趙紅霞 喬國賢,2 李培佳 陳曉瑛,3 陳 冰 黃 文* 曹俊明*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；3.廣州飛禧特生物科技有限公司，廣州 510640)

高密度養(yǎng)殖、飼料過量投喂、水體更換少和飼料營養(yǎng)不平衡等是集約化養(yǎng)殖環(huán)境中的氨氮濃度升高的主要因素[1-2]。養(yǎng)殖水體中氨濃度的上升易導(dǎo)致水生動物的低存活率、代謝變化、氧化應(yīng)激、免疫抑制和疾病[3-5]。因此，如何通過營養(yǎng)措施調(diào)控魚蝦免疫和抗病力受到廣泛關(guān)注。精氨酸(Arg)作為底物參與一氧化氮、蛋白質(zhì)和多胺的合成，并發(fā)揮重要的生物和生理功能，有助于增強(qiáng)動物機(jī)體的健康和促進(jìn)發(fā)育。有研究表明，Arg能夠提高養(yǎng)殖動物生產(chǎn)性能、調(diào)控蛋白質(zhì)合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、通過一氧化氮途徑修復(fù)創(chuàng)傷、抑制炎癥細(xì)胞因子表達(dá)、緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)[6-9]。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)是N-乙酰谷氨酸(NAG)的類似物，在動物體內(nèi)能夠作為前體物質(zhì)合成Arg[10]。NCG是一種安全、代謝穩(wěn)定的營養(yǎng)物質(zhì)，在臨床中對治療一些與健康有關(guān)的疾病具有有益作用[11]。補(bǔ)充NCG可以刺激內(nèi)源性Arg和瓜氨酸產(chǎn)生、促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成、提高生產(chǎn)性能和生長速度、調(diào)控信號通路和改變血漿Arg含量[12-14]。目前，NCG在水生動物方面的研究報道[15-19]較少。Arg和NCG對魚類生長、腸道功能和免疫抗氧化方面的不同影響及作用差異尚未有見報道。

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，鯰形目、鲿科、黃顙魚屬，雜食性溫水魚類。黃顙魚分布范圍廣，除西部高原外，全國各水域均有分布。近年來，隨著我國黃顙魚規(guī)?；B(yǎng)殖不斷增加，有關(guān)其健康狀況和病害防治方面的研究也在不斷加強(qiáng)。本實驗室前期研究顯示，黃顙魚飼料中Arg的適宜添加水平為2.64%～3.01%，NCG的適宜添加水平為0.025%[19-20]，在此基礎(chǔ)上，本試驗通過在飼料中添加Arg和NCG，研究Arg和NCG對黃顙魚幼魚生長、腸道健康、血清生化指標(biāo)和抗氨氮應(yīng)激能力的影響，比較Arg和NCG對黃顙魚的作用效果，為Arg及NCG在黃顙魚配合飼料中的應(yīng)用提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對照)、0.48%L-Arg(純度≥99%，購自寧波某氨基酸工業(yè)有限公司)、0.025% NCG(純度≥98%，購自某科技有限公司)，配制3種等氮等脂(42%蛋白質(zhì)和7%脂肪)試驗飼料[20]。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料粉碎后過60目篩，按照飼料配方要求準(zhǔn)確稱量，并逐級混勻后，加入魚油、豆油和30%的水，再次混合均勻后，用雙螺桿制粒機(jī)(SLX-80，華南理工大學(xué)科技實業(yè)總廠)擠壓成粒徑1.5 mm的顆粒飼料，55 ℃烘干，冷卻后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

續(xù)表1項目Items對照組Controlgroup0.48%Arg組0.48%Arggroup0.025%NCG組0.025%NCGgroup粗灰分Ash8.78.58.4水分Moisture7.97.97.4精氨酸Arg2.462.792.42

