菠蘿SVP基因?qū)σ蚁├碳さ捻憫?/h1>
2021-12-08 06:01:10李玉靜，陳哲，胡福初，阮城城，羅志文，王祥和，范鴻雁，張治禮
熱帶作物學報 2021年10期
李玉靜，陳哲，胡福初，阮城城，羅志文，王祥和，范鴻雁，張治禮
摘? 要：SVP（short vegetative phase）是一類開花抑制基因，通過調(diào)節(jié)開花相關(guān)基因的表達，影響植物從營養(yǎng)生長階段向生殖生長階段的轉(zhuǎn)變進程。根據(jù)公布的菠蘿基因組信息，從‘臺農(nóng)4號菠蘿中克隆到2個AcSVP基因AcSVP1和AcSVP2。結(jié)果表明：AcSVP1和AcSVP2分別編碼225和230個氨基酸，均含有MADS-box、K-box保守結(jié)構(gòu)域，二者所編碼蛋白均屬MADS-box基因家族成員。定量PCR分析結(jié)果顯示，2個AcSVP基因在菠蘿莖尖、莖基和葉中均有不同程度的表達，乙烯利處理后主要表現(xiàn)為下調(diào)。乙烯利處理8 h內(nèi)，AcSVP1在莖尖、葉中的表達顯著下調(diào)，但在莖基組織中呈現(xiàn)先下調(diào)后上升的趨勢;乙烯利處理后8 h，莖基組織中AcSVP1的相對表達量略高于對照。與AcSVP1不同，乙烯利處理8 h內(nèi)AcSVP2在莖尖、莖基、葉3種組織中均明顯下調(diào);乙烯利處理后8 h，AcSVP2在莖尖、莖基、葉組織中的相對表達量只有對照的8%、44%和33%。SVP是目前已知的最重要的一類開花抑制基因，AcSVP在響應乙烯利的過程中表達顯著下調(diào)，表明其在乙烯利誘導菠蘿成花過程中可能發(fā)揮重要作用。
關(guān)鍵詞：菠蘿;SVP基因;基因克隆;乙烯利
中圖分類號：S668.3? ? ? 文獻標識碼：A
Responses of Pineapple SVP Genes to Ethephon Stimulation
LI Yujing1，2， CHEN Zhe2*， HU Fuchu2， RUAN Chengcheng1，2， LUO Zhiwen2， WANG Xianghe2，
FAN Hongyan2， ZHANG Zhili2*
1. Institute of Life Sciences and Pharmacy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Tropical Fruit Trees， Hainan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology of Hainan Province / Haikou Investigation Station of Tropical Fruit Trees， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571100， China
Abstract： SVP （short vegetative phase） is a type of flowering suppressor gene， which regulates the expression of flowering-related genes to affect the transition process of plants from the vegetative growth stage to the reproductive growth stage. According to the published pineapple genome information， two AcSVP genes named AcSVP1 and AcSVP2 were cloned in ‘Tainong 4 pineapple. Analyses showed that AcSVP1 and AcSVP2 encoded 225 and 230 amino acids， respectively， and both contained MADS-box and K-box conserved domains. The proteins encoded belonged to the MADS-box gene family members. qRT-PCR analysis showed that the genes were expressed in different degrees in stem tip， stem base and leaf tissues， and after ethephon treatment the genes were mainly down-regulated to varying degrees compared with the control. Within 8 h of ethephon treatment， AcSVP1 was significantly down-regulated in the stem tips and leaves while in the stem-basal tissue which showed a trend of first down and then up-regulation， and the relative expression of AcSVP1 in the stem-basal tissues was slightly higher than that of its control after 8 h of ethephon treatment. Different from AcSVP1， AcSVP2 gene was significantly down-regulated in stem tip， stem base and leaf tissues within 8 h of ethephon treatment， and the relative expression level of AcSVP2 in the stem tip， stem base and leaf tissues was respectively about 8%， 44% and 33% of the control after 8 h of ethylene treatment. SVP was the most important type of flowering suppressor gene. And the down-regulated of AcSVP in response to ethephon stimulation indicated that AcSVP maybe play a key role in the flowering processes of pineapple in responses to ethephon signal.
