費學(xué)寧，鄭元杰，谷迎春，李光旻，趙洪賓，張寶蓮

天津城建大學(xué)理學(xué)院，天津 300384

引 言

熒光探針生物識別技術(shù)憑借其可視性影像表達(dá)及無創(chuàng)傷檢測等優(yōu)點，已成為重大疾病早期識別和組織成像研究的熱點問題。近年來熒光成像技術(shù)在癌癥靶向識別研究方面取得了長足進(jìn)展。葉酸受體(FR)介導(dǎo)的生物熒光探針識別研究持續(xù)受到關(guān)注。葉酸受體是癌細(xì)胞表面過量表達(dá)的標(biāo)志物，利用葉酸受體與葉酸的特異性結(jié)合關(guān)系，可介導(dǎo)葉酸及熒光偶聯(lián)物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部且不被放入溶酶體被破壞； 葉酸受體作為靶向標(biāo)志物在癌癥識別研究中具有獨特地位。癌癥和炎癥巨噬細(xì)胞表面過量表達(dá)的兩種葉酸受體亞型FAα和FAβ具有高度同源性，亞型的存在使得熒光探針識別癌癥和炎癥巨噬細(xì)胞存在著結(jié)構(gòu)性缺陷，F(xiàn)Aα和FAβ分別由257和255個氨基酸組成，區(qū)別在于三個末端未翻譯區(qū)，用來包結(jié)葉酸分子的三角空腔的三種氨基酸不同。如圖1所示，F(xiàn)Aα和FAβ存在的手性特性區(qū)別，兩種葉酸受體亞型的三角空腔構(gòu)成兩個不同手性特征的“手性空間”，為設(shè)計更加客觀識別癌細(xì)胞的“熒光-手性”靶向識別探針，實現(xiàn)癌癥和炎癥巨噬細(xì)胞的區(qū)分提供了可能性[1]。

1 生物熒光探針研究進(jìn)展

1.1 有機(jī)熒光染料探針

有機(jī)熒光染料探針在生物標(biāo)記過程中，具有熒光量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。文獻(xiàn)報道較多的主要有以下四類探針, 如表1所示。

表1 有機(jī)熒光探針分子修飾構(gòu)效關(guān)系Table 1 Molecular structure modification of organic dyes probes

含有長波長熒光發(fā)色團(tuán)的熒光分子具有對客體無損成像、生物體內(nèi)自發(fā)熒光且背景干擾低[2]等優(yōu)點。Koide等[2]將羅丹明B 10位的氧原子用硅原子取代，雜原子的電負(fù)性改變了雜環(huán)熒光染料分子中電子云密度分布，可使其熒光發(fā)射波長紅移到650 nm以上，熒光量子產(chǎn)率為0.39； 將羅丹明B的氧原子替換為砜基，產(chǎn)物的熒光發(fā)射波長可達(dá)700 nm以上，量子產(chǎn)率高于0.4，對細(xì)胞具有良好的兼容性。

研究表明, 近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ, 1 000～1 700 nm)熒光光譜成像可極大減弱生物組織對光的吸收、散射現(xiàn)象, 可顯著提升光譜成像效果，在重大疾病診斷與治療等領(lǐng)域表現(xiàn)出優(yōu)異的特性, 具有潛在的臨床應(yīng)用價值。由供電子基團(tuán)(D)和受電子基團(tuán)(A)構(gòu)筑的D-A-D熒光分子結(jié)構(gòu)，可大大的提高染料分子量子產(chǎn)率。苯并雙噻二唑(BBTD)作為一種強(qiáng)吸電子基團(tuán)具有高光穩(wěn)定性和高熒光效率(熒光發(fā)射最高峰可達(dá)1 000 nm以上)被廣泛應(yīng)用[3]。引入電子屏蔽基團(tuán)(S)設(shè)計的S-D-A-D-S型熒光探針結(jié)構(gòu)，可減少探針與其他分子的相互作用、碰撞猝滅，使分子熒光增強(qiáng)，量子產(chǎn)率可達(dá) 0.3以上。研究表明，處于高濃度或聚集狀態(tài)的熒光分子也能夠發(fā)射強(qiáng)熒光。四苯基乙烯是典型的具有上述聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)效應(yīng)特性的熒光分子。

