王騰，王曉晨，呂純懿，王金鑫，徐瑞榮

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種來源于B淋巴細胞后生發(fā)中心的漿細胞單克隆增殖性腫瘤，其特點是骨髓微環(huán)境中漿細胞惡性增殖，血液、尿液中出現(xiàn)蛋白單克隆，以及靶器官功能損害。MM約占惡性腫瘤的1%，占血液系統(tǒng)腫瘤的13%。其在西方國家的發(fā)病率約5.6/10萬，發(fā)病率因國家、人種不同而有較大差異［1］。在我國尚缺乏大范圍流行病學調(diào)查資料，但有發(fā)病年輕化及發(fā)病率逐年上升的趨勢［2-3］。目前MM無法治愈，雖然蛋白酶體抑制劑（Pi）、免疫調(diào)節(jié)劑（IMiD）、單克隆抗體以及自體造血干細胞移植（ASCT）等治療方式的應(yīng)用使患者生存期得以延長［4］，但仍然面臨骨髓瘤復發(fā)及難治的問題，亟待尋找新的治療方法。嵌合型抗原受體T淋巴細胞（CAR-T）是一種發(fā)展迅速的新型細胞免疫療法，嵌合抗原受體（CAR）是一種基因修飾的跨膜蛋白，包含胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域三部分［5］，第二代CAR結(jié)構(gòu)如圖1所示。CAR-T的機制是將CAR轉(zhuǎn)染至T淋巴細胞并誘導其在細胞表面表達，使T淋巴細胞具有靶向識別抗原、殺傷腫瘤細胞的作用。相關(guān)研究肯定了分化抗原19（CD19）CAR-T在淋巴瘤、白血病等B細胞惡性腫瘤治療中的療效［6-7］。CD138、自然殺傷細胞表面活化性受體D（NKG2D）、信號淋巴細胞激活分子家族成員7（SLAMF7）、CD38、B淋巴細胞成熟抗原（BCMA）等多種CAR-T抗原的開發(fā)，以及相關(guān)臨床試驗的陸續(xù)開展，也顯示出CAR-T在MM治療中的潛力［8］。但臨床研究報道CAR-T治療過程中不良事件（AEs）及細胞因子釋放綜合征發(fā)生率較高［9］。AEs是指在疾病治療過程中出現(xiàn)的可能與使用藥物或治療相關(guān)的任何異常的實驗室指標、癥狀或一過性疾病，如發(fā)熱、惡心、轉(zhuǎn)氨酶升高、血細胞計數(shù)減少等。AEs評級≥3級即為嚴重AEs，可引起嚴重癥狀、致殘甚至致死［10］。細胞因子釋放綜合征（CRS）是CAR-T治療最常見的毒副作用，其通常是一種免疫藥物治療引發(fā)的全身炎性反應(yīng)，發(fā)病與白介素、干擾素等多種細胞因子升高有關(guān)。CRS的臨床表現(xiàn)異質(zhì)性較大，最常見的癥狀包括發(fā)熱、皮疹、低血壓、心動過速、呼吸窘迫、癲癇和器官功能衰竭等，嚴重者可致死［11-12］。CAR-T治療另一嚴重毒副作用為神經(jīng)毒性，通常表現(xiàn)中毒性腦病，伴有譫妄、精神錯亂或腦水腫，然而這些安全風險在治療中大多是可控的［13-14］。加強安全監(jiān)測管理對CAR-T在臨床廣泛應(yīng)用至關(guān)重要。

本文對已公開發(fā)表的CAR-T治療MM的臨床研究分別進行總反應(yīng)率、嚴重AEs發(fā)生率（≥3級）、CRS發(fā)生率的Meta分析，討論其療效及安全性，為CAR-T安全高效治療MM提供循證醫(yī)學證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索策略 計算機檢索PubMed、EMBase與The Cochrane Library數(shù)據(jù)庫中所有的英文文獻，檢索時限自建庫至2019年11月，以PubMed數(shù)據(jù)庫為例，采用主題詞和自由詞結(jié)合檢索（見圖2）。手工對檢索出文獻的參考文獻進行二次檢索。

圖1 第二代CAR結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic structure of second generation of CAR