Keywords： Ananas comosus; SVP gene; gene cloning; ethephon
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.008
開花是有性生殖植物繁衍的一種重要方式。植物開花過程是營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，其以花芽分化為特征[1];菠蘿花芽分化的過程可以劃分為成花誘導期、成花啟動期和花器官發(fā)育期3個時期。成花誘導是高等植物由營養(yǎng)生長向生殖生長過渡的重要步驟[2]。近年來，人們通過對擬南芥、水稻等模式植物開花調(diào)控的研究，將高等植物成花調(diào)控歸納為光周期途徑、自主途徑、發(fā)育年齡控制途徑、赤霉素途徑、春化途徑和環(huán)境溫度途徑等六大途徑[3]。它們既可以單獨調(diào)節(jié)植株開花過程，也可以彼此影響共同組成一個復雜的開花調(diào)控網(wǎng)絡。
菠蘿（Ananas comosus L.）又稱鳳梨，是一種原生長于美洲的熱帶草本果樹，廣泛分布在全球各地。菠蘿是我國主要的經(jīng)濟作物之一，2018年我國菠蘿種植面積超過8萬hm2，總產(chǎn)量超過200萬t（FAOSTAT數(shù)據(jù)），主要分布在廣東、廣西、云南、福建、海南、臺灣等地[4]。成花率不高和開花時間不一致是菠蘿自然成花過程中經(jīng)常發(fā)生的問題，生產(chǎn)實踐中常常通過施用乙烯利或乙炔誘導菠蘿成花[5]。雖然乙炔或乙烯在實際生產(chǎn)中能夠促進鳳梨科植物成花，但也存在溫度、濕度、陰雨天氣、菠蘿長勢等影響催花效果甚至導致催化失敗等問題。由于乙炔或乙烯利誘導菠蘿成花的機制目前并不清楚，生產(chǎn)上改善催花效果往往只能憑種植戶經(jīng)驗而非理論的指導。因此，開展乙炔或乙烯利誘導菠蘿成花機制的研究具有重要的理論價值和實踐意義。
SVP（short vegetative phase）是一類開花抑制基因。SVP蛋白是通過與FT（FLOWERING LOCUS T）和SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREX PRESSION OF CONSTANS 1）的啟動子結(jié)合阻礙其轉(zhuǎn)錄表達延遲植物成花[6]。借助菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫信息，本研究以‘臺農(nóng)4號菠蘿為材料成功克隆到SVP的2個同源基因AcSVP1和AcSVP2，利用生物信息學和分子生物學技術(shù)對其進行了研究，研究結(jié)果將為深入闡釋SVP基因在乙烯利誘導菠蘿成花中的功能定位提供數(shù)據(jù)支持。
1? 材料與方法
1.1? 材料
以種植于海南省美亭村菠蘿基地、生長時間300 d左右（約25片葉）的‘臺農(nóng)4號菠蘿為材料，40%乙烯利（1600 mg/L）300倍液灌心處理后[7]2 h、4 h、6 h、8 h、1 d、2 d，分別取莖尖、莖基（剝皮后的莖中部組織）、成熟功能葉，液氮速凍后于–80 ℃保存。以同等體積的清水處理作為對照并取樣。
1.2? AcSVP基因克隆
從Pineapple Genomics Database（http：// pineapple.angiosperms.org/pineapple/html/index. html）中下載菠蘿基因組所有蛋白序列，從NCBI下載不同物種SVP蛋白序列，通過本地Blast（e<0.01）搜索，將菠蘿基因組中疑似SVP蛋白進行Blast p，所有序列均通過CD-search（https：// www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）檢索以確定其含有MADS-box和K-box結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)菠蘿基因組中存在3條SVP序列。
采用華越洋植物RNA提取試劑盒提取菠蘿葉片組織總RNA，使用TaKaRa生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。根據(jù)預測的3條SVP基因序列設(shè)計相應引物（表1），擴增菠蘿SVP基因的CDS區(qū)。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min;后95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32個循環(huán);最后72 ℃再延伸5 min。對擴增產(chǎn)物進行凝膠檢測并分析結(jié)果。由天一輝遠生物試劑公司開展引物合成和測序工作。
1.3? AcSVP蛋白序列結(jié)構(gòu)分析
借助NCBI提供的BLAST（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線工具對測序結(jié)果進行搜索分析，ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder/）分析AcSVP基因編碼區(qū);利用ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam/）對成功克隆到的2個AcSVP蛋白的基本理化性質(zhì)進行預測，用GOV IV（http：//npsa-prabi.ibcp.fr）分析蛋白二級結(jié)構(gòu)，Blast p在線檢索菠蘿2個SVP蛋白的其他物種來源的同源蛋白序列，借助DNAMAN 6.06和MEGA 6.0工具分別完成不同來源SVP蛋白的同源比對分析工作和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.4? 熒光定量PCR
以‘臺農(nóng)4號菠蘿莖尖、莖基或葉片組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為PCR模板，引物見表1，EF1為內(nèi)參基因[8]，每個處理重復3次。采用10 μL反應體系：1 μL cDNA，5 μL SYBR Green I Master，10 μmol/L的正反向引物各0.5 μL，3 μL ddH2O。用2-ΔΔCT法[9]對2個AcSVP基因進行相對定量分析，利用Excel、SPSS相關(guān)軟件進行數(shù)據(jù)分析。
2? 結(jié)果與分析
2.1? 菠蘿SVP基因家族基因的挖掘與結(jié)構(gòu)分析
利用生物信息學技術(shù)，通過對菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫的分析，發(fā)現(xiàn)3條SVP序列，分別命名為AcSVP1、AcSVP2和AcSVP3。DNAMAN 6.06分析研究結(jié)果顯示，預測中的AcSVP1和AcSVP2開放閱讀框堿基相似度高達72.58%，大約有
190 bp核苷酸的差異，涉及82個氨基酸的差異;AcSVP1和AcSVP3相似度高達72.58%，有188 bp核苷酸差異，涉及83個氨基酸的差異;AcSVP2和AcSVP3相似度高達99.71%，有2 bp核苷酸的差異，涉及1個氨基酸的差異。GSDS（http：//gsds. gao-lab.org/index.php）分析表明（圖1），AcSVP1含有9個外顯子，8個內(nèi)含子;AcSVP2和AcSVP3均含有8個外顯子和8個內(nèi)含子。
2.2? 菠蘿AcSVP基因編碼區(qū)克隆與序列分析
根據(jù)公布的菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫信息設(shè)計引物，以菠蘿葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，從‘臺農(nóng)4號菠蘿基因組中成功克隆到AcSVP1和AcSVP2。序列分析結(jié)果表明，‘臺農(nóng)4號AcSVP1和AcSVP2與公布的菠蘿基因組相應基因的cDNA ORF序列完全一致，分別為678 bp和693 bp，分別編碼225和230個氨基酸。
GOR IV預測發(fā)現(xiàn)，AcSVP1與AcSVP2均含有無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈等結(jié)構(gòu)（圖2）。三類結(jié)構(gòu)在AcSVP1蛋白中所占比例分別為27.56%、56.89%、15.56%;在AcSVP2蛋白中所占比例分別為29.13%、59.13%、11.74%。
豎線從長到短依次為α-螺旋、折疊延伸鏈和無規(guī)則卷曲。
The vertical line from length to short is alpha helix， folding
extension chain and irregular curl.
