黃子宸 鄭樂婷 李 晞 劉秀華 雷 玲 文 靜 徐涓涓 趙 鋮

(1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科，南寧市 530021，電子郵箱；mh1990.pink@163.com；2 南京醫(yī)科大學附屬逸夫醫(yī)院風濕免疫科，江蘇省南京市 210000；3 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床檢驗中心，南寧市 530021；4 廣西柳州市工人醫(yī)院風濕免疫科，柳州市 545000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種慢性進行性、反復發(fā)作的自身免疫性疾病,其特征為多系統(tǒng)炎癥及可產(chǎn)生大量自身免疫性抗體。SLE的發(fā)生和發(fā)展與多種因素相關(guān)，包括遺傳、種族、免疫、激素、環(huán)境因素[1-2]。SLE 好發(fā)于青年女性，發(fā)病高峰為15～40歲，男女發(fā)病比例為1 ∶9至1 ∶10[3-5]。雖然女性SLE的發(fā)病率比男性高，但是男性SLE病情比女性嚴重[4-8]。本文采用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技術(shù)，比較初治活動期男女性SLE患者與相應的健康人血漿標本中的差異蛋白表達譜，以了解男女性 SLE患者的人體蛋白質(zhì)組表達差異，為男女性SLE發(fā)病差異的研究提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科2017年7～10月間病房及門診收治的16例SLE活動期初治患者，其中男性8例，年齡為19～49(29±11.5)歲，女性8例，年齡25～51(35±8.6)歲。入組標準：診斷均符合1997年修訂的美國風濕學會SLE分類標準[9]，由兩名副主任以上職稱的專科醫(yī)師確診。排除標準：妊娠、分娩或哺乳期女性，合并癌癥、肝炎、結(jié)核、過敏、嚴重感染、近期有手術(shù)創(chuàng)傷及其他自身免疫性疾病者。同期選取與入組患者的年齡性別匹配的16例體檢者，排除標準：妊娠、分娩或哺乳期女性，合并癌癥、肝炎、結(jié)核、過敏、嚴重感染、近期有手術(shù)創(chuàng)傷及其他自身免疫性疾病者。其中男性8例，年齡為29～44(33.6±6)歲，女性8例，年齡28～43(33.4±4.8)歲。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 實驗儀器和試劑 Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色譜系統(tǒng)購自Agilent Technologies公司，Q Exactive Plus質(zhì)譜儀、Multiskcan FC酶標儀、Easy nLC色譜系統(tǒng)、NanoDrop 2000微量紫外分光光度計均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。iTRAQ Reagent-4/8plex Multiplex Kit(批號：4390812)購自AB SCIEX公司，Multiple Affinity Removal LC Column-Human 14(批號：Hu14)購自Agilent Technologies公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集：采集外周靜脈血2 mL，6 h內(nèi)分離血漿，在-80℃下保存待測。共分為4組進行實驗，包括SLE女性組、SLE男性組、健康女性組、健康男性組，各組各自將組內(nèi)8例研究對象的血漿進行混合。

1.3.2 樣品去血漿高豐度處理：取適量樣本，采用人類的去血漿高豐度親和色譜柱Agilent Multiple Affinity Removal LC Column-Human 14，按照說明書中的操作方法去除高豐度蛋白質(zhì)，得到低豐度組分溶液。應用10 kD超濾管進行超濾濃縮，加入低豐度組分溶液的一倍體積的SDT裂解液，沸水浴15 min，8.36×107r/min離心15 min，取上清。采用二喹啉甲酸法進行蛋白質(zhì)定量。分裝樣品，于-80℃下保存。

1.3.3 電泳：取蛋白質(zhì)20 μg，加入5×上樣緩沖液4 μL，沸水浴5 min，進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(恒壓250 V，40 min)，考馬斯亮藍染色。

1.3.4 FASP酶解：各樣品取30 μL蛋白質(zhì)溶液，分別加入DTT至終濃度為100 mmol/L，沸水浴5 min，冷卻至室溫。加入200 μL UA緩沖液(為8 mol/L尿素+150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)混勻，轉(zhuǎn)入30 kD超濾離心管中，8.36×107r/min離心15 min，棄濾液(重復該步驟1次)。加入100 μL碘乙酰胺緩沖液(100 mmol/L碘乙酰胺加入UA緩沖液中)，振蕩，室溫避光反應30 min，8.36×107r/min離心15 min。加入100 μL UA緩沖液后離心(8.36×107r/min，15 min)，重復2次。加入100 μL 稀釋10倍的Dissolution buffer，8.36×107r/min離心15 min，重復2次。加入40 μL Trypsin緩沖液(4 μg Trypsin加入40 μL Dissolution buffer)，振蕩后37℃放置16～18 h。換新收集管，8.36×107r/min離心 15 min；再加入40 μL稀釋10倍的Dissolution buffer，8.36×107r/min離心15 min，收集濾液。使用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計進行肽段定量。