圖2 PubMed數(shù)據(jù)庫檢索策略Figure 2 Search strategy of the PubMed database

1.2 文獻納入與排除標準 納入標準：（1）研究對象為明確診斷為初治或復發(fā)性難治性MM的患者；（2）CAR-T治療過程中出現(xiàn)嚴重AEs、CRS的患者；（3）研究類型為CAR-T治療MM的臨床試驗；（4）干預(yù)措施為CAR-T；（5）結(jié)局指標為總反應(yīng)率、嚴重AEs發(fā)生率以及CRS發(fā)生率，其中總反應(yīng)率為完全緩解（CR）和部分緩解（PR）患者占比之和。排除標準：（1）非英文文獻；（2）動物實驗、綜述或病例報道；（3）重復發(fā)表的研究；（4）沒有提供諸如預(yù)處理方案、嚴重AEs及CRS發(fā)生例數(shù)、CAR-T治療后療效評價等必要信息的研究；（5）納入患者＜10例的研究。

1.3 文獻篩選、資料提取與質(zhì)量評價 由兩名研究人員根據(jù)文獻納入與排除標準篩選符合要求的文獻，獨立篩選、提取數(shù)據(jù)并進行數(shù)據(jù)核對、質(zhì)量評價，若有異議，則與相關(guān)專家討論解決，缺乏的資料盡量與作者聯(lián)系予以補充。文獻篩選時首先閱讀文題和摘要，在排除明顯不相關(guān)的文獻后，進一步閱讀全文，以確定最終是否納入。提取數(shù)據(jù)的內(nèi)容包括第一作者、發(fā)表時間、樣本量、性別、中位年齡、抗原類型、共刺激分子、預(yù)處理方案、中位細胞輸注數(shù)、中位無進展生存期（PFS）、結(jié)局指標、質(zhì)量評價等信息。結(jié)局指標包括：總反應(yīng)率、CRS發(fā)生率、AEs發(fā)生率。質(zhì)量評價采用The Newcastle-Ottawa量表（NOS）評價納入研究的偏倚風險。最后整理并匯總數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)處理均使用R軟件（version 3.6.1）完成。以Log轉(zhuǎn)換法進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換并檢驗正態(tài)性后，采用I2檢驗和Q檢驗驗證文獻異質(zhì)性，當I2＜50%，且Q檢驗P＞0.1時，異質(zhì)性較低，可選用固定效應(yīng)模型，否則選用隨機效應(yīng)模型［15］。按照預(yù)處理方案、共刺激分子、CAR-T抗原類型分組進行亞組分析及Meta回歸分析，進一步探討影響CAR-T療效與安全性的因素。亞組分析與Meta回歸分析各組間異質(zhì)性大小不一，均采用隨機效應(yīng)模型進行率的合并。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索結(jié)果 經(jīng)關(guān)鍵詞檢索共獲得相關(guān)文獻871篇，初步篩選后獲得文獻44篇，閱讀全文篩選后，最終納入8篇文獻［16-23］，共191例患者。文獻篩選流程及結(jié)果見圖3，文獻基本特征及質(zhì)量評價情況見表1。

2.2 Meta分析結(jié)果

2.2.1 主要結(jié)局指標 CAR-T治療MM的總反應(yīng)率為0.88〔95%CI（0.83，0.93）〕（見圖4）；嚴重AEs發(fā)生率為0.90〔95%CI（0.83，0.98）〕（見圖5）；CRS發(fā)生率為0.92〔95%CI（0.85，1.00）〕（見圖6）。

表1 納入文獻的基本特征Table 1 Basic characteristics of included literature

圖3 文獻篩選流程圖Figure 3 The flow diagram of literature screening

圖4 CAR-T治療MM患者總反應(yīng)率的森林圖Figure 4 Forest plot of the overall response rate of MM patients treated with CAR-T

圖5 CAR-T治療MM患者嚴重不良事件發(fā)生率的森林圖Figure 5 Forest plot of the incidence of severe adverse events of MM patients treated with CAR-T

圖6 CAR-T治療MM患者細胞因子釋放綜合征發(fā)生率的森林圖Figure 6 Forest plot of the incidence of cytokine release syndrome of MM patients treated with CAR-T