Protparam在線預測2個AcSVP蛋白的理化特性結(jié)果表明，AcSVP1蛋白理論等電點（pI）為6.33、蛋白的不穩(wěn)定參數(shù)為51.27，脂溶指數(shù)為88;AcSVP2蛋白理論pI為8.44，蛋白的不穩(wěn)定參數(shù)為47.67，脂溶指數(shù)為89.52，表明AcSVP1、AcSVP2蛋白可能都是親脂性蛋白。
2.3? 菠蘿AcSVP蛋白同源性分析
將AcSVP1和AcSVP2的蛋白序列與其他21個物種SVP類基因編碼的蛋白質(zhì)進行序列比對（圖3），發(fā)現(xiàn)二者都屬于典型的Type Ⅱ型MADS-box蛋白。Blast p比對發(fā)現(xiàn)，菠蘿AcSVP1蛋白序列與油棕（Elaeis guineensis）SVP相似度較高，為73.68%;AcSVP2與油棕的STMADS11-1的相似度較高，為72.44%。菠蘿AcSVP1與AcSVP2相似度為72.58%，有82個氨基酸的差異。
借助MEGA 6.0構(gòu)建了2個AcSVP蛋白與其他21個物種的SVP同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹。分析表明（圖4），AcSVP1與油棕的SVP遺傳距離較近;AcSVP2與油棕的STMADS11-1遺傳距離較近。
EgSVP： Elaeis guineensis， XP_010942683.1; CsSVP： Crocus sativus， QIH12017.1; DcSVP： Dendrobium catenatum， XP_020692709.1; ZmSVP： Zea mays， NP_001105154.2; EgSTMADS11-1： Elaeis guineensis， AAW66885.1; HbSVP： Hevea brasiliensis， XP_021662492.1; VvSVP： Vitis vinifera， XP_019073897.1; VrSVP： Vitis riparia， XP_034692566.1; MeSVP： Manihot esculenta， XP_021631111.1; CaSVP： Coffea arabica， XP_027075278.1; AtSVP： Arabidopsis thaliana， NM_001335800.1; BjSVP1： Brassica juncea， JQ906715.1; MaSVP： Morus alba var. alba， AYK27570.1; BjSVP2： Brassica juncea， AFM77906.1; BnSVP： Brassica napus， AFM77910.1; LdSVP： Lansium domesticum， AST22412.1; CtSVP： Citrus trifoliate， ACJ09170.1; SiSVP： Sesamum indicum， XP_020554864.1; GmSVP： Glycine max， XP_006574410.1; SlSVP： Solanum lycopersicum， XP_004237993.1; PsSVP： Paeonia suffruticosa， AHJ60267.1.
HbSVP： Hevea brasiliensis， XP_021662492.1; MeSVP： Manihot esculenta， XP_021631111.1; SiSVP： Sesamum indicum， XP_020554864.1; VvSVP： Vitis vinifera， XP_019073897.1; VrSVP： Vitis riparia， XP_034692566.1; CaSVP： Coffea arabica， XP_027075278.1; GmSVP： Glycine max， XP_006574410.1; LdSVP： Lansium domesticum， AST22412.1; CtSVP： Citrus trifoliate， ACJ09170.1; PsSVP： Paeonia suffruticosa， AHJ60267.1; BjSVP2： Brassica juncea， AFM77906.1; ; AtSVP： Arabidopsis thaliana， NM_001335800.1; BjSVP1： Brassica juncea， JQ906715.1; BnSVP： Brassica napus， AFM77910.1; EgSTMADS11-1： Elaeis guineensis， AAW66885.1; CsSVP： Crocus sativus， QIH12017.1; DcSVP： Dendrobium catenatum， XP_020692709.1; ZmSVP： Zea mays， NP_001105154.2; EgSVP： Elaeis guineensis， XP_010942683.1; SlSVP： Solanum lycopersicum， XP_004237993.1;.MaSVP： Morus alba var. alba， AYK27570.1.