1.3.4 iTRAQ標記：各樣品分別取100 μg肽段，按照iTRAQ Reagent-4/8plex Multiplex Kit說明書的操作步驟進行標記。

1.3.5 高效液相色譜分級：將每組標記后的肽段混合，采用Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色譜系統(tǒng)進行高效液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)分級。緩沖液A液由10 mmol/L甲酸銨、5% ACN組成,pH為10.0；B液由10 mmol/L甲酸銨、85% ACN組成,pH為10.0。色譜柱以A液平衡，樣品由手動進樣器上樣到色譜柱進行分離，流速為1 mL/min。液相梯度為：0～25 min，B液為0%； 25～30 min，B液線性梯度從0%到7%；30～65 min，B液線性梯度從7%到40%；65～70 min，B液線性梯度從40%到100%；70～85 min，B液維持在100%。洗脫過程中監(jiān)測214 nm處的吸光度值，每隔1 min收集洗脫組分，共計收集洗脫組分約36份,凍干保存。

1.3.6 質(zhì)譜分析：每份樣品采用納升流速Easy-nLC色譜系統(tǒng)進行分離。樣品經(jīng)色譜分離后用Q Exactive Plus 質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析，檢測方式為正離子，母離子掃描范圍350 ～1800 m/z，一級質(zhì)譜分辨率為70 000，AGC Target為3e6，一級Maximum IT為50 ms。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集，即每次全掃描(Full Scan)后采集10個碎片圖譜(MS2 scan)，MS2 Activation Type為HCD，Isolation Window為2 m/z，二級質(zhì)譜分辨率17 500，Microscan為1，二級Maximum IT為45 ms，Normalized Collision Energy為30 eV。

1.4 質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)處理 使用Proteome Discoverer 2.1(Thermo Fisher Scientific公司)軟件將Q Exactive Plus產(chǎn)生的原始圖譜文件(RAW文件)轉(zhuǎn)化為.mgf文件，通過軟件內(nèi)置的工具提交到MASCOT 2.5服務器進行數(shù)據(jù)庫檢索，數(shù)據(jù)庫選擇UniProt(http://www.uniprot.org，下載時間為2019年8月1日)。然后再通過Proteome Discoverer 2.1將MASCOT服務器上形成的查庫文件(DAT文件)傳回軟件，根據(jù)FDR<0.01的標準對數(shù)據(jù)進行篩選鑒定，獲得高度可信的定性結(jié)果。以FC>1.2且P值<0.05作為標準篩選差異表達蛋白，其中FC為表達倍數(shù)。

1.5 生物信息分析

1.5.1 功能注釋：利用Blast2GO(數(shù)據(jù)庫版本：go_201504.obo；下載地址：www.geneontology.org)對差異表達蛋白集合進行基因本體論(Gene Ontology，GO)注釋，注釋的過程包括序列比對、GO條目提取、GO注釋和補充注釋4個步驟。

1.5.2 通路注釋：在京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫中(https://www.kegg.jp/)對差異表達蛋白集合進行KEGG通路注釋，先利用KAAS軟件，比對KEGG GENES數(shù)據(jù)庫，然后將差異表達蛋白序列進行KO歸類，并根據(jù)KO歸類自動獲取目標蛋白質(zhì)序列參與的通路信息。

1.5.3 GO注釋與KEGG注釋的富集分析：在對差異表達蛋白集合進行GO功能注釋或KEGG通路注釋的富集分析時，采用Fisher精確概率法，比較各個GO條目或KEGG通路在目標蛋白質(zhì)集合和總體蛋白質(zhì)集合中的分布情況，評價某個GO條目或KEGG通路蛋白質(zhì)富集度的顯著性水平，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)檢結(jié)果 電泳結(jié)果顯示蛋白質(zhì)質(zhì)量好，總量足夠，各組樣本分離情況佳且基本相同(見圖1)；色譜-質(zhì)譜分析中，蛋白預質(zhì)譜顯示酶解正常，色譜-質(zhì)譜行為正常(見圖2)，可進行下一步實驗。

圖1 4組樣本SDS-PAGE電泳圖

圖2 色譜-質(zhì)譜分析的Basepeak圖譜

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果 共得到圖譜258 041張，通過MASCOT進行分析后，匹配得到圖譜數(shù)量共55 831張，鑒定出1 283個蛋白共18 126個肽段，其中含10 577個唯一性肽段。