1.2 無機(jī)量子點熒光探針

無機(jī)量子點(quantum dots, QDs)是另一類性能優(yōu)異的生物熒光探針，受光能激發(fā)產(chǎn)生熒光的生物標(biāo)記劑。包括第Ⅲ—Ⅴ或Ⅱ—Ⅵ族元素組成的如CdTe，CdSe和ZnS等無機(jī)金屬半導(dǎo)體量子點、碳量子點等。尺寸在1～10 nm之間[4], 與有機(jī)染料相比，量子點具有熒光量子產(chǎn)率高、激發(fā)光譜連續(xù)，熒光發(fā)射光譜窄，峰型對稱等優(yōu)點[4]。

2 生物熒光探針靶向修飾

熒光探針對癌細(xì)胞的特異性作用是實現(xiàn)癌癥細(xì)胞靶向識別的客觀要求。葉酸是維持細(xì)胞功能的基本物質(zhì)之一，葉酸憑借能與葉酸受體特異性結(jié)合的特點，在介導(dǎo)熒光探針靶向識別腫瘤研究中具有獨到的地位。

2.1 葉酸受體介導(dǎo)的腫瘤識別探針分子改性研究

常見于通過葉酸分子活性位點與熒光探針分子進(jìn)行偶聯(lián), 可賦予熒光分子的靶向性； 葉酸和多糖(殼聚糖、環(huán)糊精等)修飾熒光染料分子，可提高熒光靶向探針的生物相容性； 葉酸修飾量子點探針，檢測靈敏、量子產(chǎn)率高； 葉酸修飾熒光納米聚合物點，化學(xué)與熱力學(xué)穩(wěn)定性及生物相容性好。

癌癥和炎癥巨噬細(xì)胞表面過量表達(dá)的兩種葉酸受體亞型FAα和FAβ的高度同源性使得熒光染料探針在識別癌癥和炎癥巨噬細(xì)胞的過程中存在著結(jié)構(gòu)性缺陷。科學(xué)家重新審視腫瘤細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)指出，可依照葉酸受體的三維結(jié)構(gòu), 研究基于葉酸受體亞型介導(dǎo)的細(xì)胞靶向標(biāo)記物的信息應(yīng)答關(guān)系，設(shè)計特異性識別探針，有望提升識別效率。

2.2 葉酸受體的手性特征

葉酸受體有4種不同的亞型(FRα，F(xiàn)Rβ，F(xiàn)Rγ和FRδ)，前兩者因在癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面過量表達(dá)被密切關(guān)注。FRα主要在約90%癌細(xì)胞中過量表達(dá)，與人類乳腺及口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB)中的蛋白相同，分子量為28 256，由257個氨基酸組成； FRβ主要在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎癥部位巨噬細(xì)胞表面，胎盤和單核細(xì)胞中高表達(dá)，分子量為27 401，由255個氨基酸組成。葉酸受體亞型FRα和FRβ約有70%的同源性，主要區(qū)別位于三個末端未翻譯區(qū)，有三種不同種類的氨基酸形成一個用來包結(jié)葉酸分子的三角空腔； FRα為丙氨酸(Alanine)、纈氨酸(Valine)、谷氨酸(Glutamate)； FRβ為亮氨酸(Leucine)、甘氨酸(Glycine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)； 如圖1所示： 葉酸受體的結(jié)構(gòu)性差異及結(jié)合葉酸的口袋作用關(guān)系。FRα和FRβ本身的結(jié)構(gòu)對不同的配體表現(xiàn)出立體特異性[5]。葉酸受體亞型存在的“手性空間”差異性為設(shè)計新型的基于亞型手性選擇性表達(dá)識別探針提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖1 葉酸受體結(jié)構(gòu)性差異及結(jié)合葉酸的口袋關(guān)系(a)，(b)： 葉酸受體正反兩面示意圖; (c)： 包結(jié)葉酸的三角空腔; (d)： 葉酸α，β亞型區(qū)別Fig.1 Structural differences of folate receptor and pocket relationship of folate binding(a), (b): The figure show the positive and negative sides of folate receptor;(c): The triangle cavity of folate inclusion; (d): The difference of folate α and β subtypes

