吳廷娟 杜權(quán) 王玉星 謝小龍

摘要：選取北京三號和金狀元2個地黃品種的發(fā)病塊根，經(jīng)表面滅菌后切成小塊，置于PDA培養(yǎng)基上分離和純化致病菌;將純化后的真菌進行形態(tài)及顯微鑒定，再進行致病性檢測及分子生物學(xué)方法確定致病菌的種類;最后對3種常用殺菌劑甲霜·霉靈、代森錳鋅、肟菌·戊唑醇的抑菌效果進行評價。結(jié)果表明，從北京三號和金狀元中分別分離出5個致病菌株;經(jīng)過致病性試驗發(fā)現(xiàn)，北京三號3個菌株為致病菌株，金狀元中2個菌株為致病菌株;選擇2個優(yōu)勢致病菌作為試驗菌，發(fā)現(xiàn)3種殺菌劑的抑菌效果表現(xiàn)為250～500 mg/L肟菌·戊唑醇>2 000 mg/L代森錳鋅>3 333 mg/L甲霜·霉靈。利用組織分離法獲得的菌株，通過致病性測定確定致病菌后，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和基因序列分析確定致病菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和腐皮鐮刀菌（F. solani）以及黑曲霉菌（Aspergillus niger）;在3種殺菌劑中，以濃度為250～500 mg/L的肟菌·戊唑醇的抑菌效果最好，但應(yīng)結(jié)合田間施用效果才能確定是否能大面積推廣使用。本試驗結(jié)果可為地黃根腐病的田間防治提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：地黃;根腐病;致病性測定;防治;病原菌分離鑒定

中圖分類號： S435.672? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0132-05

收稿日期：2021-03-05

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2017YFC1702800）;河南省重大科技專項（編號：171100310500）。

作者簡介：吳廷娟（1981—），女，河南新鄉(xiāng)人，博士，講師，從事藥用植物栽培和病蟲害防治研究。E-mail：wutj2011@163.com。

通信作者：謝小龍，博士，副教授，從事中藥材規(guī)范化種植技術(shù)研究。E-mail：xiaolongxie@126.com。

地黃（Rehmannia glutinosa L.）為玄參科多年生草本植物，產(chǎn)于河南省焦作地區(qū)的溫縣、武陟、孟縣、博愛、沁陽等地，以干燥塊根入藥，主要功效為清熱涼血，養(yǎng)陰生津，能夠降血糖、保肝、止血、消炎等，具有很高的臨床使用價值和經(jīng)濟價值。但地黃病蟲害發(fā)生較為嚴重，尤其是根腐病，發(fā)病率較高，嚴重影響其產(chǎn)量及質(zhì)量，降低臨床使用價值，影響農(nóng)民的經(jīng)濟收入[1]。因此，研究地黃根腐病的病原菌，及探究適宜的殺菌劑對提高地黃的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。

地黃根腐病在發(fā)病初期，靠近地面的根莖和葉柄處會出現(xiàn)水浸狀黃褐色腐爛斑，逐漸向上向內(nèi)擴展，導(dǎo)致葉片變黃，甚至萎蔫，濕度大時，病部會產(chǎn)生白色棉絮狀的菌絲體。后期離地面較遠的根莖也發(fā)生干腐的癥狀，導(dǎo)致吸收水分和養(yǎng)分的功能急劇下降，嚴重時地黃整株腐爛，只剩下褐色的表皮和木質(zhì)部，導(dǎo)致產(chǎn)量大幅度下降[2]。目前，對地黃根腐病的研究發(fā)現(xiàn)其致病菌為鐮刀菌[3]、帕魯?shù)细t酵母[2]、立枯絲核菌和惡疫霉菌等[1]，病原菌較多。由于造成地黃根腐病的病原菌不確定，難以對癥下藥，造成防治效果差。同時，同一植物不同品種由于對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的塑造性不同，導(dǎo)致不同地黃品種具有不同的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，進而影響其抗病性。因此，本試驗擬通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，觀測2個當(dāng)家地黃品種根腐病的病原菌種類及致病性，并采用3種常用殺菌劑評價其抑菌效果，旨在為地黃根腐病的防治提供技術(shù)支持，為地黃的規(guī)范化種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用地黃塊根于2019年11月采自河南省焦作市溫縣地黃種植基地。分別采取北京三號與京狀元2個當(dāng)家品種的根腐病病株的塊根以及健康地黃的塊根。試驗于2019年12月至2020年6月在河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥材種植技術(shù)中心實驗室內(nèi)進行。

