楊敏娜 朱 煥 高偉星 曲永利

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163000)

對(duì)人類與嚙齒類動(dòng)物腸道早期定植菌群結(jié)構(gòu)和來(lái)源的分析顯示，哺乳動(dòng)物腸道微生物的早期定植具有很強(qiáng)的母源特征，母代來(lái)源的微生物在子代腸道菌群形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[1]。腸道微生物在早期發(fā)育過(guò)程中對(duì)天然免疫系統(tǒng)的成熟具有重要影響[2]。此外，胃腸道微生物區(qū)系具有重要的代謝和營(yíng)養(yǎng)作用[3]，并且影響動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能，對(duì)動(dòng)物的整體福利有很大的影響[4-5]。

然而，哺乳動(dòng)物新生兒腸道微生物的起源仍然存在爭(zhēng)議。有研究報(bào)道在妊娠期母體不同部位均發(fā)現(xiàn)了微生物區(qū)系，包括羊水、臍帶血、子宮內(nèi)膜、胎膜[6-9]等部位，對(duì)應(yīng)的嬰兒胎糞中也發(fā)現(xiàn)微生物的存在[10]。Quercia等[11]的研究結(jié)果表明，從胎兒時(shí)期起，母馬不同部位的微生物群落在馬駒腸道中進(jìn)行了定植。Ferretti等[12]通過(guò)菌株分析也表明某些菌株可能從母代垂直傳遞到子代并進(jìn)行定植。以上這些研究說(shuō)明了在妊娠期間，母體各個(gè)部位的微生物可能通過(guò)某種內(nèi)源途徑傳遞給子代。目前有關(guān)子代微生物母源傳遞的研究絕大部分是關(guān)于人的，奶牛相關(guān)研究的報(bào)道很少。本試驗(yàn)利用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，結(jié)合SourceTracker方法，對(duì)母牛糞便、初乳、胎盤、羊水、臍帶和胎糞的微生物區(qū)系進(jìn)行分析，探討母牛不同部位的微生物來(lái)源對(duì)犢牛后腸道微生物區(qū)系的影響，深入了解母牛微生物對(duì)犢牛腸道定植的作用，將有助于設(shè)計(jì)對(duì)早期犢牛腸道微生物群落結(jié)構(gòu)干預(yù)的策略，為改善犢牛健康狀況，特別是在免疫系統(tǒng)發(fā)育方面奠定科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)在黑龍江省某荷斯坦奶牛場(chǎng)進(jìn)行，選取15頭健康且預(yù)產(chǎn)期相近的經(jīng)產(chǎn)奶牛(2胎)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)期內(nèi)所有的母牛均在同一牛舍內(nèi)飼養(yǎng)，并在預(yù)產(chǎn)期前1周左右集體轉(zhuǎn)移至產(chǎn)房。所有妊娠期的奶牛均在農(nóng)場(chǎng)工人的監(jiān)督下產(chǎn)犢。按照試驗(yàn)采樣標(biāo)準(zhǔn)要求，最終選取6對(duì)荷斯坦母牛及其所生犢牛的樣品進(jìn)行研究。所有樣品均由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的獸醫(yī)取樣。

1.2 樣品采集

母牛分娩后立即對(duì)所有樣品進(jìn)行采集。胎盤與臍帶取樣：采用無(wú)菌設(shè)備對(duì)胎盤(臍帶)快速處理，從胎盤(臍帶)內(nèi)部切取樣本，盡量減少環(huán)境中微生物污染的可能性。羊水取樣：當(dāng)羊水囊清晰可見(jiàn)時(shí)，使用無(wú)菌手套和20 mL無(wú)菌注射器，用70%乙醇拭子擦拭胎膜后，采用穿刺法取出至少10 mL羊水。糞便取樣：用無(wú)菌手術(shù)手套對(duì)母牛和尚未被飼喂初乳的新生犢牛進(jìn)行直腸取樣。初乳取樣：在分娩后，立即在犢牛第1次哺乳前，乳房用肥皂水消毒后，隨后用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行擦洗，通過(guò)棄去頭幾滴乳汁來(lái)沖洗乳腺導(dǎo)管，收集5 mL的乳汁于無(wú)菌管中。所有樣品均放于無(wú)菌管中，分裝編號(hào)后迅速投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA提取