2.3 手性熒光探針分子識別氨基酸

2.3.1 手性熒光探針分子識別氨基酸原理

現(xiàn)有氨基酸的識別法主要包括光譜法、電化學(xué)發(fā)光分析、色譜法和手性識別傳感器檢測法等。光譜分析法因其利用手性對映體本身不同旋光和圓二特征可快速識別手性化合物得到廣泛應(yīng)用[6]。其中最常用的對手性化合物的表征方法是利用圓二色性(CD)，對氨基酸的R、L兩種構(gòu)型發(fā)生電子躍遷過程中對圓偏振光吸收程度不同進(jìn)行區(qū)分，可在溶液狀態(tài)下測定，較接近其生理狀態(tài)[6]。手性光譜識別法的原理是基于手性對映異構(gòu)體和外界手性環(huán)境(如環(huán)糊精和多糖)之間發(fā)生氫鍵、疏水和靜電等非共價相互作用，形成非對映異構(gòu)體，或者手性選擇劑對手性對映體吸附效應(yīng)不同，引起圓二特征峰或熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯變化，進(jìn)而實現(xiàn)手性識別。

2.3.2 用于識別氨基酸的手性熒光探針分子設(shè)計

可用于手性識別氨基酸的分子有以下幾類： 基于聯(lián)萘酚不同位點進(jìn)行修飾的環(huán)狀分子，手性大環(huán)的特殊結(jié)構(gòu)與氨基酸作用，通過熒光增強(qiáng)能很好的區(qū)分α-氨基酸； 方酰胺因其獨特的四元環(huán)剛性結(jié)構(gòu)、較強(qiáng)的氫鍵給體屬性和兩個側(cè)鏈易于修飾的特點在手性識別領(lǐng)域成為研究熱點之一。在其分子上引入堿性的叔胺基團(tuán), 可與氨基酸顯酸性的羧基中和, 羧基上的質(zhì)子轉(zhuǎn)移到叔胺上形成鹽，兩個氫鍵位點被溶劑占據(jù)或與過量的氨基酸結(jié)合形成雙氫鍵而引起熒光強(qiáng)度的變化，可實現(xiàn)對氨基酸的手性識別； 在分子中同時引入兩個方酰胺片段, 可構(gòu)建一類具有4個氫鍵作用位點的口袋式探針分子，通過與氨基酸作用引起熒光強(qiáng)度的改變從而達(dá)到識別的效果[7]。

近年來，由于手性量子點同時具有熒光和手性識別特性并能為測試提供手性環(huán)境等優(yōu)點受到廣泛關(guān)注。

2.4 手性無機(jī)量子點

量子點連接L-半胱氨酸等手性配體即成為手性量子點，2007年，Gun’ko課題組合成了左旋/右旋-青霉胺穩(wěn)定的并具有鏡像對稱CD信號的CdS量子點被正式提出[8]，與未被修飾的量子點相比，量子產(chǎn)率明顯提升。手性有機(jī)分子與無機(jī)納米粒子的耦合實現(xiàn)了手性從分子尺度向納米尺度的跨越, 此外，某些蛋白質(zhì)和藥物只對一個對映體有活性，而具手性特性能為其標(biāo)記、測試提供不可多得的手性環(huán)境，也是目前納米科學(xué)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一[9]。

2.4.1 量子點手性產(chǎn)生的本質(zhì)和發(fā)光原理

Takuya Nakashima課題組[10]合成巰基封端的手性CdTe納米晶體，通過對圓二譜圖的分析，推測手性產(chǎn)生的本質(zhì)。CdSe量子點未在第一激子躍遷帶(400 nm以上)范圍內(nèi)出現(xiàn)CD信號，因此觀測到的CD信號不能歸因于核的第一激子躍遷。他們推測手性來源于包括手性封端分子在內(nèi)的表面殼層，巰基通過S原子配位Cd原子形成Cd-S配體單層，手性分子中硫醇電子直接躍遷到Cd，改變原子表面電子躍遷引起手性變化。