2.3 差異表達蛋白篩選結(jié)果 SLE女性組與SLE男性組共存在277個差異表達蛋白，其中，與SLE男性組相比，SLE女性組表達上調(diào)蛋白193個，表達下調(diào)蛋白84個；SLE女性組與健康女性組共存在242個差異表達蛋白，其中，與健康女性組相比，SLE女性組表達上調(diào)蛋白181個，表達下調(diào)蛋白61個；SLE男性組與健康男性組共存在214個差異表達蛋白，其中，與健康男性組相比，SLE男性組表達上調(diào)蛋白114個，表達下調(diào)蛋白100個。女性SLE組/健康女性組、男性SLE組/健康男性之間共有26個相同的差異表達蛋白，包括表達上調(diào)蛋白14個，表達下調(diào)蛋白12個。差異倍數(shù)由大到小排名前20蛋白見表1及表2。SLE女性/SLE男性之間的差異表達蛋白中，共有193個蛋白涉及免疫系統(tǒng)過程，包括主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類抗原、肌球蛋白反應性免疫球蛋白重鏈可變區(qū)、免疫球蛋白λ鏈等；SLE女性/SLE男性之間的差異表達蛋白、女性SLE/健康女性之間的差異表達蛋白同時涉及的信號通路包括類風濕關(guān)節(jié)炎、擴張性心肌病、自身免疫性甲狀腺疾病、病毒性心肌炎和哮喘等。

表1 排名前20的差異表達上調(diào)蛋白

表2 排名前20的差異表達下調(diào)蛋白

2.4 生物信息學分析結(jié)果

2.4.1 GO分析：(1)SLE女性組與SLE男性組的277種差異表達蛋白，涉及23種生物學過程、17種細胞組分和12種分子功能。其中，生物過程包括生物調(diào)節(jié)(259個差異表達蛋白)、免疫系統(tǒng)過程(193個差異表達蛋白)、生物過程調(diào)節(jié)(255個差異表達蛋白)等，分子功能主要表現(xiàn)為結(jié)合(219個差異表達蛋白)、催化活性(191個差異表達蛋白)、結(jié)構(gòu)分子活性(19個差異表達蛋白)等，細胞組分主要為細胞(256個差異表達蛋白)、膜(199個差異表達蛋白)、細胞器(265個差異表達蛋白)等，見圖3A。(2)SLE女性組與健康女性組的242種差異表達蛋白，涉及22種生物學過程、14種細胞組分和13種分子功能。其中，生物過程包括細胞過程(232個差異表達蛋白)、免疫系統(tǒng)過程(181個差異表達蛋白)、生物過程調(diào)節(jié)(228個差異表達蛋白)等，分子功能主要表現(xiàn)為催化活性(169個差異表達蛋白)、結(jié)合(186個差異表達蛋白)、轉(zhuǎn)運活性(10個差異表達蛋白)等，細胞組分主要為細胞器(200個差異表達蛋白)、細胞(218個差異表達蛋白)、膜(187個差異表達蛋白)等，見圖3B。(3)SLE男性組與健康男性組的214種差異表達蛋白，涉及24種生物學過程、18種細胞組分和11種分子功能。其中，生物過程包括免疫系統(tǒng)過程(110個差異表達蛋白)、刺激反應(169個差異表達蛋白)、細胞過程(199個差異表達蛋白)等，分子功能主要表現(xiàn)為結(jié)合(186個差異表達蛋白)、催化活性(108個差異表達蛋白)、結(jié)構(gòu)分子活性(27個差異表達蛋白)等，細胞組分主要為細胞(195個差異表達蛋白)、細胞器(199個差異表達蛋白)、細胞外區(qū)域部分(169個差異表達蛋白)等，見圖3C。SLE男性/健康男性之間的差異表達蛋白與SLE女性/健康女性之間的差異表達蛋白，在生物過程中涉及30個相同的免疫功能，包括補體活化經(jīng)典途徑、B細胞免疫、免疫球蛋白介導的體液免疫應答、適應性免疫反應、淋巴細胞免疫等。此外，SLE男性/健康男性、SLE女性/健康女性相同的差異表達蛋白共26個，均參與免疫系統(tǒng)過程。

圖3 差異蛋白GO注釋

2.3.3 KEGG通路分析：SLE女性組/SLE男性組的差異表達蛋白共涉及22條通路，包括類風濕關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性免疫缺陷及生產(chǎn)IgA的腸道免疫網(wǎng)絡等；SLE女性組/健康女性組的差異表達蛋白共涉及23條通路，包括類風濕關(guān)節(jié)炎、FcεRI信號通路及麻疹等；SLE男性組/健康男性組的差異表達蛋白共涉及7條通路，包括心肌收縮、鈣離子信號通路及過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)信號通路等。見圖4。