2.2.2 亞組分析 采取隨機效應(yīng)模型對各影響因素分別進行Meta回歸分析，結(jié)果顯示，不同共刺激分子MM患者總反應(yīng)率、嚴重AEs發(fā)生率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同抗原類型MM患者總反應(yīng)率、嚴重AEs發(fā)生率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同共刺激分子、抗原類型MM患者CRS發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2.2.1 基于預(yù)處理方案的亞組分析 按照預(yù)處理方案的不同分為Flu+Cy、Cy、HDM+ASCT、無預(yù)處理4組進行分析，結(jié)果顯示，不同預(yù)處理方案MM患者總反應(yīng)率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.062 2）；不同預(yù)處理方案MM患者嚴重AEs發(fā)生率、CRS發(fā)生率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.013，P＜0.001）；其中，F(xiàn)lu+Cy組、Cy組、無處理組嚴重AEs發(fā)生率、CRS發(fā)生率高于HDM+ASCT組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.2.2.2 基于共刺激分子的亞組分析 按照共刺激分子分為4-1BB、CD28 兩組進行分析，結(jié)果顯示，共刺激分子4-1BB組總反應(yīng)率高于CD28組，嚴重AEs發(fā)生率低于CD28組，差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.001、0.004）；不同共刺激分子MM患者CRS發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.134，見表2）。

2.2.2.3 基于CAR-T抗原類型的亞組分析 按照CAR-T抗原類型分為 BCMA、LCAR-B38M、CD19、BCMA+CD19 4組進行分析，結(jié)果顯示：不同抗原類型MM患者總反應(yīng)率、嚴重AEs發(fā)生率、CRS發(fā)生率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.004、0.049、0.023）；其中，BCMA組總反應(yīng)率低于LCAR-B38M組、BCMA+CD19組，嚴重AEs發(fā)生率、CRS發(fā)生率高于CD19組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；LCAR-B38M組、BCMA+CD19組嚴重AEs發(fā)生率、CRS發(fā)生率高于CD19組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。亞組分析的異質(zhì)性見表3。

2.3 發(fā)表偏倚 應(yīng)用Egger's法檢測文獻的發(fā)表偏倚，結(jié)果顯示，各Meta分析間均存在一定的發(fā)表偏倚。為探討發(fā)表偏倚對Meta分析結(jié)果的影響，進一步采用剪補法對結(jié)果進行檢驗，提示發(fā)表偏倚對Meta分析結(jié)果影響不顯著，不會對結(jié)論產(chǎn)生嚴重干擾（見表4）。

表3 亞組分析的異質(zhì)性Table 3 The heterogeneity test of subgroup analyses

表2 亞組分析結(jié)果Table 2 Results of subgroup analyses

3 討論

CAR-T目前已經(jīng)發(fā)展到第四代，第一代CAR由單鏈可變抗體片段、CD8跨膜結(jié)構(gòu)域、CD3ζ胞內(nèi)激活域構(gòu)成，第二代CAR在上代基礎(chǔ)上增加了胞內(nèi)共刺激分子，第三代CAR有多種共刺激分子，第四代CAR可釋放如白介素12（IL-12）等轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，從而增強腫瘤殺傷作用［24-26］，本文納入的研究均采用了第二代CAR設(shè)計。CAR-T在MM治療中潛力巨大，但據(jù)報道患者在治療過程中的嚴重AEs與CRS發(fā)生率高，可有發(fā)熱、神經(jīng)毒性、全血細胞減少、器官衰竭等毒副作用，安全問題在CAR-T治療MM中不容忽視［27］。

本文納入8個單臂臨床試驗，共191例患者。Meta分析結(jié)果顯示，CAR-T治療MM總反應(yīng)率達88%，具有較好的臨床療效。CAR-T治療MM嚴重AEs發(fā)生率和CRS發(fā)生率分別為90%與92%。療效方面，共刺激分子與CAR-T抗原類型是主要影響因素；預(yù)處理方案、共刺激分子、CAR-T抗原類型均明顯影響嚴重AEs發(fā)生，對CRS發(fā)生影響較小。預(yù)處理方案為Flu+Cy一組療效稍好，但安全風險較高；共刺激分子為4-1BB組療效與安全性優(yōu)于CD28組；CAR-T抗原類型為LCAR-B38M組療效與安全性優(yōu)于BCMA組。

共刺激分子可協(xié)同T淋巴細胞活化與增殖分化從而發(fā)揮免疫作用，CD28共刺激分子能產(chǎn)生強刺激信號，可迅速誘導T淋巴細胞活化，并分化出效應(yīng)記憶表型；而4-1BB誘導活化T淋巴細胞過程相對緩慢且刺激強度更低，可分化產(chǎn)生大量效應(yīng)T淋巴細胞與中樞記憶T淋巴細胞［28］。CD28對T淋巴細胞產(chǎn)生過度刺激，可能增加CRS的發(fā)生率，并使T淋巴細胞衰竭加快，體內(nèi)擴增減少，降低抗腫瘤效應(yīng)［29］。此外，BRUDN等［21］研究發(fā)現(xiàn)CAR-T在體內(nèi)的擴增量大時治療反應(yīng)相對較好。上述可能為共刺激分子4-1BB組在療效與安全性方面優(yōu)于CD28組的原因。