2.4? 菠蘿AcSVP基因表達對乙烯利刺激的響應
乙烯利處理后，AcSVP1和AcSVP2基因?qū)σ蚁┑捻憫傮w表現(xiàn)為下調(diào)，但不同組織、不同處理時間表達量略有差異;乙烯利處理后2 d，2個基因的表達都表現(xiàn)為下調(diào)，但下調(diào)幅度不同，其中AcSVP2基因在3種組織中下調(diào)的更為明顯（圖5A～圖5F）。乙烯利處理的8 h內(nèi)，AcSVP1在莖尖、葉組織中的表達下調(diào)明顯，但在莖基組織中呈現(xiàn)出先下調(diào)后上升的趨勢。乙烯利處理后4 h，AcSVP1在莖尖部位的表達量處于最小值，約為對照的37%。施用乙烯利后6 h，莖基組織中表達量達最小值，約為對照的7%;乙烯利處理后8 h，AcSVP1的相對表達量略高于對照。施用乙烯利8 h，葉中表達量達最小值，約為對照的8%（圖5A～圖5C）。AcSVP2的表現(xiàn)與AcSVP1略為不同。乙烯利處理的8 h內(nèi)，AcSVP2在莖尖、莖基、葉3種組織中均明顯表現(xiàn)為下調(diào)。乙烯利處理后8 h，AcSVP2在莖尖、莖基、葉組織中的相對表達量只有對照的8%、44%和33%（圖5D～圖5F）。
AcSVP1和AcSVP2基因在莖尖、莖基和葉組織中均有不同程度的表達，乙烯利處理后，AcSVP1、AcSVP2均在莖尖組織中相對表達量處于最小值;而未處理時，AcSVP1和AcSVP2在莖基組織中相對表達量處于最小值（圖5G～圖5H）。
3? 討論
MADS-box基因家族有11個亞族，SVP作為MADS-box基因家族第11個亞族——STMADS11亞族的成員，主要是作為成花負調(diào)節(jié)因子參與植物的花發(fā)育和開花進程的調(diào)控[3， 10-12]。目前已經(jīng)克隆到多種植物的SVP同源基因，如甘薯[13]、番茄[14]、獼猴桃[15]等。根據(jù)生物信息學分析結(jié)果，我們在公布的菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫中找到了3條AcSVP，分別命名為AcSVP1、AcSVP2和AcSVP3。本研究成功克隆到‘臺農(nóng)4號菠蘿AcSVP1和AcSVP2基因，編碼蛋白都含有MADS-box結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域，均屬于MADS-box基因家族的STMADS11亞族。生物信息學分析顯示，預測中的AcSVP2和AcSVP3雖然位于不同的染色體上，但cDNA序列長度一致，只有中間位置有2 bp的核苷酸差異，利用同一對引物同時克隆AcSVP2、AcSVP3，未能克隆到AcSVP3基因，可能是由于‘臺農(nóng)4號菠蘿基因組與公布的數(shù)據(jù)庫（來自F153菠蘿品種和MD2菠蘿品種）[16]存在差異有關(guān)，也有可能這2個預測的基因是同一個基因。
包含SVP基因的STMADS11亞族基因被認為在植物營養(yǎng)生長以及營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[17]。擬南芥SVP突變體表現(xiàn)為嚴重的早期開花表型，AtSVP過量表達可以使擬南芥開花時間推遲[6， 18]。桂花花芽分化需要一定時間的低溫環(huán)境。低溫處理后3個桂花OfSVP基因的表達均顯著下調(diào)，同時位于下游的OfSOC1和OfFT的表達量卻明顯升高[19]。SVP1基因在成花誘導期可以響應乙烯，并且相比對照明顯呈現(xiàn)下調(diào)表達，但與成花啟動期對照相比表達無明顯差異;而SVP2基因在成花誘導期和成花啟動期的表達相比對照均呈現(xiàn)明顯下調(diào)表達，鑒于成花誘導是開花的第一步，SVP1與SVP2 2個基因的表達在成花誘導期和成花啟動期的表達與對照相比差異逐漸減弱，因此并沒有對花器官發(fā)
SA：莖尖;SB：莖基;L：葉;不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。
SA： Stem apex; SB： Stem base; L： Leaf; Different lowercase letters in the figure show significant difference at 0.05 level.