1.2 試驗設(shè)計及養(yǎng)殖管理

試驗用黃顙魚購自廣州市錦龍漁業(yè)有限公司，試驗養(yǎng)殖系統(tǒng)采取室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)。黃顙魚在室外水泥池中暫養(yǎng)2周，攝食40%蛋白質(zhì)和7%脂肪的試驗飼料，每天投喂2次。試驗開始時，隨機(jī)選取黃顙魚幼魚[(0.98±0.03)g] 480尾，按照試驗設(shè)計分為對照組、0.48% Arg組和0.025% NCG組，每個組設(shè)置4個桶，每桶放魚為40尾。按照黃顙魚初始體重的4%～6%投喂試驗飼料，每天投喂2次(08:30和18:30)，觀察黃顙魚攝食情況，養(yǎng)殖期間不斷調(diào)整投喂飼料量，養(yǎng)殖試驗周期設(shè)置為56 d。黃顙魚養(yǎng)殖試驗桶采取玻璃纖維桶，桶的半徑為80 cm，桶的高度為70 cm。試驗期間根據(jù)養(yǎng)殖周期平均每周換水1次，并測定水體理化指標(biāo)，養(yǎng)殖期間溶氧含量>6.0 mg/L，氨氮含量<0.20 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.01 mg/L，水溫27～32 ℃，pH 7.4～7.9，試驗采取自然光照。

1.3 樣品收集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，黃顙魚停止攝食24 h。每個養(yǎng)殖桶隨機(jī)取8尾黃顙魚，采用MS-222溶液(120 mg/L)麻醉處理，通過尾靜脈采集血液，在4 000 r/min離心10 min，收集血液上清液部分作為血清樣品，樣品保存在-80 ℃的冰箱中。另外選取5尾黃顙魚進(jìn)行解剖，采集肝臟、腸道樣品，并測定體長、體重和肝臟重。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 生長性能測定

式中：W0表示魚體初始體質(zhì)量(g)；Wt表示魚體終末體質(zhì)量(g)；N0表示初始魚尾數(shù)；Nt表示終末魚尾數(shù)；Wf表示飼料攝入量(g)；Lt表示試驗魚終末體長(cm)；t表示試驗天數(shù)(d)；Wg表示肝臟重(g)；Wq表示全魚重(g)。

1.4.2 飼料成分測定

飼料原料樣品分析參照AOAC(1984)[21]的方法。105 ℃烘干法測定飼料水分含量，凱氏定氮法測定飼料粗蛋白質(zhì)含量，索氏抽提法測定飼料粗脂肪含量，馬弗爐灰化法測定飼料粗灰分含量。

1.4.3 血清、腸道生化指標(biāo)測定

采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定血清和腸道生化指標(biāo)，測定指標(biāo)包括：一氧化氮(NO)、補(bǔ)體3(C3)、補(bǔ)體4(C4)、免疫球蛋白M(IgM)、丙二醛(MDA)含量，總抗氧化能力(T-AOC)，溶菌酶(LZM)含量，Na+K+-ATP酶(Na+K+-ATPase)、過氧化氫酶(CAT)、蛋白酶(trypsin)、脂肪酶(lipase)、淀粉酶(amylase)、超氧化物歧化酶(SOD)、精氨酸酶(ARG)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)、二胺氧化酶(DAO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性。

1.5 氨氮應(yīng)激試驗

56 d養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，從對照組、0.48% Arg組、0.025% NCG組的每個重復(fù)(n=4)中隨機(jī)選取20尾健康黃顙魚，采用氯化銨進(jìn)行應(yīng)激試驗，總氨氮濃度達(dá)到100 mg/L。觀察并記錄黃顙魚0、24、48、72 h內(nèi)各組死亡情況，計算72 h內(nèi)的累積死亡率(cumulative mortality rate，CMR)。

累積死亡率(%)=(應(yīng)激后試驗魚死亡尾數(shù)/應(yīng)激前試驗魚尾數(shù))×100。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SD；n=4)表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。先對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，滿足方差齊性條件則進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著再用Tukey’s檢驗方法進(jìn)行多重比較；方差齊性條件不滿足，則用Dunnett’s T3檢驗法進(jìn)行多重比較。差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長性能