表4 發(fā)表偏倚檢驗與剪補法檢驗結(jié)果Table 4 The results of publication bias test and trim-and-fill test

BCMA又名TNF配體超家族成員17，在MM細胞系中選擇性表達，并在MM惡性B淋巴細胞增殖分化中發(fā)揮重要作用，是理想的抗原靶點［30］。但MM表型異質(zhì)性大，同一患者體內(nèi)可能存在多種亞克隆表型，易逃逸單一抗原治療［31］，LCARB38M是一種雙BCMA表位的CAR-T細胞，與單BCMA表位CAR-T（如bb2121）相比，LCAR-B38M與靶點親和力更高，單位劑量的療效更強，或可減少單一抗原的免疫逃逸機制［17］。YAN等［16］研究發(fā)現(xiàn)CD19+BCMA多抗原CAR在MM治療中表現(xiàn)出較好的療效，但其確切效果仍需后續(xù)驗證。此外，在按CAR-T輸注劑量遞增分組的單表位BCMA的研究中，輸注劑量與療效呈正相關(guān)，同時高劑量CAR-T輸注提高了免疫原性，使安全風險相應(yīng)增加［19，21］。在應(yīng)用雙表位LCAR-B38M的研究中，未設(shè)計劑量遞增分組，細胞輸注平均劑量雖遠低于前者，但療效與安全性較前者更佳［17，20］。低輸注劑量很可能降低了LCAR-B38M組安全風險，因納入研究設(shè)計不均一，細胞輸注劑量差異對不同靶點CAR-T的療效與安全性影響尚待更多臨床試驗驗證。

CRS與AEs發(fā)生除與CAR-T輸注劑量相關(guān)外，研究表明，其與血清IL-6、C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等免疫因子水平升高也密切相關(guān)，臨床常應(yīng)用預(yù)防性治療及類固醇激素與抗IL-6受體單克隆抗體（Tocilizumab，托珠單抗）免疫抑制治療［11-12］。另外，BRUDNO等［21］研究提示高腫瘤負荷會導致患者CRS發(fā)生概率增加，GARFALL等［18］研究發(fā)現(xiàn)提前接受ASCT可減少CAR-T輸注后自身免疫反應(yīng)，同時降低腫瘤負荷，對控制CRS與AEs發(fā)生有積極意義。

本研究局限性：（1）CAR-T作為一種新興療法，缺少大樣本、多中心、隨機對照試驗，同時所納入文獻質(zhì)量一般，可能會影響結(jié)果的客觀性；（2）所納入研究之間疾病分型、分期、腫瘤負荷等因素不甚相同，無法進行定量分析；（3）本文所納入的研究結(jié)果均為陽性，不排除有未公開發(fā)表的陰性試驗結(jié)果；（4）納入的部分研究未報道長期隨訪數(shù)據(jù)，生存資料不全，無法統(tǒng)一進行生存分析。

綜上所述，CAR-T作為一種具有巨大潛力的新型免疫治療策略，在MM治療中的療效顯著，但是安全性有待進一步提高。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理方案、共刺激分子類型、CAR-T抗原類型均是影響其療效及安全性的因素。改進CAR結(jié)構(gòu)、制備多靶點CAR-T、增加CAR-T共刺激分子、增加CAR-T細胞體內(nèi)擴增數(shù)和持久性、優(yōu)化預(yù)處理方案，將成為CAR-T治療MM的進一步研究內(nèi)容。相信隨著研究深入，CAR-T治療MM的療效將更加可靠，毒副作用的發(fā)生也更加可防可控。

作者貢獻:王騰、徐瑞榮進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析；王騰、王曉晨、呂純懿進行數(shù)據(jù)收集；王曉晨、呂純懿、王金鑫進行數(shù)據(jù)整理；王騰、王金鑫進行統(tǒng)計學處理；王騰、王曉晨進行結(jié)果的分析與解釋；王騰撰寫論文；王騰、呂純懿進行論文的修訂；徐瑞榮對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。