼產(chǎn)物存在6個(gè)跨膜螺旋（TMHs）結(jié)構(gòu)，該蛋白是跨膜蛋白，也存在跨膜結(jié)構(gòu)。pqqE蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)，為一種外膜蛋白（圖5B）。

A： GDH; B： pqqE.

2.2.4? 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)? 利用SOPMA預(yù)測(cè)GDH蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，得知該蛋白含有-螺旋、β-鏈、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，其中主要為無(wú)規(guī)則卷曲，占51.90%，其次為β-鏈占23.16%，-螺旋，占16.71%，β-折疊只占8.23%（圖6A）。pqqE蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有-螺旋、β-鏈、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，其中主要為無(wú)規(guī)則卷曲占45.53%，其次為-螺旋，占38.16%，β-鏈占12.37%，β-折疊只占3.95%（圖6B）。

A：GDH;B：pqqE;h：-螺旋;e：β-鏈;

t：β-折疊;c：無(wú)規(guī)則卷曲。

A： GDH; B： pqqE; h： -helix; e： β-chain; t： β-fold; c： Random coil.

2.2.5? 蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析? 用Motif Scan軟件對(duì)GDH和pqqE蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在GDH蛋白中，173-176、209-212、354-357、541-544、601-604為N-糖基化位點(diǎn);149-152、175-178、211-214、242-245、311-314、356-359、432-435、459-462、543-546、553-556、629-632、667-670、684-687為酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn);26-31、33-38、279-284、348-353、362-367、392-397、428-433、519-524、586-591、630-635、640-645、664-669、707-712為N-肉豆蔻酰化位點(diǎn);242-244、286-288、305-307、371-373、491-493、673-675、756-758、759-761為蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn);431-438、772-780為酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。在pqqE蛋白中，226-229、367-370為N-糖基化位點(diǎn);65-68、71-74、101-104、277-280、308-311為酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn);95-100、131-136、199-204、225-230、244-249、317-322、328-333為N-肉豆蔻?；稽c(diǎn);19-21、71-73、267-269為蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn);80-88為酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。

2.2.6? 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析? 用protein blast程序?qū)DH蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明（圖7A），GDH蛋白含有3個(gè)功能域，分別為PQQ_membr_ DH、PQQ_mGDH、Gcd;含有3個(gè)超家族蛋白結(jié)構(gòu)，其中最主要的是PQQ_DH_like超家族蛋白結(jié)構(gòu)。PQQ_membr_DH功能域的系統(tǒng)發(fā)育分布與輔酶PQQ生物合成酶非常相似。在N-末端區(qū)域有幾個(gè)已預(yù)測(cè)到的跨膜螺旋的序列與PQQ所依賴的甘油（EC1.1.99.22）和其他多元醇（糖醇）脫氫酶具有同源性。PQQ_mGDH功能域的細(xì)菌亞家族屬于以吡咯喹啉醌（PQQ）為輔助因子的脫氫酶家族，是唯一與膜結(jié)合的亞家族。葡萄糖脫氫酶將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖-1，5-內(nèi)酯，在革蘭氏陰性菌糖和醇的周質(zhì)氧化反應(yīng)中與呼吸鏈偶聯(lián)。PQQ_DH_like超家族蛋白家族包含一個(gè)8葉β-螺旋槳，由以吡咯喹啉醌（PQQ）為輔助因子的脫氫酶組成，如乙醇、甲醇和膜結(jié)合葡萄糖脫氫酶。

保守結(jié)構(gòu)域分析顯示（圖7B），pqqE蛋白含有1個(gè)PQQ_syn_pqqE功能域，是一種典型的肽環(huán)化自由基SAM酶。將Tyr連接到Glu是從前體肽PqqA合成吡咯喹啉醌（輔酶PQQ）的第一步。該蛋白含有Radical SAM超家族蛋白的典型結(jié)構(gòu)，該家族是一個(gè)協(xié)調(diào)保守的鐵硫簇CxxxCxxC基序，其中酶通過(guò)將4Fe-4S簇和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）緊密結(jié)合而產(chǎn)生自由基，再將共享單個(gè)電子從鐵硫簇轉(zhuǎn)移到SAM后還原裂解為蛋氨酸和5-脫氧腺苷自由基，隨后反過(guò)來(lái)又從適當(dāng)位置的碳原子中提取氫。根據(jù)酶的不同，SAM在此過(guò)程中被消耗或恢復(fù)和重復(fù)使用。自由基SAM酶起著催化代謝、DNA修復(fù)、維生素和輔酶的生物合成以及許多抗生素的生物合成的作用。此外，還會(huì)催化不同的反應(yīng)，包括不尋常的甲基化、異構(gòu)化、硫插入、環(huán)形成、厭氧氧化和蛋白質(zhì)自由基形成。

A： GDH; B： pqqE.

