凌夢鈺，楊一卓，劉帥，葉超群

1.安徽醫(yī)科大學(xué)空軍臨床學(xué)院，北京市 100142；2.空軍特色醫(yī)學(xué)中心康復(fù)科，北京市 100142

卒中后認知障礙是腦卒中后的常見并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為記憶力、注意力、定向力和執(zhí)行功能等方面障礙[1]，83%的腦卒中患者存在至少1 個認知領(lǐng)域功能減退[2]，對患者恢復(fù)具有消極影響，嚴重影響患者的生活質(zhì)量、社交和工作，縮短生存時間，給家庭和社會帶來較大的經(jīng)濟負擔(dān)[3]。

卒中后認知障礙的康復(fù)主要包括認知干預(yù)、運動訓(xùn)練、非侵入性腦刺激、高壓氧以及藥物治療[2,4-5]。運動作為一種簡單可及且低成本的治療方法，能有效改善卒中后認知障礙患者的認知功能[6]。目前對運動改善卒中后認知障礙的分子機制研究主要集中于海馬，然而最新腦網(wǎng)絡(luò)交互研究發(fā)現(xiàn)[7]，額頂控制網(wǎng)絡(luò)在認知控制中處于中心地位，主要涉及前額皮質(zhì)、頂葉皮質(zhì)和前扣帶回，前額皮質(zhì)-海馬功能連接性下降與空間學(xué)習(xí)記憶表現(xiàn)下降呈正相關(guān)。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，認知相關(guān)因子（如SynapsinI等）除了在海馬表達，也在前額皮質(zhì)高度表達。此外，Li等[8]和周娜等[9]均發(fā)現(xiàn)，中等強度跑臺運動對認知功能的改善作用最為顯著，且無明顯不良反應(yīng)。本研究采用大鼠大腦中動脈栓塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfused,MCAO/R）模型[10]，對其進行中等強度運動訓(xùn)練，分別使用行為學(xué)、組織學(xué)和免疫化學(xué)方法，觀察運動訓(xùn)練對MCAO/R 大鼠認知功能和前額皮質(zhì)內(nèi)NeuN和SynapsinI表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康清潔級雄性Sprague-Dawley 大鼠40 只，6 周齡，體質(zhì)量（190±10）g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。實驗方案經(jīng)北京空軍特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會審批〔No.空特（科研）第2021-02-PJ01〕。所有大鼠術(shù)前適應(yīng)環(huán)境1周，自由獲取食物和水，12 h 光暗循環(huán)，溫度22～25 ℃，濕度（50±10）%。大鼠隨機數(shù)字表法分成假手術(shù)（Sham,S）組、假手術(shù)跑臺（Sham+exercise,SE）組、模型（MCAO,M）組、MCAO+跑臺（MCAO+exercise,ME）組，每組10只。所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

1.2 主要試劑和儀器

尼龍線栓：北京西濃科技有限公司。尼氏染色液（solarbio）、重 組Anti-NeuN 抗 體（bioss）、重 組Anti-Synapsin I抗體：ABCAM 公司。FITC 標記山羊抗兔IgG 抗體：中杉金橋公司。體視顯微鏡：OLYMPUS公司。KW-PT小動物跑步機：卡爾文生物科技有限公司。曠場實驗視頻分析系統(tǒng)：眾實迪創(chuàng)公司。新物體識別實驗箱、冰凍切片機：LEICA 公司。SynapsinIELISA試劑盒：瑞格博公司。

1.3 模型制備

使用線栓法制備MCAO 模型[11]。大鼠麻醉后固定于操作臺上，沿頸正中線剪開皮膚，暴露左側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動脈，在遠心端結(jié)扎頸總動脈，動脈夾暫時夾閉頸內(nèi)動脈。于頸外動脈近心端做一“V”形切口，緩慢插入線栓，松開動脈夾，將線栓推入頸內(nèi)動脈，至頸內(nèi)動脈分叉處遠端約18 mm 停止進栓，固定線栓。將線栓多余部分減去，縫合表皮，酒精消毒。大鼠尾部標記編號，置37 ℃保溫箱中。1 h 后，大鼠麻醉后拆線，緩慢拔出線栓，逐層縫合，創(chuàng)面消毒，腹腔注射生理鹽水3 ml，放回保溫箱中。