1.2 地黃根腐病病原菌的分離、純化與鑒定

選擇癥狀典型的、明顯的2個地黃品種發(fā)病株，分別切取地黃塊根病健交界處組織，選擇適合的表面滅菌方法，采用常規(guī)的組織分離法對病原菌進行分離。即將發(fā)病塊根用清水洗凈，置于肥皂水中浸泡30 min，于清水中浸泡2 h。洗凈塊根的表面泥土后，先用75%乙醇浸泡3 min，再用0.1%氯化汞溶液浸泡3 min[4]，最后用無菌水沖洗3遍，取最后一次的無菌水用涂布器均勻涂抹于PDA培養(yǎng)基上。在無菌操作臺上用鑷子夾取病健組織，用無菌刀切成1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm的小塊。每個PDA培養(yǎng)基上均勻放置4塊，每個品種重復(fù)5次。在PDA培養(yǎng)基上于28 ℃黑暗培養(yǎng)，每天記錄其生長情況。待其產(chǎn)生明顯菌落后，用無菌牙簽挑取病健組織塊附近的菌絲于PDA培養(yǎng)基上28 ℃黑暗培養(yǎng)。待分離物產(chǎn)孢后，采用單孢分離法進行純化，經(jīng)多次反復(fù)提純，獲得該菌的純培養(yǎng)物。然后將無菌液體石蠟油覆蓋于菌絲生長良好的瓊脂斜面真菌培養(yǎng)物表面，厚度為1 cm左右，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用肉眼觀察法，觀察菌落凸起性狀、菌落大小、菌落高度、形態(tài)、顏色和質(zhì)地方面的特征。依據(jù)真菌鑒定手冊，用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，如菌絲顏色、有無分枝和有無隔膜，并測量菌絲粗細，觀察從初生到后期菌絲顏色的變化及是否使培養(yǎng)基變色，孢子大小以及孢子梗的大小、形態(tài)等方面，并進行描述和鑒定[5-8]。

1.3 地黃根腐病病原菌致病性的測定及鑒定

選擇北京三號和金狀元健康、發(fā)病的植株的塊根，采用病原菌分離時的滅菌方法滅菌。然后于無菌條件下將地黃塊根（發(fā)病植株取病健交界處）縱切成2塊，分別做刻傷或不刻傷處理。然后把塊根分別放入鋪有2層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿放1塊，重復(fù)3次。將在28 ℃培養(yǎng)3 d 的待測分離物菌餅（5 mm）倒置于已做好傷口處理和不做傷口處理的地黃塊根上。每個塊根接種1個菌餅，以接種 PDA為對照，重復(fù)3次。將接種的塊根于38 ℃的種子老化箱中培養(yǎng)，觀察地黃塊根的發(fā)病情況，然后進行分離及形態(tài)學(xué)鑒定，并與第1次分離得到的菌株進行形態(tài)學(xué)上的比較，得到致病菌菌株。

形態(tài)學(xué)鑒定：將分離得到并保存在石蠟油中的菌株，挑取適量菌絲于PDA培養(yǎng)基上于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。3 d之后，通過肉眼觀察其形態(tài)特征，通過光學(xué)顯微鏡觀察其菌絲、孢子的形態(tài)特征，與第1次分離得到的菌株進行對照。