由表2可知，與對照組和0.48% Arg組相比，飼料中添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚增重率(P<0.05)。對照組和0.48% Arg組黃顙魚的增重率沒有顯著差異(P>0.05)。各試驗組黃顙魚的飼料系數(shù)、存活率、肥滿度和肝體比沒有顯著差異(P>0.05)。

表2 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚生長性能的影響Table 2 Effects of dietary Arg or NCG on growth performance of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

2.2 腸道消化酶活性

由表3可知，飼料中添加Arg或NCG顯著影響黃顙魚腸道蛋白酶和脂肪酶活性。與對照組和0.025% NCG組比，飼料中添加0.48% Arg顯著增加了黃顙魚腸道蛋白酶活性(P<0.05)。與對照組和0.48% Arg組相比，飼料中添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚腸道脂肪酶活性(P<0.05)。飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚腸道淀粉酶活性無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚腸道消化酶活性的影響Table 3 Effects of dietary Arg or NCG on digestive enzyme activities of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

2.3 腸道功能指標(biāo)

由表4可知，飼料中添加Arg或NCG顯著影響黃顙魚腸道精氨酸酶、總一氧化氮合酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、二胺氧化酶和Na+/K+ATP酶活性(P<0.05)。與對照組和0.48% Arg組相比，飼料添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚腸道誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性(P<0.05)。0.025% NCG組黃顙魚腸道精氨酸酶、總一氧化氮合酶和二胺氧化酶活性顯著高于0.48% Arg組(P<0.05)。0.48% Arg組黃顙魚腸道Na+/K+ATP酶活性顯著高于0.025% NCG組(P<0.05)。飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚腸道鳥氨酸脫羧酶活性沒有顯著影響(P>0.05)。

表4 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚腸道功能指標(biāo)的影響Table 4 Effects of dietary Arg or NCG on intestinal function indices of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) U/mg prot

2.4 血清免疫指標(biāo)

由表5可知，與對照組相比，飼料中添加0.48% Arg或0.025% NCG顯著增強(qiáng)了黃顙魚血清溶菌酶含量(P<0.05)。0.025% NCG組黃顙魚血清溶菌酶含量顯著高于0.48% Arg組(P<0.05)。飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚血清一氧化氮、免疫球蛋白M、補(bǔ)體3、補(bǔ)體4含量無顯著影響(P>0.05)。

表5 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚血清免疫指標(biāo)的影響Table 5 Effects of dietary Arg or NCG on serum immune indices of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

2.5 血清抗氧化指標(biāo)

由表6可知，與對照組相比，飼料中添加0.025% NCG顯著增強(qiáng)了黃顙魚血清谷胱甘肽過氧化物酶活性(P<0.05)。0.48% Arg組黃顙魚血清谷胱甘肽過氧化物酶活性與對照組、0.025% NCG組之間沒有顯著差異(P>0.05)。與對照組和0.48% Arg組相比，飼料中添加0.025% NCG顯著增強(qiáng)了黃顙魚血清總抗氧化能力(P<0.05)。飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚血清一氧化氮、免疫球蛋白M、補(bǔ)體3、補(bǔ)體4含量無顯著影響(P>0.05)。

表6 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Effects of dietary Arg or NCG on serum antioxidant indices of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)

2.6 抗氨氮應(yīng)激能力

由表7可知，應(yīng)激48 h時，與對照組相比，飼料中添加0.48% Arg或0.025% NCG顯著了降低了黃顙魚累計死亡率(P<0.05)。應(yīng)激72 h時，與對照組相比，飼料中添加0.48% Arg或0.025% NCG顯著降低了黃顙魚累計死亡率(P<0.05)；0.025% NCG組黃顙魚累計死亡率顯著低于0.48% Arg組(P<0.05)。

表7 飼料中添加Arg或NCG對黃顙魚累計死亡率的影響Table 7 Effects of dietary Arg or NCG on cumulative motality rate of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) %