育期進行表達分析，如有需要，在以后的實驗中將會對這2個SVP基因在花器官發(fā)育時期的表達情況進行分析。已有越來越多的證據(jù)證實，SVP抑制植物成花可能是通過抑制下游基因SOC1和FT的表達參與植物開花進程調(diào)控。低溫和乙烯利處理都可以誘導菠蘿成花，即低溫和乙烯可以加速菠蘿營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變。乙烯利明顯下調(diào)‘臺農(nóng)4號菠蘿AcSVP1和AcSVP2基因在莖尖和葉組織中的表達，表明AcSVP1和AcSVP2基因可能參與了乙烯利誘導菠蘿營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變過程。
已有研究表明，乙烯通過加速DELLE蛋白的富集影響赤霉素途徑從而達到延緩成花的目的，AtSVP可以通過抑制赤霉素合成酶基因GA20ox2的表達降低赤霉素含量進而延遲擬南芥成花[20-21]。乙烯處理能夠延遲擬南芥開花、刺激菠蘿成花，表明乙烯對不同植物開花的調(diào)節(jié)不同，乙烯促進菠蘿成花是單獨作用還是與其他開花途徑共同作用值得關(guān)注[22-23]。
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責任編輯：黃東杰
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李玉靜，陳哲，胡福初，阮城城，羅志文，王祥和，范鴻雁，張治禮
摘? 要：SVP（short vegetative phase）是一類開花抑制基因，通過調(diào)節(jié)開花相關(guān)基因的表達，影響植物從營養(yǎng)生長階段向生殖生長階段的轉(zhuǎn)變進程。根據(jù)公布的菠蘿基因組信息，從‘臺農(nóng)4號菠蘿中克隆到2個AcSVP基因AcSVP1和AcSVP2。結(jié)果表明：AcSVP1和AcSVP2分別編碼225和230個氨基酸，均含有MADS-box、K-box保守結(jié)構(gòu)域，二者所編碼蛋白均屬MADS-box基因家族成員。定量PCR分析結(jié)果顯示，2個AcSVP基因在菠蘿莖尖、莖基和葉中均有不同程度的表達，乙烯利處理后主要表現(xiàn)為下調(diào)。乙烯利處理8 h內(nèi)，AcSVP1在莖尖、葉中的表達顯著下調(diào)，但在莖基組織中呈現(xiàn)先下調(diào)后上升的趨勢;乙烯利處理后8 h，莖基組織中AcSVP1的相對表達量略高于對照。與AcSVP1不同，乙烯利處理8 h內(nèi)AcSVP2在莖尖、莖基、葉3種組織中均明顯下調(diào);乙烯利處理后8 h，AcSVP2在莖尖、莖基、葉組織中的相對表達量只有對照的8%、44%和33%。SVP是目前已知的最重要的一類開花抑制基因，AcSVP在響應乙烯利的過程中表達顯著下調(diào)，表明其在乙烯利誘導菠蘿成花過程中可能發(fā)揮重要作用。
關(guān)鍵詞：菠蘿;SVP基因;基因克隆;乙烯利
中圖分類號：S668.3? ? ? 文獻標識碼：A
Responses of Pineapple SVP Genes to Ethephon Stimulation
LI Yujing1，2， CHEN Zhe2*， HU Fuchu2， RUAN Chengcheng1，2， LUO Zhiwen2， WANG Xianghe2，
FAN Hongyan2， ZHANG Zhili2*
1. Institute of Life Sciences and Pharmacy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Tropical Fruit Trees， Hainan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology of Hainan Province / Haikou Investigation Station of Tropical Fruit Trees， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571100， China
Abstract： SVP （short vegetative phase） is a type of flowering suppressor gene， which regulates the expression of flowering-related genes to affect the transition process of plants from the vegetative growth stage to the reproductive growth stage. According to the published pineapple genome information， two AcSVP genes named AcSVP1 and AcSVP2 were cloned in ‘Tainong 4 pineapple. Analyses showed that AcSVP1 and AcSVP2 encoded 225 and 230 amino acids， respectively， and both contained MADS-box and K-box conserved domains. The proteins encoded belonged to the MADS-box gene family members. qRT-PCR analysis showed that the genes were expressed in different degrees in stem tip， stem base and leaf tissues， and after ethephon treatment the genes were mainly down-regulated to varying degrees compared with the control. Within 8 h of ethephon treatment， AcSVP1 was significantly down-regulated in the stem tips and leaves while in the stem-basal tissue which showed a trend of first down and then up-regulation， and the relative expression of AcSVP1 in the stem-basal tissues was slightly higher than that of its control after 8 h of ethephon treatment. Different from AcSVP1， AcSVP2 gene was significantly down-regulated in stem tip， stem base and leaf tissues within 8 h of ethephon treatment， and the relative expression level of AcSVP2 in the stem tip， stem base and leaf tissues was respectively about 8%， 44% and 33% of the control after 8 h of ethylene treatment. SVP was the most important type of flowering suppressor gene. And the down-regulated of AcSVP in response to ethephon stimulation indicated that AcSVP maybe play a key role in the flowering processes of pineapple in responses to ethephon signal.
