朱新華，劉蓓蓓，侯靜雯，李秋影，許慧娟，張曉陽(yáng)

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院 老年病科，新疆 烏魯木齊 830000)

心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia-reperfusion，MI/R)損傷是心血管手術(shù)并發(fā)癥(如心律失常)、心肌細(xì)胞凋亡及心功能下降等發(fā)生的重要原因[1]。目前，微小RNA(microRNA，miRNA)在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]，其中miR-155在調(diào)節(jié)免疫、炎性反應(yīng)和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[3]。有研究表明，抑制miR-155的表達(dá)可減輕急性心肌梗死后的炎性反應(yīng)，并有利于減輕心室重構(gòu)[4]。因此，本研究探討抑制miR-155對(duì)心肌缺血再灌注模型心肌細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)的影響，為臨床治療心肌缺血/再灌注提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑：大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(myocardial cells of H9c2 rats)；叔丁基過(guò)氧化氫(tert-Butyl hydroperoxide，TBHP)；DMEM培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司)；miR-155抑制劑及NC抑制劑(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)；Trizol、Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，RT-qPCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；核轉(zhuǎn)錄因子p65(nuclear factor-κB p65，NF-κB p65)小鼠單克隆抗體、核轉(zhuǎn)錄因子p50(nuclear factor-κB p50，NF-κB p50)小鼠單克隆抗體、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子p65(phospho nuclear factor-κB p65，p-NF-κB p65)小鼠單克隆抗體、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子50(phospho nuclear factor-κB p50，p-NF-κB p50)小鼠單克隆抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)小鼠單克隆抗體、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)小鼠單克隆抗體、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)小鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.2 細(xì)胞處理及分組：將H9c2細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組、心肌缺血/再灌注(MI/R)組、陰性對(duì)照組、miR-155抑制劑組。TBHP用DMEM高糖培養(yǎng)基為溶劑進(jìn)行溶解并稀釋成濃度為100 μmol/L的TBHP溶液，根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]采用TBHP處理H9c2心肌細(xì)胞構(gòu)建MI/R模型：將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，800 r/min離心5 min后收集細(xì)胞。將細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的濃度按2 mL/孔接種至6孔板中，培養(yǎng)48 h。吸棄上清液，用PBS洗滌2次后，加入100 μmol/L TBHP溶液500 μL，培養(yǎng)12 h，造成缺氧；隨后換用DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行再灌注。陰性對(duì)照組：在MI/R模型建立后培養(yǎng)24 h，采用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染NC對(duì)照組(100 nmol/L)；miR-155抑制劑組：在MI/R模型建立后培養(yǎng)24 h，采用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑(100 nmol/L)。轉(zhuǎn)染后5 h更換新的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。空白對(duì)照組：細(xì)胞不做處理。

1.2 方法

1.2.1 采用RT-qPCR檢測(cè)各組心肌細(xì)胞miR-155的表達(dá)水平：取各組細(xì)胞分別加入1 mL Trizol，提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取1 μL cDNA作為模板進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。以U6為內(nèi)參，每組基因的相對(duì)表達(dá)量按公式(2-△△Ct法)計(jì)算。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR檢測(cè)各基因引物序列Table 1 Primer sequence of each gene detected by RT-qPCR

1.2.2 采用ELISA檢測(cè)IL-8、TNF-α的含量:轉(zhuǎn)染24 h后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞H9c2上清液，3 000×g離心10 min，取上清液按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)IL-8、TNF-α的含量。

1.2.3 采用流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率：各組細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于6孔板，加PBS液2 mL，2 000 r/min，離心5 min洗滌2次后，加入300 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，再加入5 μL annexin V、PI，室溫避光反應(yīng)10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB p65、NF-κB p50、p-NF-κB p65、p-NF-κB p50、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)：收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞提取總蛋白，取40 μg與上樣緩沖液混合，100 ℃加熱5 min后通過(guò)10% SDS-PAGE分離，90 V電壓轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜后加入一抗4 ℃過(guò)夜，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，用化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。以β-actin為內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 采用RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB p65、NF-κB p50、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平：詳細(xì)步驟見(jiàn)1.2.1，相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miR-155的表達(dá)水平

與空白對(duì)照組相比，MI/R組、陰性對(duì)照組、miR-155抑制劑組miR-155表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑后miR-155表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with blank control;#P<0.05 compared with MI/R group圖1 H9c2各組細(xì)胞miR-155表達(dá)水平比較Fig 1 Comparison of miR-155 expression levels in each group of H9c2 n=3)