圖2 巰基封端CdTe納米晶圓二譜圖Fig.2 Spectrogram of sulfhydryl terminated CdTe nanocrystals

Li等[11]通過研究手性半胱氨酸(Cysteine, Cys)與CdTe量子點作用機(jī)制探究手性產(chǎn)生的本質(zhì)，如圖3所示，量子點本身能產(chǎn)生圓二信號，當(dāng)手性Cys與呈四面體排布的CdTe量子點結(jié)合時，Cys的巰基與Cd原子成鍵產(chǎn)生手性中心，在280～400 nm產(chǎn)生明顯的CD信號, 不僅保留了半胱氨酸本身的手性信號, 還顯示出手性分子誘導(dǎo)的CdTe核的手性(250～350 nm的寬峰)，因此類四面體可能是表現(xiàn)手性行為的主要因素，且手性可能源于更容易被修飾或置換的納米粒子頂端原子的貢獻(xiàn)。

圖3 CdTe量子點的圓二特征峰以及結(jié)構(gòu)Fig.3 Circular dichotomous peaks and structures of CdTe quantum dots

有研究發(fā)現(xiàn)金納米粒子也可以被手性配體誘導(dǎo)產(chǎn)生手性。Alvarez等[12]利用谷胱甘肽作為穩(wěn)定劑制備了手性Au28量子點，在可見光區(qū)顯示出了配體誘導(dǎo)的手性信號。

本課題組通過研究L/D-cys-CdTe量子點與半胱氨酸、亮氨酸、谷氨酸對映體相互作用時，通過光學(xué)活性的變化探究了手性產(chǎn)生的本質(zhì)，并提出兩種主要的觀點： 第一，手性是由外殼層的結(jié)構(gòu)手性變形引起，可能是由于表面原子的手性變形或配體殼的手性排列引起。第二，手性配體和半導(dǎo)體量子點間的電子相互作用(而不是物理畸變)反過來會導(dǎo)致圓二發(fā)光[11]； QD-CD光譜形狀和誘導(dǎo)的CD帶的大小取決于許多因素，如材料本身的性質(zhì)、合成過程中使用的手性配體的濃度等。

理解QD與手性配體之間的關(guān)系，可為手性量子點手性的起源提供另一種視角； 手性量子點能為對映體識別提供不可多得的手性環(huán)境，在借助光譜生物成像和醫(yī)學(xué)診療方面具有潛在的應(yīng)用價值。

2.4.2 手性量子點識別氨基酸對映體

一些對映體和手性量子點之間的相互作用會改變他們的光物理和光化學(xué)特性，使其更具有辨識度。但目前只有少數(shù)報道研究手性半導(dǎo)體量子點與其他手性部分(如氨基酸)之間的相互作用。在量子點表面修飾手性配體(半胱氨酸、環(huán)糊精、焦谷氨酸)，制備的手性量子點可用來手性識別氨基酸對映體。環(huán)糊精((Cyclodextrin，CD)是一種具有客體包合能力的手性分子，適合手性化合物的對映體選擇性分析，其空腔能夠和多種物質(zhì)如有機(jī)分子、無機(jī)離子等通過分子間作用力形成包合物，引起熒光強(qiáng)度不同程度的改變； 焦谷氨酸是一種廉價易得的手性原料，相對堅硬的五元內(nèi)酰胺骨架和羧酸基團(tuán)可形成雙氫鍵，提供了很強(qiáng)的捕捉目標(biāo)分子的能力，在氨基酸的識別上提供了一種新的手性對映體識別模塊[13]。

Hak Sung Jung課題組[14]用谷胱甘肽穩(wěn)定CdSe/ZnS量子點，利用雙功能偶聯(lián)劑，將包含羅丹明B的β-環(huán)糊精連接到量子點上制備熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針成功識別不同構(gòu)型的苯丙氨酸。量子點作為能量的給與者, 羅丹明B作為能量的接受者，與苯丙氨酸作用后，苯丙氨酸替換羅丹明B，由于不同構(gòu)型的苯丙氨酸與環(huán)糊精締合常數(shù)不同，熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象被不同程度的破壞，憑借熒光強(qiáng)度的變化區(qū)分對映體。類似的原理還有以β-環(huán)糊精為穩(wěn)定劑, 制備的CdSe/ZnS核殼結(jié)構(gòu)量子點, 成功實現(xiàn)了對酪氨酸對映體的手性識別。Zhou Xu等制得β-環(huán)糊精修飾的銀量子點并成功區(qū)分色氨酸對映體。