Keywords： Ananas comosus; SVP gene; gene cloning; ethephon
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.008
開花是有性生殖植物繁衍的一種重要方式。植物開花過程是營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，其以花芽分化為特征[1];菠蘿花芽分化的過程可以劃分為成花誘導期、成花啟動期和花器官發(fā)育期3個時期。成花誘導是高等植物由營養(yǎng)生長向生殖生長過渡的重要步驟[2]。近年來，人們通過對擬南芥、水稻等模式植物開花調(diào)控的研究，將高等植物成花調(diào)控歸納為光周期途徑、自主途徑、發(fā)育年齡控制途徑、赤霉素途徑、春化途徑和環(huán)境溫度途徑等六大途徑[3]。它們既可以單獨調(diào)節(jié)植株開花過程，也可以彼此影響共同組成一個復雜的開花調(diào)控網(wǎng)絡。
菠蘿（Ananas comosus L.）又稱鳳梨，是一種原生長于美洲的熱帶草本果樹，廣泛分布在全球各地。菠蘿是我國主要的經(jīng)濟作物之一，2018年我國菠蘿種植面積超過8萬hm2，總產(chǎn)量超過200萬t（FAOSTAT數(shù)據(jù)），主要分布在廣東、廣西、云南、福建、海南、臺灣等地[4]。成花率不高和開花時間不一致是菠蘿自然成花過程中經(jīng)常發(fā)生的問題，生產(chǎn)實踐中常常通過施用乙烯利或乙炔誘導菠蘿成花[5]。雖然乙炔或乙烯在實際生產(chǎn)中能夠促進鳳梨科植物成花，但也存在溫度、濕度、陰雨天氣、菠蘿長勢等影響催花效果甚至導致催化失敗等問題。由于乙炔或乙烯利誘導菠蘿成花的機制目前并不清楚，生產(chǎn)上改善催花效果往往只能憑種植戶經(jīng)驗而非理論的指導。因此，開展乙炔或乙烯利誘導菠蘿成花機制的研究具有重要的理論價值和實踐意義。
SVP（short vegetative phase）是一類開花抑制基因。SVP蛋白是通過與FT（FLOWERING LOCUS T）和SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREX PRESSION OF CONSTANS 1）的啟動子結(jié)合阻礙其轉(zhuǎn)錄表達延遲植物成花[6]。借助菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫信息，本研究以‘臺農(nóng)4號菠蘿為材料成功克隆到SVP的2個同源基因AcSVP1和AcSVP2，利用生物信息學和分子生物學技術(shù)對其進行了研究，研究結(jié)果將為深入闡釋SVP基因在乙烯利誘導菠蘿成花中的功能定位提供數(shù)據(jù)支持。
1? 材料與方法
1.1? 材料
以種植于海南省美亭村菠蘿基地、生長時間300 d左右（約25片葉）的‘臺農(nóng)4號菠蘿為材料，40%乙烯利（1600 mg/L）300倍液灌心處理后[7]2 h、4 h、6 h、8 h、1 d、2 d，分別取莖尖、莖基（剝皮后的莖中部組織）、成熟功能葉，液氮速凍后于–80 ℃保存。以同等體積的清水處理作為對照并取樣。
1.2? AcSVP基因克隆
從Pineapple Genomics Database（http：// pineapple.angiosperms.org/pineapple/html/index. html）中下載菠蘿基因組所有蛋白序列，從NCBI下載不同物種SVP蛋白序列，通過本地Blast（e<0.01）搜索，將菠蘿基因組中疑似SVP蛋白進行Blast p，所有序列均通過CD-search（https：// www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）檢索以確定其含有MADS-box和K-box結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)菠蘿基因組中存在3條SVP序列。
采用華越洋植物RNA提取試劑盒提取菠蘿葉片組織總RNA，使用TaKaRa生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。根據(jù)預測的3條SVP基因序列設(shè)計相應引物（表1），擴增菠蘿SVP基因的CDS區(qū)。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min;后95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32個循環(huán);最后72 ℃再延伸5 min。對擴增產(chǎn)物進行凝膠檢測并分析結(jié)果。由天一輝遠生物試劑公司開展引物合成和測序工作。
1.3? AcSVP蛋白序列結(jié)構(gòu)分析
借助NCBI提供的BLAST（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線工具對測序結(jié)果進行搜索分析，ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder/）分析AcSVP基因編碼區(qū);利用ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam/）對成功克隆到的2個AcSVP蛋白的基本理化性質(zhì)進行預測，用GOV IV（http：//npsa-prabi.ibcp.fr）分析蛋白二級結(jié)構(gòu)，Blast p在線檢索菠蘿2個SVP蛋白的其他物種來源的同源蛋白序列，借助DNAMAN 6.06和MEGA 6.0工具分別完成不同來源SVP蛋白的同源比對分析工作和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.4? 熒光定量PCR
以‘臺農(nóng)4號菠蘿莖尖、莖基或葉片組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為PCR模板，引物見表1，EF1為內(nèi)參基因[8]，每個處理重復3次。采用10 μL反應體系：1 μL cDNA，5 μL SYBR Green I Master，10 μmol/L的正反向引物各0.5 μL，3 μL ddH2O。用2-ΔΔCT法[9]對2個AcSVP基因進行相對定量分析，利用Excel、SPSS相關(guān)軟件進行數(shù)據(jù)分析。
2? 結(jié)果與分析
2.1? 菠蘿SVP基因家族基因的挖掘與結(jié)構(gòu)分析
利用生物信息學技術(shù)，通過對菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫的分析，發(fā)現(xiàn)3條SVP序列，分別命名為AcSVP1、AcSVP2和AcSVP3。DNAMAN 6.06分析研究結(jié)果顯示，預測中的AcSVP1和AcSVP2開放閱讀框堿基相似度高達72.58%，大約有
190 bp核苷酸的差異，涉及82個氨基酸的差異;AcSVP1和AcSVP3相似度高達72.58%，有188 bp核苷酸差異，涉及83個氨基酸的差異;AcSVP2和AcSVP3相似度高達99.71%，有2 bp核苷酸的差異，涉及1個氨基酸的差異。GSDS（http：//gsds. gao-lab.org/index.php）分析表明（圖1），AcSVP1含有9個外顯子，8個內(nèi)含子;AcSVP2和AcSVP3均含有8個外顯子和8個內(nèi)含子。
2.2? 菠蘿AcSVP基因編碼區(qū)克隆與序列分析
根據(jù)公布的菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫信息設(shè)計引物，以菠蘿葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，從‘臺農(nóng)4號菠蘿基因組中成功克隆到AcSVP1和AcSVP2。序列分析結(jié)果表明，‘臺農(nóng)4號AcSVP1和AcSVP2與公布的菠蘿基因組相應基因的cDNA ORF序列完全一致，分別為678 bp和693 bp，分別編碼225和230個氨基酸。
GOR IV預測發(fā)現(xiàn)，AcSVP1與AcSVP2均含有無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈等結(jié)構(gòu)（圖2）。三類結(jié)構(gòu)在AcSVP1蛋白中所占比例分別為27.56%、56.89%、15.56%;在AcSVP2蛋白中所占比例分別為29.13%、59.13%、11.74%。
豎線從長到短依次為α-螺旋、折疊延伸鏈和無規(guī)則卷曲。
The vertical line from length to short is alpha helix， folding
extension chain and irregular curl.