2.2 各組心肌細(xì)胞IL-8、TNF-α的含量

與空白對(duì)照組相比，MI/R組、陰性對(duì)照組、miR-155抑制劑組的IL-8、TNF-α含量均顯著升高(P<0.05)；與MI/R組相比，miR-155抑制劑組的IL-8、TNF-α含量降低(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with blank control;#P<0.05 compared with MI/R group圖2 H9c2各組細(xì)胞IL-8、TNF-α的含量比較Fig 2 Comparison of IL-8 and TNF-α contents in each group of H9c2 n=3)

2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡水平比較

與空白對(duì)照組相比，MI/R組、陰性對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與MI/R組相比，抑制miR-155表達(dá)后，心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖3)。與空白對(duì)照組相比，MI/R組、陰性對(duì)照組Bax蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；抑制miR-155表達(dá)后，Bax蛋白和mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平均升高(均P<0.05)(圖4)。

圖3 H9c2各組心肌細(xì)胞凋亡率比較Fig 3 Comparison of cardiomyocyte apoptosis rate in each group of H9c2 cells(n=3)

A.expression of Bax and Bcl-2 mRNA;B.expression of Bax and Bcl-2 protein;*P<0.05 compared with blank control;#P<0.05 compared with MI/R group圖4 H9c2各組心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平比較Fig 4 Comparison of Bax,Bcl-2 protein and mRNA expression levels in cardiomyocytes of each group of

2.4 各組細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與空白對(duì)照組相比，MI/R組、陰性對(duì)照組NF-κB p65、NF-κB p50、p-NF-κB p65、p-NF-κB p50蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與陰性對(duì)照組相比，miR-155抑制劑組NF-κB p65、NF-κB p50、p-NF-κB p65、p-NF-κB p50蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with blank control;#P<0.05 compared with MI/R group圖5 H9c2各組細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較Fig 5 Comparison of the expression of NF-κB signaling pathway related proteins in each group of H9c2

2.5 各組細(xì)胞NF-κB p65、NF-κB p50 mRNA表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組相比，MI/R組、陰性對(duì)照組NF-κB p65、NF-κB p50 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與MI/R組相比，miR-155 抑制劑組NF-κB p65、NF-κB p50 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with blank control;#P<0.05 compared with MI/R group圖6 H9c2各組細(xì)胞NF-κB p65、NF-κB p50mRNA表達(dá)水平比較Fig 6 Comparison of mRNA expression levels of NF-κB p65 and NF-κB P50 in each group of H9c2

3 討論

缺血/再灌注損傷是由氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)Ca+超載以及凋亡和壞死發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞死亡等事件綜合所導(dǎo)致。心肌缺血/再灌注可加重心肌損傷，增加心血管疾病致殘率和致死率，其中，細(xì)胞凋亡是心肌缺血/再灌注損傷的重要過(guò)程，抑制細(xì)胞凋亡可減少心肌梗死面積[6]。此外，炎性反應(yīng)也在MI/R損傷中起著重要作用，MI/R增加炎性小體的表達(dá)，引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，增加心臟細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致MI/R損傷[7]。miRNAs被認(rèn)為是幾乎所有細(xì)胞過(guò)程的主要調(diào)節(jié)因子，研究顯示[8]，miR-24-3p可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡及腫瘤壞死因子信號(hào)途徑，從而在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮心肌保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)[9]，miR-22可以通過(guò)靶向cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)抑制心肌細(xì)胞凋亡保護(hù)大鼠免受MI/R損傷，發(fā)揮抗炎功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MI/R組心肌細(xì)胞凋亡率、IL-8、TNF-α的含量、Bax蛋白和mRNA表達(dá)水平均較空白對(duì)照組顯著升高，而B(niǎo)cl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平降低；抑制miR-155表達(dá)后，上述指標(biāo)均有不同程度的改善。提示miR-155表達(dá)在MI/R中促進(jìn)細(xì)胞凋亡及炎性水平；抑制miR-155表達(dá)后可降低細(xì)胞凋亡及炎性水平。

NF-κB作為一種核蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在缺血/再灌注損傷病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。miRNA可參與NF-κB的活化及功能的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)[11]，miR-21的過(guò)表達(dá)能夠有效抑制TLR4/NF-κB通路，降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平和炎性因子的釋放。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，MI/R組、陰性對(duì)照組NF-κB相關(guān)基因表達(dá)均顯著升高；與MI/R組相比，miR-155抑制劑組NF-κB相關(guān)基因均降低。提示抑制miR-155表達(dá)后可抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。

綜上，抑制miR-155表達(dá)可抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，并可降低細(xì)胞凋亡及炎性水平，從而對(duì)心肌缺血/再灌注損傷起保護(hù)作用，為臨床治療心肌缺血/再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。