所有工作都在嚴(yán)格控制、分離和無(wú)菌的工作場(chǎng)所進(jìn)行。采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，將離心管中適量的樣本DNA用無(wú)菌水稀釋樣本至1 ng/μL。

1.4 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的混樣和純化

以稀釋后的基因組DNA為模板，通過(guò)使用帶Barcode的特異引物和高效高保真酶對(duì)測(cè)序區(qū)域進(jìn)行PCR。用2%濃度的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.5 文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)下機(jī)后，從中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，通過(guò)使用FLASH[13]對(duì)每個(gè)截去Barcode和引物序列的樣本reads進(jìn)行拼接得到原始Tags數(shù)據(jù)；利用Qiime 1.9.1軟件[14]對(duì)Tags進(jìn)行質(zhì)控，使用物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Tags序列[15]進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)，并去除其中的嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)。利用Uparse 7.0.1001軟件[16]將所有序列以97%的一致性聚類成為操作分類單元(OTU)，用Mothur方法與SILVA132[17]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[18]對(duì)OTU分析中出現(xiàn)頻數(shù)最高的代表序列從門到屬進(jìn)行物種注釋(設(shè)定閾值為0.81)。

為了評(píng)估測(cè)序深度和生物多樣性豐富度，建立了所有樣品的稀疏曲線。通過(guò)R 3.0.3軟件中的VennDiagram包繪制花瓣圖。計(jì)算樣品間Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)，并用wilcox秩和檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著?；赨nweighted Unifrac距離來(lái)進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，評(píng)價(jià)不同樣本類型之間微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)差異[19]。本研究通過(guò)R 3.4.1軟件中的SourceTracker包分析母牛不同部位微生物來(lái)源對(duì)犢牛胎糞中微生物的相對(duì)貢獻(xiàn)度。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性O(shè)TU

從胎盤、臍帶、羊水、母牛糞便、胎糞和初乳等6類36個(gè)樣品中產(chǎn)生了3 447 210條原始讀碼。將有效數(shù)據(jù)以97%的一致性進(jìn)行OTU聚類。圖1為所有樣本類型的花瓣圖，其中羊水的特異性O(shè)TU最多(801個(gè))，其次是初乳(641個(gè))、胎盤(630個(gè))、胎糞(343個(gè))、臍帶(266個(gè))、母牛糞便(97個(gè))，所有組共享916個(gè)OTU。

T：胎盤；Q：臍帶；Y：羊水；C：初乳；M：母牛糞便；D：胎糞。下圖同。T:placenta;Q:umbilical cord;Y:amniotic fluid;C:colostrum;M:cow feces;D:meconium.The same as below.圖1 OTU花瓣圖Fig.1 OTU petals diagram

2.2 母子不同類型樣本微生物區(qū)系的α多樣性

Shannon多樣性指數(shù)曲線趨于平穩(wěn)(圖2)，表明本試驗(yàn)的測(cè)序深度足以捕捉具有代表性的微生物多樣性。在取樣深度為424 824時(shí)，用wilcox秩和檢驗(yàn)對(duì)Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析(表1)。Shannon指數(shù)差異顯著性分析表明，除胎糞和羊水、胎糞和胎盤組間差異顯著(P<0.05)外，其余樣本類型間差異均不顯著(P>0.05)。Chao1指數(shù)差異顯著性分析表明，胎糞除了和母牛糞便差異不顯著(P>0.05)外，和其余母牛樣本類型差異均顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；胎糞和初乳、胎盤、臍帶樣本類型間差異顯著(P<0.05)，胎糞和羊水間差異極顯著(P<0.01)；母牛糞便和其他母體樣本類型差異極顯著(P<0.01)；其余樣本類型間差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 Shannon多樣性指數(shù)稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of Shannon diversity index