3 討 論

Arg在調(diào)控動物生長和生理代謝中發(fā)揮著重要作用[22]。飼料Arg缺乏導(dǎo)致養(yǎng)殖動物生長遲緩、腸道和生殖功能障礙、免疫和神經(jīng)發(fā)育受損和高血氨癥，甚至死亡[23-24]。飼料補(bǔ)充0.2%和0.4% Arg能夠提高仔豬血漿Arg含量和增重[25]。飼料Arg水平為2.74%時黃顙魚的增重和飼料效率顯著增加[26]。本試驗中，補(bǔ)充0.48% Arg使飼料Arg含量達(dá)到2.79%，對黃顙魚的增重率和飼料系數(shù)沒有顯著影響。但是本試驗得到了另一個有趣而重要的結(jié)果，相同條件下在黃顙魚飼料中添加0.025% NCG卻能夠顯著提高黃顙魚的增重率。飼料中添加NCG顯著提高黃顙魚增重率，可能黃顙魚對NCG合成的內(nèi)源Arg利用效率高于飼料添加的Arg。大鼠的飼料中添加1% Arg或0.1% NCG能夠減少肝臟和血漿的氧化應(yīng)激，0.1% NCG的作用效果優(yōu)于1% Arg[27]。斷奶仔豬飼料中添加0.6% Arg或0.08% NCG顯著提高生長性能，促進(jìn)腸道生長和完整性，并上調(diào)腸道熱休克蛋白70(HSP70)的表達(dá)[28]。目前關(guān)于Arg或NCG在水產(chǎn)動物中作用效果的比較研究尚未見報道，關(guān)于Arg和NCG作用機(jī)制的差異還有待于進(jìn)一步深入研究。

魚類的生長與腸道消化、吸收能力休戚相關(guān)，腸道的消化酶和刷緣膜酶在營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收過程中發(fā)揮重要作用[29]。Arg及其代謝物通過促進(jìn)組織完整性和細(xì)胞增殖對腸道產(chǎn)生有益影響[30]。本試驗中，飼料中添加0.48% Arg顯著增加了黃顙魚腸道蛋白酶活性，0.025% NCG顯著提高了黃顙魚腸道脂肪酶活性，但Arg或NCG對黃顙魚腸道淀粉酶活性沒有顯著影響。與本試驗結(jié)果一致，仿刺參飼料中添加Arg顯著增加腸道蛋白酶活性，但并不影響脂肪酶和淀粉酶活性[31]。建鯉飼料中補(bǔ)充Arg能夠和改善腸道蛋白酶和脂肪酶活性，但并不影響淀粉酶活性[32]。雜交鱘飼料補(bǔ)充Arg增加腸道蛋白酶和淀粉酶活性[33]。Arg對不同魚類消化酶的影響不盡相同，但關(guān)于NCG影響魚類消化酶方面的研究較少。研究顯示，羅非魚飼料補(bǔ)充NCG促進(jìn)了肌肉中的脂肪沉積[15]。Huang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，NCG能夠調(diào)控海鱸脂類代謝，通過促進(jìn)脂類分解緩解脂肪肝癥狀。因此，飼料中添加Arg和NCG對黃顙魚腸道消化酶的作用方式不同，Arg可能主要作用于腸道蛋白酶，促進(jìn)蛋白質(zhì)的消化吸收；NCG則通過提高腸道脂肪酶活性促進(jìn)黃顙魚對脂類的消化吸引和代謝，從而提高黃顙魚生長性能。