假手術(shù)僅分離頸外動脈和迷走神經(jīng)。

術(shù)后大鼠自由進食、進水。

1.4 運動干預(yù)

術(shù)后24 h，各跑臺組適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，隨后正式訓(xùn)練14 d。在跑步過程中，使用光聲或電刺激。具體運動方案見表1[8,11-12]。

表1 跑臺組大鼠術(shù)后運動訓(xùn)練方案

M 組和S 組在跑步機上接受相同的刺激，時間相同，但處于靜止狀態(tài)。

1.5 一般情況

1.5.1 神經(jīng)功能

于術(shù)后24 h 按Longa 評分[11]對大鼠神經(jīng)功能損傷進行評定，評分1～3 分的大鼠納入實驗。之后在第3、7、10、14、17 天進行評分。該評定由兩位熟悉評分標準的實驗人員獨立進行評價，取二者評分平均值。

1.5.2 體質(zhì)量

在手術(shù)前，手術(shù)后第3、7、10、14、17天分別稱量大鼠體質(zhì)量。待大鼠處于靜止、四肢著地狀態(tài)時讀取數(shù)據(jù)，每次測量3次，取平均值。

1.6 行為學(xué)評定

1.6.1 曠場實驗[13-14]

分別于運動干預(yù)前、后進行。曠場為100×100×40 cm 的空曠場地，四周及底部均為黑色，且底部被劃分為面積相等的25 個網(wǎng)格，中間9 個被定義為中央?yún)^(qū)域。將大鼠置于曠場正中間，讓其自由探索5 min，使用攝像機記錄探索過程，使用WebLab 軟件分析，記錄活躍度、穿格次數(shù)、中央?yún)^(qū)域停留時間和運動總距離。室內(nèi)保持黑暗、安靜，每只大鼠測試后清潔糞便及尿液，并用70%乙醇清洗，避免氣味干擾。

1.6.2 新物體識別實驗

參照文獻[14-15]描述的方法進行。每只大鼠測試后清潔糞便及尿液，并用70%乙醇清洗，避免氣味干擾。

適應(yīng)期將大鼠放入新物體識別箱中（同曠場實驗箱），讓其自由探索10 min。適應(yīng)期結(jié)束2 h 后進行物體識別訓(xùn)練：將兩個完全相同的瓶子放在箱子對角線位置，瓶子距箱體邊緣距離相等，大鼠從兩物體中間放入，自由探索5 min，探索時間為大鼠鼻尖在物體周圍1 cm內(nèi)指向物體或接觸到物體的總時間。第二階段結(jié)束24 h 后，將其中一個瓶子替換為大小相似、形狀顏色不同的新物體，兩物體位置不變，將大鼠從兩物體中間放入，讓其自由探索5 min。使用攝像機跟蹤記錄，使用WebLab 軟件分析每只大鼠探索新物體的時間（t1）和舊物體的時間（t2）、探索物體的總時間和運動距離。計算認知指數(shù)（cognitive index,CI）。

1.7 取材

行為學(xué)實驗后，大鼠3%戊巴比妥鈉3 ml/kg 深麻醉，眼眶取血，用于ELISA 檢測。用冷的生理鹽水心臟灌注，迅速取左側(cè)腦組織，分離部分前額皮質(zhì)，液氮保存，用于免疫熒光染色；剩余部分10%多聚甲醛固定，用于尼氏染色。

1.8 組織學(xué)和免疫化學(xué)方法

1.8.1 尼氏染色

將固定的腦組織乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。石蠟切片脫蠟，尼氏染色液染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察神經(jīng)細胞及尼氏小體形態(tài)、數(shù)量和排列情況，400 倍鏡下隨機選取5 個視野，使用Image Pro Plus 6.0軟件計數(shù)尼氏體數(shù)量，取平均值。