2.2.7? 氨基酸序列同源性分析? 用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示（圖8A，圖8B），菌株DX120E的GDH和pqqE蛋白與克雷伯氏菌屬的親緣關(guān)系最近。

2.3? DX120E對(duì)不同磷源的溶磷能力

圖9A所示，在3種不同難溶磷源條件下，DX120E的溶磷量均高于對(duì)照，其中以FePO4為難溶磷源時(shí)顯著高于對(duì)照。圖9B所示，溶磷量以FePO4為難溶磷源的條件下最高，以Ca3（PO4）2為難溶磷源的條件下最低。以FePO4為難溶磷源時(shí)與以Ca3（PO4）2、AlPO4為難溶磷源時(shí)的溶磷量相比均達(dá)到顯著性差異（P<0.05），以Ca3（PO4）2、AlPO4為難溶磷源時(shí)分別是以FePO4為難溶磷源條件下的1.4和1.6倍。

A： GDH; B： pqqE.

A：與CK對(duì)比;B：3種不同磷源的對(duì)比;不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

A： Comparison with CK; B： Comparison of three different phosphorus sources; Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level.

2.4? 不同難溶磷源中GDH和pqqE基因相對(duì)表達(dá)量分析

對(duì)在不同難溶磷源條件下DX120E的樣品進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)分析，GDH和pqqE基因相對(duì)表達(dá)量如圖10所示，GDH和pqqE基因相對(duì)表達(dá)量均呈上調(diào)表達(dá)，且2個(gè)基因的表達(dá)量情況趨勢(shì)一致。GDH和pqqE基因在以FePO4為難溶磷源的培養(yǎng)條件下表達(dá)量均最高，以Ca3（PO4）2為難溶磷源的條件最低，以FePO4為難溶磷源培養(yǎng)與以Ca3（PO4）2為難溶磷源培養(yǎng)的菌株2個(gè)基因的表達(dá)量均達(dá)到顯著差異（P<0.05），其中GDH和pqqE

A：GDH;B：pqqE;不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

A： GDH; B： pqqE; Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level.

基因表達(dá)量分別是以Ca3（PO4）2為難溶磷源條件下的1.3和1.8倍。

3? 討論

磷是植物生長(zhǎng)的必需元素之一，但土壤中絕大多數(shù)的磷元素均以難溶性狀態(tài)存在。溶磷微生物能將不可溶解的礦質(zhì)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶解性的H2PO4–或者HPO42–供植物吸收利用，這也是全球磷循環(huán)生態(tài)系統(tǒng)的基本組成[20]。溶磷細(xì)菌在GDH和輔因子PQQ同時(shí)存在時(shí)，不溶性的礦質(zhì)磷酸鹽可以轉(zhuǎn)化為供生物體吸收利用的可溶性磷，缺少二者中的任何一個(gè)，都會(huì)影響解磷能力。GDH基因?qū)甑娜芰坠δ芫哂袥Q定性作用。Tripura等[21]成功地從腸桿菌（Enterobacter asburiae）中克隆了GDH基因，缺失GDH基因的突變體便喪失GDH的活性，致使該菌不能溶解土壤中的難溶性磷酸鹽[22]。Rodríguez等[23]將pqq基因?qū)氲紹urkholderia cepacia IS-16和假單孢菌屬（Pseudomonas.sp）2個(gè)菌株，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的突變菌株能增強(qiáng)礦質(zhì)磷酸鹽溶解能力。