分子生物學(xué)鑒定：首先，將通過致病性測定確定的致病菌菌株在PDA培養(yǎng)基上經(jīng)活化培養(yǎng)后取新鮮菌絲，加入液氮充分研磨成粉末，提取DNA并進行電泳檢測;其次，用真菌的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對 rDNA-ITS 區(qū)段進行PCR擴增，電泳，測序。將獲得的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫的基因序列進行比對分析。最后利用Neighbor-Joining 方法進行聚類并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。

1.4 地黃根腐病致病菌的殺菌防治

本試驗共選擇3種常用的殺菌劑，即80%代森錳鋅可濕性粉劑（利民化工股份有限公司）、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（拜耳股份公司國內(nèi)辦事機構(gòu)）、3%甲霜·霉靈水劑（天津市綠亨化工有限公司）。先將3種殺菌劑配制成3個有效成分濃度梯度的藥液，再與溶化的培養(yǎng)基按藥液 ∶培養(yǎng)基=1 ∶9 （體積比）混合均勻，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，制成帶毒的培養(yǎng)基平面。然后用接種針將菌餅（1 cm）接種于培養(yǎng)基平面上，置于28 ℃的生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第4 天取出培養(yǎng)皿用十字交叉法測菌落直徑，求其平均值，再減去菌餅的直徑，即可測量出在不同濃度下的菌落直徑。最后根據(jù)測得的結(jié)果計算該殺菌劑對菌絲的生長相對抑制率，評價供試藥劑對目標菌生長的抑制活性。以其生長速度快慢即生長速率法[10]評價該藥劑的毒力大小。以無菌水為空白對照，每個處理重復(fù)3次。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落純生長量-菌餅直徑）×100%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

原始數(shù)據(jù)用Excel 2007進行整理分析。用SPSS 16.0對不同殺菌劑不同濃度下的抑菌率進行兩因素方差統(tǒng)計分析，對不同稀釋濃度條件下的抑菌率進行單因素方差分析。用MEGA 6.0軟件將獲得的株菌與獲取的同源性序列最高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 地黃根腐病病原菌的分離及形態(tài)學(xué)鑒定

從北京三號地黃根腐病發(fā)病病株分離出5個菌株，分別編號為BP1、BP2、BP3、BP4、BP5。金狀元地黃病株分離出5個菌株，分別編號為JP1、JP2、JP3、JP4、JP5。

BP1：菌落呈圓形，菌絲呈白色絨毛狀，絨毛稍密，菌落背面呈棕色，邊緣光滑全緣，無滲出物;菌絲為有隔菌絲，大型分生孢子近鐮刀形或紡錘形，有1個隔膜或者沒有隔膜，（5.0～15.0） μm×（4.0～5.0） μm，兩端稍鈍（圖1-a）。

BP2：菌落呈圓形，菌絲呈白色絨毛狀，絨毛較稀，菌落背面呈棕色，中心有色素分泌，呈現(xiàn)紅棕色，邊緣光滑全緣;菌絲為無隔菌絲，小型分生孢子腎形，（6.0～7.0） μm×（1.5～3.0） μm，大型分生孢子近鐮刀形，沒有隔膜，（5.0～15.0） μm ×（4.0～5.0） μm，頂端稍彎（圖1-b）。

BP3：菌落呈圓形，菌落呈白色絨毛狀，菌絲稍致密，菌落背面棕色，邊緣光滑，無滲出物;菌絲為無隔菌絲，小型分生孢子腎形，大型分生孢子鐮刀形，（5.0～15.0） μm×（4.0～5.0） μm，有1～4個隔膜（圖1-c）。

BP4：菌落呈圓形，菌絲起初為白色絨毛狀，后變?yōu)橹虚g淡綠色，周圍白色，呈放射狀，菌落背面呈灰棕色;菌絲無隔，多分枝，孢子呈圓形，4.0 μm×5.0 μm，頂生或者側(cè)生（圖1-d）。