Zhu等[13]利用巰基片段修飾焦谷氨酸制備手性配體，連接到CdSe/ZnS量子點表面，如圖4所示，焦谷氨酸內(nèi)酰胺部分具有卓越的氫鍵和立體控制能力易于捕獲目標(biāo)分子。對映體與手性識別模塊可構(gòu)成的氫鍵容量不同，結(jié)果表明，該手性量子點對D/L-組氨酸(Histidine)、D/L-谷氨酸(Glutamate)對映體具有良好的手性選擇性。

圖4 焦谷氨酸修飾的CdSe/ZnS量子點Fig.4 Pyroglutamic acid modified CdSe/ZnS quantum dots

韓翠平等[15]用環(huán)糊精修飾制得的手性量子點和巰基乙酸修飾制備的非手性量子點與氨基酸作用，發(fā)現(xiàn)非手性量子點無法區(qū)分氨基酸對映體，由此他們推測手性量子點的對映選擇效應(yīng)是由于手性配體與氨基酸的相互作用。氨基酸與環(huán)糊精作用，原子的嵌入/連接引起核外配體結(jié)構(gòu)變化，限制分子構(gòu)象，誘導(dǎo)環(huán)糊精均勻排列，這種有序取向/增強(qiáng)的構(gòu)象剛性會抑制猝滅路徑，增強(qiáng)了發(fā)光強(qiáng)度。

因此手性識別模塊的構(gòu)建是實現(xiàn)特異性識別的關(guān)鍵。通過手性量子點對不同氨基酸的特異性識別，有望區(qū)分葉酸的兩種不同亞型，進(jìn)而區(qū)分腫瘤細(xì)胞和炎癥巨噬細(xì)胞(如圖5所示)。手性納米結(jié)構(gòu)是一類具有獨特性質(zhì)和潛在應(yīng)用價值的材料, 將分子的手性傳遞到納米尺度并挖掘其生物應(yīng)用具有非常重要的意義, 但是將手性量子點真正運用于人體腫瘤診斷還需要進(jìn)行大量的實驗，同時也面臨著許多挑戰(zhàn)，如探針的重金屬離子溶出和生物相容性等問題； 值得關(guān)注的是，腫瘤細(xì)胞與炎癥巨噬細(xì)胞表面過量表達(dá)的葉酸受體，其亞型存在的不同手性特征，為構(gòu)建實現(xiàn)區(qū)分癌癥和炎癥的生物手性熒光探針提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖5 葉酸受體亞型FRα和FRβ的手性空間與手性量子點作用關(guān)系Fig.5 Chiral space of folate receptor subtypes FRα and FRβ and their interaction with chiral quantum dots

3 結(jié) 論

手性探針的特異性可被用于設(shè)計構(gòu)建葉酸受體亞型水平識別探針，進(jìn)而探討對癌細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)靶向識別的科學(xué)性與可行性, 具有潛在的應(yīng)用前景和不可替代的優(yōu)勢； 值得關(guān)注的是，葉酸受體亞型的三角空腔是由三種不同的氨基酸構(gòu)成的，與單一氨基酸識別的不同之處，三角空腔中三種氨基酸是以一定的空間位置構(gòu)成的“手性空間”?！笆中钥臻g”中如此近的氨基酸質(zhì)點之間的電子擾動行為和能量作用關(guān)系，是否存在“手性能量轉(zhuǎn)移”現(xiàn)象是值得關(guān)注的重要問題。隨著對手性物質(zhì)本質(zhì)規(guī)律的進(jìn)一步理解，對疾病本質(zhì)的進(jìn)一步認(rèn)識, 手性質(zhì)點之間的作用關(guān)系將會對癌細(xì)胞精準(zhǔn)識別提供新的依據(jù)。

相信隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展, “腫瘤標(biāo)記物學(xué)”這一新興學(xué)科會取得更長足的發(fā)展、為早期反映體內(nèi)腫瘤變化狀態(tài)提供更充足的依據(jù)。