1.8.2 免疫熒光染色

冰凍的腦組織切片，厚6 μm，4 ℃復(fù)溫20 min，0.1 mol/L PBS 清洗3 次。TritonX-100 室溫孵育20 min，加山羊血清封閉30 min，甩干多余液體，加入適量兔抗鼠NeuN 抗體、兔抗鼠Synapsin I抗體（1∶200），4 ℃下孵育過夜。切片37 ℃復(fù)溫1 h，傾倒一抗，并用0.1 mol/L PBS 清洗3 次。吸干PBS 液，避光條件下加入相應(yīng)二抗（1∶40），37 ℃孵育30 min，PBS洗3 次。用BX51 熒光顯微鏡觀察并拍片，400 倍鏡下對5個非重疊場使用Image Pro Plus 6.0軟件計數(shù)NeuN和SynapsinI陽性細胞。

1.8.3 ELISA

配制洗液500 ml（25× PBS 20 ml，純水480 ml），按說明書要求加樣，每個孔均做復(fù)孔。使用酶標儀在450 nm 波長下測定光密度（optical density,OD），通過標準曲線計算血清SynapsinI濃度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以()表示。多組組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；對于同組不同時間段數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量方差分析。兩變量間相關(guān)性分析，若符合正態(tài)分布采用Pearson 分析，若不符合則采用Spearman 分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

術(shù)后，模型組左側(cè)眼裂變小，右側(cè)肢體活動不利，Longa評分平均1.84，提示造模成功，ME組和M組間Longa評分無顯著性差異（P＞0.05）。術(shù)后3 d，模型組Longa 評分增高，隨后呈下降趨勢。造模后第7天，ME組Longa評分低于M組（P＜0.05）。見表2。

表2 術(shù)后各組各時間點Longa評分

造模前，各組大鼠間體質(zhì)量無顯著性差異（P＞0.05）。造模后，M 組出現(xiàn)進食困難、精神不佳，體質(zhì)量較S 組下降（P＜0.05）。經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布（P＞0.05）。在干預(yù)期間，組間差異顯著（F=16.908，P＜0.001），跑臺訓(xùn)練第7 天，ME組體質(zhì)量較M組顯著提高（P＜0.001）。見表3。

表3 各組各時間點體質(zhì)量變化（g）

2.2 行為學(xué)觀察

2.2.1 曠場實驗

造模后，M 組中央?yún)^(qū)域活動時間和活動總距離較S 組降低（P＜0.05），各模型組間無顯著性差異（P＞0.05）。訓(xùn)練后，M 組活躍度、中央?yún)^(qū)域活動時間、穿格次數(shù)和活動總距離較S 組減少（P＜0.05），ME 組活躍度、中央?yún)^(qū)域活動時間、穿格次數(shù)和活動總距離均較M 組提高（P＜0.05），SE 組活躍度和中央?yún)^(qū)域活動時間較S組增加（P＜0.05）。見圖1、表4～表5。

圖1 各組曠場實驗軌跡圖

表4 運動訓(xùn)練前各組曠場實驗結(jié)果

2.2.2 新物體識別實驗

M 組CI較S 組降低（P＜0.05），ME 組CI和行動總距離均較M 組增加（P＜0.05），SE 組活動總距離較S組增加（P＜0.05）。見圖2、表6。

表6 各組新物體識別實驗結(jié)果

圖2 新物體識別實驗中各組大鼠的軌跡圖（左上方為新物體，右下方為舊物體）

2.3 尼氏染色

S組腦組織前額皮質(zhì)尼氏體數(shù)量較多，排列整齊，大小和形態(tài)正常；M 組尼氏體數(shù)量減少，排列紊亂，胞體萎縮，核固縮；與M 組相比，ME 組尼氏體增多（P＜0.05），細胞結(jié)構(gòu)介于S 組和M 組之間，排列稍不規(guī)則。SE 組尼氏體密度也較S 組有所增加（P＜0.05）。見圖3、表7。