BP5：菌落呈圓形，菌絲呈灰白色絮狀，特別疏松，生長速度快，無滲出物;菌絲無隔，孢子呈卵圓形，5.0 μm×6.0 μm，孢子囊頂生，類球形，孢子梗粗（圖1-e）。

JP1：菌落呈不規(guī)則形，菌落最初呈白色絨毛狀，較稀疏，隨后，中間顏色發(fā)生變化，呈淺藍色絨毛狀，四周仍為白色絨毛狀;菌絲為有隔菌絲，孢子呈圓形，3.0 μm×4.0 μm，孢子頂生（圖2-a）。

JP2：菌落呈圓形，菌落中心藍色，四周白色，呈較疏松的絨毛狀，菌落背面呈灰色;菌絲為有隔菌絲，孢子為圓形，4.0 μm×5.0 μm，附在菌絲上，菌絲頂端膨大（圖2-b）。

JP3：菌落呈橢圓形，菌落呈白色絨毛狀，較稀疏，菌落背面灰色，無滲出物;菌絲為無隔菌絲，孢子呈紡錘形或者鐮刀狀，（5.0～15.0） μm×（4.0～5.0） μm，有1～3個隔膜，中間略彎（圖2-c）。

JP4：菌落呈圓形，菌落呈白色絨毛狀，較疏松，菌落背面呈棕色，邊緣光滑，無分泌物;菌絲為有隔菌絲，大型分生孢子鐮刀狀，稍彎，（6.0～15.0） μm×（3.0～4.0） μm，多有1個隔膜（圖2-d）。

JP5：菌落呈圓形，菌落中心呈黑色絨毛狀，周圍白色絨毛狀，較疏松，菌落背面黑色;菌絲為有隔菌絲，孢子呈圓球形，4.0 μm×5.0 μm，孢子附在菌絲上，側(cè)生（圖2-e）。

2.2 致病性測定

前期用地黃塊根切片后進行接種試驗，確定北京三號的致病菌為BP1、BP2、BP3。然后將這3種致病菌分別接種至有傷和無傷的健康地黃塊根中。結(jié)果表明，3種致病菌均在傷口處生長，導(dǎo)致地黃表面顏色變褐，干枯腐爛，無傷處發(fā)病程度低。接種BP1、BP2至有傷和無傷的健康地黃中，僅4 d就表現(xiàn)出上述現(xiàn)象，接種BP3于5 d后才表現(xiàn)出上述現(xiàn)象。接種PDA培養(yǎng)基的無傷和有傷的地黃塊根沒有任何變化。再次鑒定BP1、BP2、BP3為致病菌。

將地黃片接種試驗中確定的金狀元的致病菌JP3、JP5接種至有傷和無傷的健康地黃塊根中，2種致病菌5 d后均在傷口處生長，導(dǎo)致地黃表面顏色變褐，干枯腐爛，無傷處發(fā)病程度低。接種PDA培養(yǎng)基的無傷和有傷的地黃塊根沒有任何變化，再次鑒定JP3、JP5為致病菌。

2.3 分離物鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

從發(fā)病的病健組織分離出致病菌，經(jīng)肉眼觀察其形態(tài)以及光學(xué)顯微鏡觀察其菌絲。孢子形態(tài)分別與北京三號的致病菌BP1、BP2、BP3，金狀元的致病菌JP3、JP5一致，再次證明BP1、BP2、BP3、JP3、JP5是導(dǎo)致地黃根腐病的致病菌。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

對致病菌BP1、BP2、BP3、JP3、JP5的測序結(jié)果表明，致病菌BP1、BP2、BP3、JP3、JP5 5個菌株的序列長度分別為516、515、540、541、575 bp（圖3）。將5個目的基因序列分別輸入NCBI的BLAST系統(tǒng)中，會得到與目的基因相似的序列，搜索下載同源性最高的序列，并與相似序列進行多重序列比較，再利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果可知，BP1與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）（JN624906.1等）聚在一起，且同源性達到98%;BP2與尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）（MT154248.1）聚在一起，同源性達到99%;BP3、JP3與腐皮鐮刀菌 （F. solani）（MT560378.1、MG543740.1）聚在一起，同源性為97%;JP5與黑曲霉（Aspergillus niger） （MT729920.1） 聚在一起，同源性為99%（圖4）。