表1 不同樣本類型的α多樣性分析Table 1 α diversity analysis of different sample types

2.3 母子不同類型樣本微生物區(qū)系的組成特征

將本試驗(yàn)所得有效序列在門和屬水平上進(jìn)行物種注釋和統(tǒng)計(jì)(圖3和圖4)，結(jié)果表明，在門水平上，羊水、初乳、臍帶和和胎糞的主要優(yōu)勢(shì)菌門相同，為變形菌門(Proteobacteria)，次要優(yōu)勢(shì)菌門也相同，為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)。胎盤的主要優(yōu)勢(shì)菌門為Proteobacteria和Firmicutes，Bacteroidetes和Actinobacteria是胎盤的次要優(yōu)勢(shì)菌門。母牛糞便主要是由Firmicutes和Bacteroidetes組成。在屬水平上，假單胞菌屬(Pseudomonas)是羊水、初乳、胎盤和臍帶中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬，但在母牛糞便和胎糞中是第2優(yōu)勢(shì)菌屬。Limnobacter和短波單胞菌屬(Brevundimonas)是羊水、初乳和胎盤中的次要優(yōu)勢(shì)菌屬，臍帶、母牛糞便和胎糞中也含有這些菌屬，但是這些菌屬的相對(duì)豐度都很低。在母牛糞便中，所有物種的相對(duì)豐度都很低，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)是相對(duì)豐度最高的菌屬。嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)是胎糞中相對(duì)豐度最高的菌屬。

圖3 門水平上的物種相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundances of species at phylum level

圖4 屬水平上的物種相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundances of species at genus level

2.4 母子不同類型樣本微生物區(qū)系的β多樣性特征分析

利用基于Unweighted Unifrac距離來(lái)進(jìn)行PCoA的方法，評(píng)價(jià)胎糞與母體樣本微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的特征差異(圖5)。母牛糞便的個(gè)體聚集程度最高，表明母牛糞便的組內(nèi)相似度比其他樣本類型都高。母牛糞便和胎糞都不與其他母體樣本類型位置相似，表明母體糞便和胎糞都有獨(dú)特的微生物區(qū)系。羊水和初乳、胎盤和臍帶的位置相似，表明羊水和初乳、胎盤和臍帶微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)相似。

圖5 PCoA聚類分析Fig.5 Cluster analysis by PCoA

2.5 用SourceTracker預(yù)測(cè)胎糞微生物的母體來(lái)源

利用基于貝葉斯方法的SourceTracker分析估計(jì)母體不同部位潛在的微生物來(lái)源對(duì)新生犢牛胎糞中微生物貢獻(xiàn)的比例。SourceTracker分析結(jié)果表明，母牛的胎盤、臍帶、羊水、初乳和糞便中的微生物均對(duì)新生犢牛胎糞菌群的定植有貢獻(xiàn)，按貢獻(xiàn)比例由高到低依次為臍帶(23.45%)、胎盤(16.35%)、初乳(14.29%)、羊水(11.45%)、母牛糞便(9.93%)。其胎糞群落主要由來(lái)自臍帶的微生物組成；未知來(lái)源微生物貢獻(xiàn)占24.53%(圖6)。

圖6 SourceTracker分析不同微生物來(lái)源對(duì)犢牛胎糞微生物的貢獻(xiàn)度Fig.6 SourceTracker analysis of potential microbial sources of meconium microbiota of calves