圖4 KEGG通路分析

3 討 論

SLE是一種典型的自身免疫性疾病，由于女性機體的免疫反應強于男性，因此女性對自身免疫性疾病的易感性高于男性[10]。女性的SLE發(fā)病率明顯高于男性，然而男性受疾病的影響更為嚴重，發(fā)生終末期腎病的風險更高[5，8]。多種因素被用于解釋這種性別引起的疾病差異，包括性染色體上基因的差異、免疫系統(tǒng)內(nèi)在的性別差異、性激素水平的差異、基因調(diào)控的性別差異、性別依賴的環(huán)境因素、雌激素受體α和β蛋白的表達、泌乳素水平及腸道微生物等[11-18]。根據(jù)性別進行分組研究，可能有助于探尋判斷不同性別SLE潛在的分子標記及干預靶點。

蛋白質(zhì)組指在特定的時間和空間內(nèi)，一種生物或者一個細胞所表達的全部蛋白質(zhì)[19]。iTRAQ技術(shù)作為一種新的蛋白質(zhì)定量技術(shù)，克服了傳統(tǒng)雙向凝膠電泳不能檢測具有極端等電點、分子量太大或太小、低豐度蛋白質(zhì)及膜蛋白質(zhì)的弊端[20-21]，其通過高通量篩選，可以同時篩查疾病中幾乎全部蛋白質(zhì)的改變，從而發(fā)現(xiàn)在致病過程中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子。因此，本研究利用iTRAQ技術(shù)分析男性和女性SLE患者血漿標本中差異蛋白的表達譜。本研究結(jié)果顯示，SLE女性/SLE男性之間的差異表達蛋白中，共有193個蛋白涉及免疫系統(tǒng)過程，而這些蛋白作為細胞內(nèi)、細胞膜及胞外的組成成分，可能通過發(fā)揮蛋白質(zhì)結(jié)合、分子功能調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄因子活化等功能來參與免疫過程。此外，SLE女性/SLE男性之間的差異表達蛋白、SLE女性/健康女性之間的差異表達蛋白同時涉及的信號通路包括類風濕關(guān)節(jié)炎、擴張性心肌病、自身免疫性甲狀腺疾病、病毒性心肌炎和哮喘等，這是否提示女性SLE患者更容易出現(xiàn)關(guān)節(jié)、心肌、甲狀腺及呼吸道等問題，還需要結(jié)合臨床進一步驗證。

SLE男性/健康男性之間的差異表達蛋白與SLE女性/健康女性之間的差異表達蛋白的差異很大，在生物過程、細胞組分、分子功能、信號通路方面均有很大不同，但在生物過程中涉及30個相同的免疫功能，包括補體活化經(jīng)典途徑、B細胞免疫、免疫球蛋白介導的體液免疫應答、適應性免疫反應、淋巴細胞免疫等。此外，SLE男性/健康男性、SLE女性/健康女性相同的差異表達蛋白共26個，均參與免疫系統(tǒng)過程，提示它們可能是男女性SLE患者免疫學過程發(fā)生和發(fā)展的共性蛋白，而其余的蛋白則可能存在著病因?qū)W特異性。與健康女性相比，SLE女性患者差異表達上調(diào)的蛋白包括免疫球蛋白G、免疫球蛋白λ鏈、免疫球蛋白κ鏈、類風濕因子等；與健康男性相比，男性患者差異表達上調(diào)的蛋白則包括肌球蛋白、肌紅蛋白、肌鈣蛋白等。由此可見，相較于SLE男性/健康男性，SLE女性/健康女性之間的免疫球蛋白G、免疫球蛋白λ鏈、免疫球蛋白κ鏈顯著增加，這提示女性SLE患者機體的體液免疫反應更為亢進；而相較于SLE女性/健康女性，SLE男性/健康男性之間的肌球蛋白、肌紅蛋白顯著增加，這提示男性SLE患者更容易出現(xiàn)肌損傷。然而，本研究篩選的很多差異表達蛋白，尚未見相關(guān)研究報告這些蛋白與SLE的相關(guān)性，需要采用酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫法或蛋白免疫印跡試驗等方法進一步實驗以驗證。

綜上所述，基于iTRAQ技術(shù)的蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，男女性SLE患者之間存在較多差異表達蛋白，這些蛋白質(zhì)涉及包括免疫過程在內(nèi)的眾多生物學過程及分子功能。但這些血漿差異表達蛋白是否能夠成為區(qū)別男女性SLE患者的特異性標志物和治療靶點，還需繼續(xù)擴大樣本量并結(jié)合其他方法進行后續(xù)研究。