2.4 殺菌劑防治

2.4.1 抑菌效果的測定

由表1可知，3種殺菌劑均對致病菌菌株BP1、BP2的生長有抑制作用，且整體的趨勢為隨著殺菌劑稀釋倍數(shù)變大（即有效濃度變?。?，對優(yōu)勢菌BP1、BP2的抑制作用越弱，抑菌率越低。其中，肟菌·戊唑醇在濃度為250、330、500 mg/L 時，殺菌率均達到100.0%，說明肟菌·戊唑醇的稀釋倍數(shù)十分適宜，且肟菌·戊唑醇的濃度最低，微量高效，防治效果最好。3種殺菌劑的抑菌率表現(xiàn)為250～500 mg/L肟菌·戊唑醇>2 000 mg/L代森錳鋅>3 333 mg/L甲霜·霉靈。

3 結(jié)論與討論

本次試驗利用組織分離法分離出的5個致病菌經(jīng)初步鑒定后，致病菌JP3與之前從重慶市石柱縣患根腐病的黃連分離與鑒定出來的腐皮鐮刀菌（F. solani） 一致。致病菌BP1、BP2與之前從患根腐病的胡蘿卜分離鑒定出來的尖孢鐮刀菌（F. oxysporium）[6]一致，因此可以說明鐮刀屬（Fusarium） 真菌是地黃根腐病的主要致病菌。在他人的研究中，層出鐮刀菌（F. proliferatum）[3]和帕魯?shù)细t酵母（Rhodotorula paludigena）[2]被確定為引起地黃根腐病的病原菌，但本試驗并未分離出該菌，可能與分離條件或樣本來源有關(guān)。本次試驗中得到的致病菌株黑曲霉菌（A. niger），屬于半知菌門曲霉屬絲狀真菌， 據(jù)報道該菌會引起軟而多汁的果實發(fā)生軟腐或造成絲蘭發(fā)生莖腐[10]。根據(jù)致病性試驗和分子鑒定，本試驗結(jié)果在一定程度上說明該黑曲霉菌有可能是引起地黃根腐病的病原菌之一。因此，本試驗結(jié)果表明，引起地黃根腐病的病原菌主要為尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和黑曲霉菌，具有多來源性。

在致病性試驗中，分離出來的4株鐮刀菌和1株黑曲霉菌的室內(nèi)致病性測定結(jié)果表明，這5株致病菌的發(fā)病病狀均表現(xiàn)為組織表面腐爛，皺縮，木質(zhì)部變黑，并且隨著溫度的升高，水分的增多，腐爛程度加劇。該結(jié)果表明高溫高濕是地黃根腐病發(fā)病的重要環(huán)境因素。因此在地黃栽培過程中要及時灌溉排水，避免高溫高濕。

本試驗選擇的殺菌劑是治療根腐病常用的殺菌劑，濃度均在推薦的濃度范圍內(nèi)。研究結(jié)果表明，75%肟菌·戊唑醇為防治地黃根腐病的最有效殺菌劑，低毒且高效，可在大田進一步試驗確定過后推廣使用。不同濃度下的代森錳鋅以及甲霜·霉靈也具有抑菌效果，但是抑菌率偏低?？赡苁窍♂尩臐舛绕?，或者優(yōu)勢菌BP1尖孢鐮刀菌、BP2尖孢鐮刀菌對代森錳鋅以及甲霜·霉靈不敏感。因此，關(guān)于地黃根腐病的防治還需要選擇更多種類、具有不同作用機制的殺菌劑來進行防治試驗，才能篩選出針對不同致病菌株的有效殺菌劑。

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