3 討 論

為了盡量減少污染微生物樣本的機(jī)會(huì)，在犢牛出生后立即對(duì)母牛糞便、初乳、羊水、胎盤、臍帶和胎糞樣本進(jìn)行無(wú)菌采集。與以往收集新生犢牛出生后幾天糞便樣本的研究不同，本研究分析的是胎糞樣本，其代表犢牛出生時(shí)的腸道內(nèi)容物，不受飲食等環(huán)境影響[20]。在此研究中，6種樣本類型都檢測(cè)到了微生物群，α多樣性的顯著性差異分析表明，犢牛胎糞除了和羊水、胎盤間微生物群落多樣性差異顯著外，和其余母體樣本類型間微生物群落多樣性差異均不顯著；胎糞除了和母牛糞便間微生物群落豐富度差異不顯著外，和其余母牛樣本類型微生物豐富度差異均顯著或極顯著。從β多樣性分析可以看出每種樣本類型的微生物區(qū)系都表現(xiàn)出不同的特征。此外，在所有樣本類型中均發(fā)現(xiàn)了只出現(xiàn)于某一樣本類型的特異性O(shè)TU。胎糞中有343個(gè)特異性O(shè)TU，這些OTU并非來(lái)自本研究中的母體部位，很有可能來(lái)自于其他未被研究的母體部位。胎盤、臍帶和羊水的第3優(yōu)勢(shì)菌門均是Bacteroidetes，此菌門也是Moore等[21]研究中青年母牛子宮內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌門之一。在初乳中發(fā)現(xiàn)了相對(duì)豐度較小的Halomonas,其不僅是鹿乳汁微生物的優(yōu)勢(shì)微生物之一，也是奶酪表面的優(yōu)勢(shì)微生物，其可能與乳汁中其他微生物產(chǎn)生互作，并且受到乳汁環(huán)境的影響[22]。本研究發(fā)現(xiàn)胎盤和胎糞中均存在乳桿菌屬(Lactobacillus)。Satokari等[23]也在胎盤及胎糞中發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬(Lactobacillus)，說(shuō)明在妊娠期間母體的羊水、臍帶血、胃腸道等可能通過(guò)某種內(nèi)源途徑將自身菌群垂直傳遞給子代。SourceTracker分析表明母牛的糞便、胎盤、臍帶、羊水和初乳中的微生物均是犢牛胎糞菌群的主要來(lái)源，其中臍帶微生物對(duì)犢牛胎糞微生物定植的貢獻(xiàn)最大。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是由于產(chǎn)前母代和子代的主要聯(lián)系是臍帶，所以其不僅是母代和子代之間進(jìn)行代謝廢物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換的通道，而且有可能是母代和子代之間進(jìn)行微生物傳遞的主要途徑。羊水中的微生物可能是通過(guò)子代吞咽羊水的過(guò)程進(jìn)入子代腸道并進(jìn)行定植，最終成為胎糞生態(tài)系統(tǒng)的一部分。這一結(jié)果和He等[24]發(fā)現(xiàn)羊水是胎糞菌群主要來(lái)源的結(jié)論一致。以上研究表明胎糞微生物區(qū)系可能來(lái)自于多個(gè)母體部位[11-12,24]，具有強(qiáng)烈的母源特征，但母體不同部位間微生物的傳遞途徑仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)犢牛胎糞中未知來(lái)源微生物(24.53%)貢獻(xiàn)占比較高，但由于本研究母體樣本類型的局限性，需要進(jìn)一步研究來(lái)確定未知來(lái)源微生物的母體來(lái)源。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為新生犢牛腸道微生物的最初定植來(lái)源于出生后2 d內(nèi)初乳或其他外界環(huán)境中的微生物。但本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，胎糞菌群是在胎兒生命期間已經(jīng)定植。初乳中的微生物可能是通過(guò)某種途徑到達(dá)胎兒腸道，而不是在犢牛出生后通過(guò)吮吸乳汁的方式直接對(duì)胎糞微生物區(qū)系產(chǎn)生影響，其更有可能的原因是胎糞和初乳微生物有共同的母體來(lái)源。這一觀點(diǎn)與上述不同母體部位的菌群通過(guò)某種傳遞途徑進(jìn)入子代腸道進(jìn)行定植的觀點(diǎn)一致，但具體途徑也有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

在本研究中，圍產(chǎn)期母牛胎盤、臍帶、羊水、初乳和糞便中的微生物均是犢牛腸道微生物的主要來(lái)源，其中臍帶微生物對(duì)胎糞微生物的定植貢獻(xiàn)最大；犢牛胎糞中還有許多未知來(lái)源且相對(duì)貢獻(xiàn)度(24.53%)較高的微生物，其母體來(lái)源有待深入研究。