表7 尼氏體計數(shù)結(jié)果(個/高倍鏡視野)

圖3 各組前額皮質(zhì)尼氏染色

2.4 免疫熒光染色

與S 組相比，M 組NeuN 陽性細胞數(shù)降低（P＜0.05），ME 組NeuN 陽性細胞數(shù)高于M 組（P＜0.05），SE 組陽性細胞數(shù)高于S 組（P＜0.05）。M 組SynapsinI陽性細胞數(shù)較S 組降低（P＜0.05），ME 組SynapsinI陽性細胞數(shù)較M組增多（P＜0.05）。見圖4、表8。

表8 免疫熒光染色計數(shù)結(jié)果(個/高倍鏡視野)

圖4 各組前額皮質(zhì)部NeuN、SynapsinI陽性表達（免疫熒光染色，×200）

2.5 ELISA

M 組血清SynapsinI濃度低于S 組（P＜0.05），ME組血清SynapsinI含量高于M組（P＜0.05）。見表9。

表9 ELISA試驗結(jié)果（ng/L）

2.6 模型組認知功能相關(guān)指標與NeuN、SynapsinI之間的相關(guān)性

將曠場實驗中活躍度、穿格次數(shù)、總距離、中央?yún)^(qū)域時間以及新物體識別實驗中CI作為集合1，將尼氏體計數(shù)、免疫熒光染色中NeuN、SynapsinI計數(shù)和Elisa 中SynapsinI含量作為集合2，進行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，集合1 與集合2 之間顯著相關(guān)性（r=0.977,P＜0.001）。各指標間相關(guān)性見表10。

表10 認知功能相關(guān)指標與NeuN、SynapsinI之間的相關(guān)性（r）

3 討論

近年來，運動療法在心腦血管病治療中的作用受到越來越多的關(guān)注。腦缺血再灌注會導(dǎo)致認知功能下降，可能與腦水腫、白質(zhì)彌漫性改變、神經(jīng)元丟失[14]、氧化應(yīng)激和炎癥因子增加有關(guān)[16]。Mankhong等[17]發(fā)現(xiàn)，有氧運動能改善MCAO/R 大鼠的運動、平衡和記憶功能，促進tau乙酰化的抑制作用。Li等[8]也發(fā)現(xiàn)，運動能顯著減少梗死體積、細胞凋亡及神經(jīng)功能損傷，促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）/TrkB/CREB 蛋白通路表達。早期運動干預(yù)可減少大腦損傷程度，降低卒中后認知障礙發(fā)生率[18]；中等強度運動訓(xùn)練可以改善腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能[9]，其機制涉及減少自由基損傷及細胞凋亡，促進海馬神經(jīng)發(fā)生、血管生成和突觸可塑性的改善[19]。

頂葉與邏輯思維有關(guān)，海馬是負責(zé)空間記憶的主要腦區(qū)[20]，額葉皮質(zhì)主要參與識別記憶、執(zhí)行等認知功能[14,21]?，F(xiàn)有對認知功能的研究主要集中于海馬。Zheng 等[22]發(fā)現(xiàn)，電針能逆轉(zhuǎn)再灌注引起的BDNF、酪氨酸激酶B、γ-氨基丁酸A 型受體、NeuN 等在海馬和前額皮質(zhì)內(nèi)的表達減少，改善大鼠空間記憶和認知記憶。高尿酸血癥引起的認知障礙與皮質(zhì)和海馬氧化應(yīng)激、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)化以及細胞膜功能紊亂有關(guān)[23]。Hillman 等[24]發(fā)現(xiàn)前額皮質(zhì)梗死模型小鼠認知功能損傷，前額皮質(zhì)-海馬在θ 和β 波段的振蕩通訊改變分別與空間記憶和開闊視野任務(wù)的表現(xiàn)相關(guān)，然而其具體的分子機制仍不清楚。成人神經(jīng)發(fā)生主要位于海馬和腦室下區(qū)，其余腦區(qū)新生神經(jīng)元通常來源于腦室下區(qū)神經(jīng)遷移；最新研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中和神經(jīng)退行性疾病可能誘導(dǎo)下丘腦、皮質(zhì)、紋狀體的神經(jīng)發(fā)生[25]。本研究顯示，運動能促進MCAO/R大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)，誘導(dǎo)前額皮質(zhì)中NeuN、SynapsinI表達增加，且兩者呈正相關(guān)。