Protparam在線預測2個AcSVP蛋白的理化特性結(jié)果表明，AcSVP1蛋白理論等電點（pI）為6.33、蛋白的不穩(wěn)定參數(shù)為51.27，脂溶指數(shù)為88;AcSVP2蛋白理論pI為8.44，蛋白的不穩(wěn)定參數(shù)為47.67，脂溶指數(shù)為89.52，表明AcSVP1、AcSVP2蛋白可能都是親脂性蛋白。
2.3? 菠蘿AcSVP蛋白同源性分析
將AcSVP1和AcSVP2的蛋白序列與其他21個物種SVP類基因編碼的蛋白質(zhì)進行序列比對（圖3），發(fā)現(xiàn)二者都屬于典型的Type Ⅱ型MADS-box蛋白。Blast p比對發(fā)現(xiàn)，菠蘿AcSVP1蛋白序列與油棕（Elaeis guineensis）SVP相似度較高，為73.68%;AcSVP2與油棕的STMADS11-1的相似度較高，為72.44%。菠蘿AcSVP1與AcSVP2相似度為72.58%，有82個氨基酸的差異。
借助MEGA 6.0構(gòu)建了2個AcSVP蛋白與其他21個物種的SVP同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹。分析表明（圖4），AcSVP1與油棕的SVP遺傳距離較近;AcSVP2與油棕的STMADS11-1遺傳距離較近。
EgSVP： Elaeis guineensis， XP_010942683.1; CsSVP： Crocus sativus， QIH12017.1; DcSVP： Dendrobium catenatum， XP_020692709.1; ZmSVP： Zea mays， NP_001105154.2; EgSTMADS11-1： Elaeis guineensis， AAW66885.1; HbSVP： Hevea brasiliensis， XP_021662492.1; VvSVP： Vitis vinifera， XP_019073897.1; VrSVP： Vitis riparia， XP_034692566.1; MeSVP： Manihot esculenta， XP_021631111.1; CaSVP： Coffea arabica， XP_027075278.1; AtSVP： Arabidopsis thaliana， NM_001335800.1; BjSVP1： Brassica juncea， JQ906715.1; MaSVP： Morus alba var. alba， AYK27570.1; BjSVP2： Brassica juncea， AFM77906.1; BnSVP： Brassica napus， AFM77910.1; LdSVP： Lansium domesticum， AST22412.1; CtSVP： Citrus trifoliate， ACJ09170.1; SiSVP： Sesamum indicum， XP_020554864.1; GmSVP： Glycine max， XP_006574410.1; SlSVP： Solanum lycopersicum， XP_004237993.1; PsSVP： Paeonia suffruticosa， AHJ60267.1.
HbSVP： Hevea brasiliensis， XP_021662492.1; MeSVP： Manihot esculenta， XP_021631111.1; SiSVP： Sesamum indicum， XP_020554864.1; VvSVP： Vitis vinifera， XP_019073897.1; VrSVP： Vitis riparia， XP_034692566.1; CaSVP： Coffea arabica， XP_027075278.1; GmSVP： Glycine max， XP_006574410.1; LdSVP： Lansium domesticum， AST22412.1; CtSVP： Citrus trifoliate， ACJ09170.1; PsSVP： Paeonia suffruticosa， AHJ60267.1; BjSVP2： Brassica juncea， AFM77906.1; ; AtSVP： Arabidopsis thaliana， NM_001335800.1; BjSVP1： Brassica juncea， JQ906715.1; BnSVP： Brassica napus， AFM77910.1; EgSTMADS11-1： Elaeis guineensis， AAW66885.1; CsSVP： Crocus sativus， QIH12017.1; DcSVP： Dendrobium catenatum， XP_020692709.1; ZmSVP： Zea mays， NP_001105154.2; EgSVP： Elaeis guineensis， XP_010942683.1; SlSVP： Solanum lycopersicum， XP_004237993.1;.MaSVP： Morus alba var. alba， AYK27570.1.