本研究成功克隆了甘蔗內(nèi)生固氮菌Klebsiella variicola DX120E的GDH和pqqE基因ORF，并推導(dǎo)出編碼的氨基酸序列。GDH基因ORF為2373 bp，編碼790個(gè)氨基酸。蛋白理化性質(zhì)穩(wěn)定。由于該蛋白無(wú)信號(hào)肽，不是分泌型蛋白。GDH蛋白是跨膜蛋白，也存在跨膜結(jié)構(gòu)，表明GDH蛋白可能是一個(gè)與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。激酶磷酸化位點(diǎn)總共有23個(gè)，磷酸化作用是蛋白質(zhì)性質(zhì)改變的方法之一，磷酸化位點(diǎn)被激活后對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能特性都有重要影響。磷酸化作用是對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，這對(duì)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也發(fā)揮著不可替代的作用[24]。該片段主要含有PQQ_membr_DH、PQQ_mGDH功能域和PQQ_DH_like超家族蛋白結(jié)構(gòu)。pqqE基因ORF為1143 bp，編碼380個(gè)氨基酸。蛋白理化性質(zhì)不穩(wěn)定。由于該蛋白無(wú)信號(hào)肽，也不是分泌型蛋白，說(shuō)明該蛋白的作用存在于胞內(nèi)，不具備運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)到不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)的功能。激酶磷酸化位點(diǎn)共有9個(gè)，2個(gè)糖基化位點(diǎn)，與其磷信號(hào)識(shí)別與傳導(dǎo)的作用有關(guān)。該片段含有1個(gè)PQQ_ syn_pqqE功能域和Radical SAM超家族蛋白的結(jié)構(gòu)。本研究從固氮菌株DX120E中克隆獲得了GDH和pqqE基因，說(shuō)明該菌株可以通過(guò)產(chǎn)酸途徑來(lái)降解難溶性的磷酸鹽，但具體的溶磷機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

酸性土壤中磷素常被固定生成磷酸鋁或磷酸鐵，堿性土壤中磷易被固定生成磷酸鈣的形式存在，大大降低了磷的有效吸收和利用。而土壤中的一些微生物能將土壤中難溶性的磷酸鹽轉(zhuǎn)變成可溶性磷源，能使植物更多地吸收利用磷素。解磷微生物在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，不僅可以減少使用化肥所帶來(lái)不良效益，而且可以通過(guò)增加土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素促進(jìn)作物生長(zhǎng)[25]。趙買瓊[26]將篩選出的高效解磷菌株假單胞菌Y2與解淀粉芽孢桿菌T5、NJN6 結(jié)合再配以一定比例的無(wú)機(jī)化肥，研制成復(fù)合微生物肥料，結(jié)果顯示對(duì)番茄、茄子、馬鈴薯、玉米、煙草等均具有較好的促生效果。孫孝文等[27]從水稻根際土壤中篩選到水生拉恩氏菌MEM40對(duì)磷酸鈣、磷酸鎂和磷礦粉均具有明顯的解磷效果，對(duì)水稻具有明顯的促生作用。不同的細(xì)菌其溶磷能力不同，王奎萍等[28]篩選得到134株具有溶磷能力的菌株使辣椒植株的生物量增加了10.24%。唐岷宸等[29]研究發(fā)現(xiàn)解磷菌X-P18的施用能夠使葉葵扇白菜在缺磷環(huán)境中大量增產(chǎn)，其中鮮重增加了65.5%，葉片中全磷增加46.9%，促進(jìn)農(nóng)作物對(duì)養(yǎng)分的吸收利用。呂俊等[30]從馬尾松根際篩選到伯克霍爾德菌WJ2對(duì)磷酸鈣的溶解能力最強(qiáng)，在盆栽試驗(yàn)中，菌株WJ2可提高土壤有效磷含量，促進(jìn)植株對(duì)磷素的吸收，促進(jìn)馬尾松幼苗的生長(zhǎng)。甘蔗內(nèi)生固氮菌DX120E是具有多種促生特性的溶磷細(xì)菌[16]。本研究測(cè)定了在不同難溶磷源的培養(yǎng)條件下DX120E的溶磷量以及相應(yīng)條件下GDH和pqqE基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以FePO4為難溶磷源的條件下溶磷量最高，GDH和pqqE基因的相對(duì)表達(dá)量也最高。以Ca3（PO4）2為難溶磷源的條件下溶磷量和相對(duì)表達(dá)量均最低。說(shuō)明在以FePO4為難溶磷的土壤中應(yīng)用該菌，可以提高土壤磷素的利用效率，從而促進(jìn)植物的營(yíng)養(yǎng)吸收和生長(zhǎng)。

總之，本研究從甘蔗內(nèi)生固氮菌Klebsiella variicola DX120E中克隆獲得了GDH和pqqE基因，從分子方面證實(shí)該菌可通過(guò)葡萄糖脫氫酶的作用，產(chǎn)生有機(jī)酸途徑來(lái)發(fā)揮溶磷作用。同時(shí)Klebsiella variicola DX120E對(duì)FePO4和AlPO4的利用能力高于Ca3（PO4）2，可見該菌在酸性土壤中的應(yīng)用潛力更大。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究?jī)?nèi)生固氮菌的溶磷機(jī)制及開發(fā)利用提供了參考。

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責(zé)任編輯：黃東杰