曠場實驗可以反映大鼠認知功能、活動能力以及焦慮狀態(tài)[14]。一般情況下，大鼠在未知的空間內(nèi)傾向于待在墻壁附近，較少進入中間區(qū)域，中央?yún)^(qū)域的活動時間減少反映大鼠處于焦慮狀態(tài)。新物體識別實驗利用動物的新奇偏好，與熟悉的物體相比，更傾向于接觸新物體，這個功能由前額葉皮質(zhì)支配[14]，CI越高，說明大鼠記憶力及探索能力越強[14]。本研究顯示，MCAO/R 大鼠認知功能和活動能力下降，探索興趣降低，而運動訓(xùn)練能逆轉(zhuǎn)這些改變。我們還發(fā)現(xiàn)，運動訓(xùn)練對正常大鼠的認知功能也有促進作用，與周娜等[9]的研究結(jié)果一致。

神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性被認為是認知功能改善的基礎(chǔ)，記憶功能恢復(fù)依賴于皮質(zhì)神經(jīng)元的活動，以及軸突髓鞘的形成[26]。

尼氏體是神經(jīng)元胞體或樹突內(nèi)的嗜堿性團塊和顆粒，能合成更新細胞器所需的結(jié)構(gòu)蛋白、合成神經(jīng)遞質(zhì)所需的酶及神經(jīng)調(diào)質(zhì)，可作為神經(jīng)元功能狀態(tài)的標志。NeuN 是一種特異性核蛋白，在腦椎體神經(jīng)元和顆粒性神經(jīng)元表達[27]，能特異性與神經(jīng)元細胞核的抗原結(jié)合，是一種良好的成熟神經(jīng)元標記物。Choi 等[28]發(fā)現(xiàn)，運動能增加雙側(cè)頸總動脈栓塞大鼠海馬組織神經(jīng)元數(shù)量，通過增強神經(jīng)發(fā)生和增加BDNF 表達延緩認知功能下降。本研究顯示，MCAO/R 大鼠神經(jīng)功能受損，尼氏體和NeuN 數(shù)量下降；運動訓(xùn)練能增加前額皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量，改善其功能。

突觸是信息傳遞的關(guān)鍵部位，是神經(jīng)可塑性最敏感的部位，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷時，會產(chǎn)生新的突觸，以維持神經(jīng)功能的相對穩(wěn)定，即突觸可塑性[27]。SynapsinI是一種突觸相關(guān)蛋白，參與突觸囊泡在突觸末端的聚集、釋放和融合[29]，與突觸的形成、成熟和可塑性密切相關(guān)[29]，被證明是BDNF 介導(dǎo)軸突生長的下游分子[29]。BDNF 已被證明是一種與認知功能密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，在突觸可塑性、血管生成和突觸間神經(jīng)遞質(zhì)釋放等方面起著關(guān)鍵作用[30]。Yeh 等[31]發(fā)現(xiàn)，運動可以促進腦缺血性損傷后神經(jīng)元活動和突觸可塑性，改善認知功能。與本研究結(jié)果一致。

Synapsin I通過何種通路影響神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性，外源性補充或敲除SynapsinI會對認知功能有何影響有待進一步研究；前額皮質(zhì)新生神經(jīng)元來源也有待進一步研究。

綜上所述，缺血再灌注會導(dǎo)致大鼠認知功能損傷，其機制可能與誘導(dǎo)前額皮質(zhì)中SynapsinI表達下調(diào)，減少神經(jīng)細胞數(shù)量，抑制突觸可塑性有關(guān)。運動訓(xùn)練可以促進NeuN 和SynapsinI的表達，誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性增強，從而改善大鼠認知功能，提高其活動能力。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。