2.4? 菠蘿AcSVP基因表達對乙烯利刺激的響應
乙烯利處理后，AcSVP1和AcSVP2基因?qū)σ蚁┑捻憫傮w表現(xiàn)為下調(diào)，但不同組織、不同處理時間表達量略有差異;乙烯利處理后2 d，2個基因的表達都表現(xiàn)為下調(diào)，但下調(diào)幅度不同，其中AcSVP2基因在3種組織中下調(diào)的更為明顯（圖5A～圖5F）。乙烯利處理的8 h內(nèi)，AcSVP1在莖尖、葉組織中的表達下調(diào)明顯，但在莖基組織中呈現(xiàn)出先下調(diào)后上升的趨勢。乙烯利處理后4 h，AcSVP1在莖尖部位的表達量處于最小值，約為對照的37%。施用乙烯利后6 h，莖基組織中表達量達最小值，約為對照的7%;乙烯利處理后8 h，AcSVP1的相對表達量略高于對照。施用乙烯利8 h，葉中表達量達最小值，約為對照的8%（圖5A～圖5C）。AcSVP2的表現(xiàn)與AcSVP1略為不同。乙烯利處理的8 h內(nèi)，AcSVP2在莖尖、莖基、葉3種組織中均明顯表現(xiàn)為下調(diào)。乙烯利處理后8 h，AcSVP2在莖尖、莖基、葉組織中的相對表達量只有對照的8%、44%和33%（圖5D～圖5F）。
AcSVP1和AcSVP2基因在莖尖、莖基和葉組織中均有不同程度的表達，乙烯利處理后，AcSVP1、AcSVP2均在莖尖組織中相對表達量處于最小值;而未處理時，AcSVP1和AcSVP2在莖基組織中相對表達量處于最小值（圖5G～圖5H）。
3? 討論
MADS-box基因家族有11個亞族，SVP作為MADS-box基因家族第11個亞族——STMADS11亞族的成員，主要是作為成花負調(diào)節(jié)因子參與植物的花發(fā)育和開花進程的調(diào)控[3， 10-12]。目前已經(jīng)克隆到多種植物的SVP同源基因，如甘薯[13]、番茄[14]、獼猴桃[15]等。根據(jù)生物信息學分析結(jié)果，我們在公布的菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫中找到了3條AcSVP，分別命名為AcSVP1、AcSVP2和AcSVP3。本研究成功克隆到‘臺農(nóng)4號菠蘿AcSVP1和AcSVP2基因，編碼蛋白都含有MADS-box結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域，均屬于MADS-box基因家族的STMADS11亞族。生物信息學分析顯示，預測中的AcSVP2和AcSVP3雖然位于不同的染色體上，但cDNA序列長度一致，只有中間位置有2 bp的核苷酸差異，利用同一對引物同時克隆AcSVP2、AcSVP3，未能克隆到AcSVP3基因，可能是由于‘臺農(nóng)4號菠蘿基因組與公布的數(shù)據(jù)庫（來自F153菠蘿品種和MD2菠蘿品種）[16]存在差異有關(guān)，也有可能這2個預測的基因是同一個基因。
包含SVP基因的STMADS11亞族基因被認為在植物營養(yǎng)生長以及營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[17]。擬南芥SVP突變體表現(xiàn)為嚴重的早期開花表型，AtSVP過量表達可以使擬南芥開花時間推遲[6， 18]。桂花花芽分化需要一定時間的低溫環(huán)境。低溫處理后3個桂花OfSVP基因的表達均顯著下調(diào)，同時位于下游的OfSOC1和OfFT的表達量卻明顯升高[19]。SVP1基因在成花誘導期可以響應乙烯，并且相比對照明顯呈現(xiàn)下調(diào)表達，但與成花啟動期對照相比表達無明顯差異;而SVP2基因在成花誘導期和成花啟動期的表達相比對照均呈現(xiàn)明顯下調(diào)表達，鑒于成花誘導是開花的第一步，SVP1與SVP2 2個基因的表達在成花誘導期和成花啟動期的表達與對照相比差異逐漸減弱，因此并沒有對花器官發(fā)
SA：莖尖;SB：莖基;L：葉;不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。
SA： Stem apex; SB： Stem base; L： Leaf; Different lowercase letters in the figure show significant difference at 0.05 level.
育期進行表達分析，如有需要，在以后的實驗中將會對這2個SVP基因在花器官發(fā)育時期的表達情況進行分析。已有越來越多的證據(jù)證實，SVP抑制植物成花可能是通過抑制下游基因SOC1和FT的表達參與植物開花進程調(diào)控。低溫和乙烯利處理都可以誘導菠蘿成花，即低溫和乙烯可以加速菠蘿營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變。乙烯利明顯下調(diào)‘臺農(nóng)4號菠蘿AcSVP1和AcSVP2基因在莖尖和葉組織中的表達，表明AcSVP1和AcSVP2基因可能參與了乙烯利誘導菠蘿營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變過程。
已有研究表明，乙烯通過加速DELLE蛋白的富集影響赤霉素途徑從而達到延緩成花的目的，AtSVP可以通過抑制赤霉素合成酶基因GA20ox2的表達降低赤霉素含量進而延遲擬南芥成花[20-21]。乙烯處理能夠延遲擬南芥開花、刺激菠蘿成花，表明乙烯對不同植物開花的調(diào)節(jié)不同，乙烯促進菠蘿成花是單獨作用還是與其他開花途徑共同作用值得關(guān)注[22-23]。
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責任編輯：黃東杰
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