Arg的代謝主要有2個途徑，分別是精氨酸酶途徑和一氧化氮合成酶途徑。精氨酸酶途徑是主要的代謝途徑，Arg在精氨酸酶的催化下生成鳥氨酸和尿素，鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶的作用下生成多胺類物質(zhì)。多胺在小腸黏膜的生長、發(fā)育、成熟以及適應(yīng)性和損傷后的修復(fù)中具有重要作用[35]。本試驗在飼料中添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚腸道精氨酸酶活性，表明NCG能夠增強(qiáng)Arg在黃顙魚體內(nèi)的代謝，促進(jìn)黃顙魚腸道黏膜生長和發(fā)育，NCG的作用效果優(yōu)于飼料中直接添加Arg。Arg另一條代謝途徑是通過一氧化氮合酶產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮具有維持腸道功能的作用，如調(diào)節(jié)腸道免疫功能、促進(jìn)腸道細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、改善腸道發(fā)育等[35]。本試驗發(fā)現(xiàn)飼料添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚腸道總一氧化氮合酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶活性。飼料中補(bǔ)充NCG顯著增加了湖羊和大菱鲆NOS活性[16,36]。二胺氧化酶是小腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細(xì)胞膜內(nèi)酶，其活性反映了黏膜細(xì)胞蛋白與核酸的合成和代謝[37]。本試驗中飼料添加0.025% NCG顯著提高黃顙魚腸道二胺氧化酶活性，說明NCG在促進(jìn)腸道黏膜生長方面有較好的作用效果。Na+K+-ATP酶具有產(chǎn)生維持膜電位、調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外離子成分和消化產(chǎn)物的跨上皮吸收等功能，在腸道營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運方面具有重要的作用[38]。本試驗條件下，飼料中添加NCG對黃顙魚腸道Na+K+-ATP酶活性沒有顯著影響，但添加0.48% Arg顯著提高了Na+/K+ATP酶活性。綜上可知，飼料中添加NCG可以促進(jìn)腸道黏膜生長發(fā)育和改善腸道功能，添加Arg可能有助于增強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和吸收。

溶菌酶是非常重要的抗菌物質(zhì)，可以溶解細(xì)菌的細(xì)胞壁，激活補(bǔ)體旁路和吞噬細(xì)胞活性，參與非特異性免疫防御[39]。本試驗中，飼料補(bǔ)充0.48% Arg或0.025% NCG顯著提升黃顙魚血清溶菌酶含量，NCG的作用效果優(yōu)于Arg。魚類細(xì)胞的氧化應(yīng)激是由于超氧陰離子、羥自由基等活性氧過量產(chǎn)生引起，提高谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和氧化物酶等的活性和產(chǎn)生還原型谷胱甘肽等抗氧化物質(zhì)有助于減少活性氧的產(chǎn)量[40-41]。研究發(fā)現(xiàn)，Arg和NCG均可通過促進(jìn)抗氧化酶活性及一氧化氮通路的激活來保護(hù)羔羊免受宮內(nèi)生長受限誘導(dǎo)的肝臟氧化損傷[42]。本試驗中，飼料添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚血清谷胱甘肽過氧化物酶活性和總抗氧化能力，NCG可能通過促進(jìn)體內(nèi)Arg合成，進(jìn)而增強(qiáng)了黃顙魚抗氧化能力。但是，飼料中添加0.48% Arg對黃顙魚抗氧化能力卻沒有顯著影響。本試驗條件下，氨氮應(yīng)激72 h時，飼料中添加0.48% Arg或0.025% NCG顯著降低了黃顙魚累計死亡率，0.025% NCG組黃顙魚累計死亡率顯著低于0.48% Arg組。NCG提高黃顙魚抗氨氮應(yīng)激能力的作用效果優(yōu)于Arg，這與其在提高黃顙魚免疫和抗氧化能力方面的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼料中添加0.025% NCG顯著提高了黃顙魚體增重，腸道脂肪酶、總一氧化氮合酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、精氨酸酶、二胺氧化酶活性及血清谷胱甘肽過氧化物酶活性和總抗氧化能力，而飼料中添加0.48% Arg顯著增加了黃顙魚腸道蛋白酶、Na+/K+ATP酶活性。飼料中添加0.48% Arg或0.025% NCG顯著增強(qiáng)了黃顙魚血清溶菌酶含量，降低氨氮應(yīng)激48和72 h累計死亡率。本試驗條件下，結(jié)合生長性能、腸道健康、免疫、抗氧化功能指標(biāo)綜合評價，飼料中添加NCG的作用效果優(yōu)于直接補(bǔ)充Arg。